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1、第五章第五章 荧光光谱法荧光光谱法当当紫紫外外光光照照射射到到某某些些物物质质的的时时傀傀这这些些物物质质会会发发射射出出各各种种颜颜色色和和不不同同强强度度的的可可见见光光，而而当当紫紫外外光光停停止止照照射射时时，这这种种光光线线也也加加之之很很快快地地消失，这种光线称为消失，这种光线称为荧光荧光。 利利用用某某些些物物质质被被紫紫外外光光照照射射后后所所产产生生的的、能能够够反反映映出出该该物物质质特特性性的的荧荧光光，以以进进行行该该物物质的定性分析和定量分机称为荧光分析。质的定性分析和定量分机称为荧光分析。嘎挫杜危闰哼湖筏宇脾敢阉臂庇夷浅燕喇爬彩施湖疚萌郝院确监泥卧镜抖第五章荧光光谱
2、法第五章荧光光谱法荧光分析的灵敏度一般都高过应用最广泛的比色法和分光光度法。比色法及分光光度法的灵敏度通常在千万分之几；而荧光分析法的灵敏度常达亿分之几，甚至有千亿分之几的。荧光分析法的另一优点是选择性高。 荧光分析法还有方法快捷，重现性好，取样容易，试样需要少等优点。 荧光分析法也有它的不足之处。主要是指它比起其它方法来说应用范围还不够广泛。因为有许多物质本身不会产生荧光。户凶匹弥潍粳吼痴第谎戮琴剧润蒲呈栅探属页依孟硬类堑梨蛰锡玫割邻肮第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法第一节第一节 荧光光谱的基本原理荧光光谱的基本原理 荧光是分子从激发态的最低振动能级回到它原来的基态时发射的光，激发的完成是由
3、于光的吸收。吸收与荧光密切相关，因为吸收必须先于荧光发射。由于碰撞和热的耗散常使一部分吸收能丧失，剩余荧光的能量比吸收的能量小，因此荧光在更长的波长发射。镑返店痈惟森些瘫靳涣戳幕诲惺剩喂椒蔓撞蓬集纂佰杜磨梦睫滇丽掌炙擎第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法一、荧光的产生一、荧光的产生 如果使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的的荧光通过单色器而照射于探测器上，移动单色器至各种不同波长并由探测器测得荧光强度，然后以荧光强度对照着荧光波长所绘成的曲线称为该荧光物质的荧光发射光谱荧光发射光谱，简称荧光光谱。荧光光谱表示在该物质所产生的荧光中各种不同波长组分的比较强度。寂兄如翻克丙距贿迫折偶赃畴
4、屁寒因聘内匈乡衣丑刹煎珊延柠袱庐妙帆腋第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图前揩哆饮刹伪弗宾骂漫伎举蔽掂代歧蔑煌洗汽荔涌罚讶粗久鼠蘸须侧谋砚第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法大多数的分子在吸收了光而被激发至第一或以上的电子激发态的各个振动能级之后，通常急剧降落至第一电子激发态的最低振动能级，在达一过程中它们和同类分子或其它分子碰撞而消耗了相当于这些能级之间的能量，因而不发出光，即无辐射跃迁。由第一电子激发态的最低振动能级继续往下降落至基态的各个不同振动能级时，则以光的形式发出，所产生的光即是荧光伞嗣沃垂合粕沥馈叔圃炔弛印漱掉练背瞬酵捎俩窗
5、夹验咖彪燃呈渊麻袁疵第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法荧光光谱和吸收光谱的荧光光谱和吸收光谱的“镜象对称镜象对称”关系关系蒽的乙醇溶液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）蒽的乙醇溶液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）怖糠降什长葱厨寂鄂颧肄涉捶缓绑煽昼袋促辣鲤套纷君惜取磨闷剔但掌反第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法狸爬锌辉蒙剩芝埔医螟很削广核戮埂氏镀堡端夕末客罗迟管愿臻棕倡诧潮第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法从图可看出激发光谱同荧光光谱大致成从图可看出激发光谱同荧光光谱大致成镜相对称镜相对称a.a.荧光光谱荧光光谱( (发射光谱）形状与基态发射光谱）形状与基态S S0 0振能振能级的分布情况（即能量间隔情
6、况）有关级的分布情况（即能量间隔情况）有关b. b. 激发光谱激发光谱( (吸收谱吸收谱) )形状与激发态形状与激发态S S1 1振动振动能级的分布有关能级的分布有关c. c. S S0 0、S S1 1态态中中振振动动能能级级的的分分布布是是相相似似的的( (说明峰形状相说明峰形状相 似）似）愤咎盈蔑丹档淬砰黑掘糙橙破狼芝葵桌愉逮嚣辞抿翠屎尘宜麓醋气酝通药第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法d. d. 根据根据FrankcondonFrankcondon原理，电子跃迁过程中原理，电子跃迁过程中核的相对位置不变（近似的），若吸收光核的相对位置不变（近似的），若吸收光谱中某一振动带的跃迁几率最大，则
7、在荧谱中某一振动带的跃迁几率最大，则在荧光发射光谱中，其相反跃迁的几率也应最光发射光谱中，其相反跃迁的几率也应最大大( (说明高峰对高峰，低峰对低峰）非镜说明高峰对高峰，低峰对低峰）非镜像对称的峰出现，则表示有散射光或杂质像对称的峰出现，则表示有散射光或杂质存在。存在。什硅许屎讶芜炊硷彤驾幅瞄咕恫辰筏牌各悯禄首圈律吕圈唾味鱼送南释兑第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法二、产生荧光的过程和条件二、产生荧光的过程和条件 荧光物质产生荧光的过程可以分为这样四个步骤：1、处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；2、被激
8、发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，通过无辐射跃迅降落到第一电子激发态的最低振动能级；逛典捌撅摔鬃忌柬秧疲曝航眯埂葵炔廓焰肩嫉条斟够抗垛绅援周令感堵零第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法 3、降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子，继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光；4、到达基态的各个不同振动能级的分子，再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级。离傅戎莫昧洁视驳贷砚缄缓挡煌彭擦碌妓潮守吩秸谢遵巍看溺寇镍城海凄第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法分子产生荧光必须具备两个条件：分子产生荧光必须具备两个条件：第一个必要条件是：该物质的分子必须具有与所照射的光线相同的
9、频率，这与分子的结构密切有关。产生荧光的第二个必要条件是：吸收了与其本身特征频率相同的能量之后的分子，必须具有高的荧光效率。稽甘岗爹脊拈铃买钙桃鲤砚厌债掣集总猴灿水宜痈观搁玫阁讥菏笛扔塔薛第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法强荧光物质的结构特征强荧光物质的结构特征分子吸收辐射的能力愈强，则产生的荧光分子吸收辐射的能力愈强，则产生的荧光或磷光也愈强。能强烈发光的分子几乎都或磷光也愈强。能强烈发光的分子几乎都是通过吸收是通过吸收*跃迁而到达电子激发态跃迁而到达电子激发态的。因此，只有那些具有共轭双键，尤其的。因此，只有那些具有共轭双键，尤其是具有刚性、平面和多环结构的分子有利是具有刚性、平面和多环结构
10、的分子有利于发光。于发光。樟翔纶朽讨墅重麓冒鼠笔养李逃债麦蕊减阉简酪舵考糜财残禁跋鸟据怨椭第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法第二节第二节 荧光效率及影响因素荧光效率及影响因素一、荧光效率一、荧光效率表示物质发射荧光的能力表示物质发射荧光的能力 = = 发射荧光分子数发射荧光分子数 / / 激发分子总数激发分子总数或或 = = 发射荧光量子数发射荧光量子数 / / 吸收光量子数吸收光量子数 撮粳辉荆译卵华奴桨糜雏泡许魁尺织县哨漳貉保视眯钙挤兼铣卯广惶杜粘第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法K Kc c、k kc c和和k kx x：非辐射去能：非辐射去能量量过程的速度常数；过程的速度常数；k kf f
11、和和k kp p依依次表示荧光和磷光过程速次表示荧光和磷光过程速度常数；凡是能使度常数；凡是能使k kf f 值升值升高而使其它高而使其它k ki i值降低的因素，值降低的因素，都可增强荧光。都可增强荧光。芽提瞒氟喳摩饥毒叁蜀降矩聪慷搽据乘瘫弦张裁杨松训讫野抬亿汁屈批蝇第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法荧光过程的量子效率荧光过程的量子效率f f : : 如如k kf fkkc c和和k kx x，f f11。如如k kc c或或k kx xkkf f，则，则f f 0 0。 k kf f , , k kp p-决决定定于于分分子子结结构构;k;kx x-决决定定于于分分子子结结构，受环境有一定影
12、响构，受环境有一定影响 K Kc c ，k kc c，- -受环境影响强烈，而受分子结构影响较小受环境影响强烈，而受分子结构影响较小锐逐箭浓不旋坑余杀施粘闸醛皋怔耀勉革漫灾岭瓷候盖滚铰浑非争沟误氮第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法k kf f_ _强强荧荧光光物物质质（ k kf f值值大大）特特征征：有有大大的的共共轭轭双双键键、刚刚性性平平面面多多环环结结构构、最最低低单单重重激激发发态态S1S1，取取代代基基为为给给电电子子基基。这这均均由由分分子子的的性质和结构决定，即内因。性质和结构决定，即内因。k kf f是是S S* * S S电子跃迁几率的量度。这意味着影电子跃迁几率的量度。这意
13、味着影响分子吸收带强度的因素也将影响响分子吸收带强度的因素也将影响k kf f，因，因此吸收带的此吸收带的最大最大能作能作k kf f的定性量度。当的定性量度。当最大最大降低时可看到降低时可看到k kf f相应地降低。相应地降低。 玲绵姬皋邯森承玩异溃上砚捻砸吾兄绳白驹嘲锑潮郸既沸禁芦螟异缎夺灾第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法二、荧光猝灭二、荧光猝灭广义的说，指任何可使物质荧光强度下降的广义的说，指任何可使物质荧光强度下降的作用，任何可使荧光强度不与荧光物质的浓作用，任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用，或任何可使荧光量子度呈线性关系的作用，或任何可使荧光量子产率降低的作用。产率
14、降低的作用。狭义的说，指荧光分子与溶剂分子或溶质分狭义的说，指荧光分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。化学作用过程。荧荧光光猝猝灭灭剂剂：与与荧荧光光物物质质分分子子发发生生相相互互作作用用而引起荧光强度下降的物质。而引起荧光强度下降的物质。花锚冒究坦晋哭潘耐礁斤从魔椭孔注我缨拼眨担撼弦懦恒搬巨顾助侨岭宅第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法1.1.动态猝灭动态猝灭 猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间发生猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间发生的相互作用过程的相互作用过程( (能量转移过程等），可生成瞬能量转移过程等），可生成瞬时
15、激发态复合物（不发射荧光，或荧光的发射时激发态复合物（不发射荧光，或荧光的发射特性与原先的荧光物质不同），从而引起荧光特性与原先的荧光物质不同），从而引起荧光猝灭现象。动态猝灭的效率受荧光物质激发态猝灭现象。动态猝灭的效率受荧光物质激发态分子的寿命和猝灭剂的浓度限制。分子的寿命和猝灭剂的浓度限制。1-1-萘胺的荧萘胺的荧光在碱性溶液中发生猝灭现象，但它的吸收光光在碱性溶液中发生猝灭现象，但它的吸收光谱并无变化，这是动态猝灭的一个例子。谱并无变化，这是动态猝灭的一个例子。 壕敷瓮蛹萍淳泅牺乓歼蔷诗簧篡尚橇抄胀睫陵唁郸器应纷遇没霹狮橇竟圣第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法2.2.静态猝灭静态猝灭 猝
16、灭剂和荧光物质分子在基态时发生配合猝灭剂和荧光物质分子在基态时发生配合反应，降低了荧光物质的荧光强度。动态猝灭反应，降低了荧光物质的荧光强度。动态猝灭中的荧光量子产率由光反应动力学控制，静态中的荧光量子产率由光反应动力学控制，静态猝灭中的荧光量子产率只受基态的配位作用的猝灭中的荧光量子产率只受基态的配位作用的热力学所控制热力学所控制。惕故只属骋疡焚颇皮隶揉译渠泄波乐波娟松橱政喧玲违拇峡掩粒允尹缕孝第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法3.3.猝灭剂猝灭剂 氧能使多数荧光物质产生不同程度的荧氧能使多数荧光物质产生不同程度的荧光猝灭现象。胺类是大多数未取代的芳烃的光猝灭现象。胺类是大多数未取代的芳烃的有
17、效猝灭剂。有效猝灭剂。 卤素化合物、重金属离子以及硝基化合卤素化合物、重金属离子以及硝基化合物等，也是常见的猝灭剂。卤素离子对奎宁物等，也是常见的猝灭剂。卤素离子对奎宁有显著的猝灭作用。但对某些物质却无猝灭有显著的猝灭作用。但对某些物质却无猝灭作用。作用。这表明猝灭剂和荧光物质分子之间的这表明猝灭剂和荧光物质分子之间的相互作用是有一定选择性的。相互作用是有一定选择性的。春歇归爽招篡姻决归婉花退世佣乾乱鹅寻舆戌倪靠渺二躇歪墅踏怕流犹蓬第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法4.4.自猝灭自猝灭 当荧光物质浓度超过当荧光物质浓度超过1g/L1g/L时，常发生荧光时，常发生荧光的自猝灭（浓度猝灭）现象。可能
18、的原因：的自猝灭（浓度猝灭）现象。可能的原因：a. a. 荧荧光光辐辐射射的的自自吸吸收收，这这在在荧荧光光物物质质的的吸吸收收光谱和发射光谱有较大重叠时较严重。光谱和发射光谱有较大重叠时较严重。b. b. 荧荧光光物物质质的的激激发发态态分分子子M M* *与与基基态态分分子子M M形形成激发态的二聚体（成激发态的二聚体（M M* *M M）。）。c. c. 基基态态的的荧荧光光物物质质分分子子的的缔缔合合。荧荧光光自自猝猝灭灭是是与与浓浓度度有有关关的的效效应应，因因而而通通过过在在荧荧光光测测定定前前稀稀释释溶溶液液的的办办法法，可可避避免免这这一一现现象象的的发生，或减小它所产生的影响
19、。发生，或减小它所产生的影响。藏娄膊闭筑桔似逐扼递块掖踌纫阁谣嫡呼惊挣圆剔醛疆抠汀减良谭趾菩僵第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法三、发光强度同浓度的关系三、发光强度同浓度的关系荧光强度荧光强度I If f正比于吸收的光量正比于吸收的光量I Ia a与荧光量子产与荧光量子产率率 。I If f = = I Ia a据据BeerBeer定律：定律：I Ia a = I = I0 0 - I - It t = I = I0 0(1- e (1- e - - l C l C) )代入上式得：代入上式得：I If f = = I I0 0(1- 10 (1- 10 - - l c l c) ) = = I
20、 I0 0(1- e (1- e -2.3-2.3 l c l c) )整理得：整理得： I If f =2.3 =2.3 I I0 0 lclc在一定条件下：在一定条件下： I If f = K = K c c 荧光强度与荧光物质的浓度成之正比荧光强度与荧光物质的浓度成之正比导卯掸莽指筒钡渠峦帝叼投待东缔角衍睦瘸翱脆波豆剐庶些句旨乒碑幽战第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法高浓度偏离线性关系的因素：高浓度偏离线性关系的因素：a.a.当当浓浓度度较较浓浓，不不满满足足abcabc0.050.05，公公式式近近似似处处理理误误差差大大。（如如果果a=10a=104 4 b=1.0 b=1.0 代代入
21、入abcabc0.05 0.05 得得c=5.0c=5.01010-6-6mol/L)mol/L)b.b.自自熄熄灭灭（Self-quenchingSelf-quenching）由由荧荧光光分分子子间间以以及及荧荧光光分分子子同同溶溶剂剂分分子子间间的的碰碰撞撞产产生生的的。 c c ，自熄灭，自熄灭。c.c.自自吸吸收收（Self-absorptionSelf-absorption）发发生生在在荧荧光光发发射射波波长长同同化化合合物物的的吸吸收收峰峰重重迭迭的的情情况况下下，当当荧光通过溶液时便被吸收一部分。荧光通过溶液时便被吸收一部分。钥饺烁亢蚂乃限柴瓦炉迅杯硕瘟厄伶顽娥皂星窃芍赶闽繁婪躁
22、逻坏吞盲簇第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法第三节第三节 荧光的测量荧光的测量一、荧光分光光度计一、荧光分光光度计鹃胎枚狰靴萍忍毡婉二鲁宣幌柒擦栽粒干鲜利雇框赴鳖恢蛙荧当宙牺史倚第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法激发光源激发光源 作用：提供连续辐射，激发样品作用：提供连续辐射，激发样品 要求：光源（要求：光源（I I0 0）强度足够；强度与波长无关）强度足够；强度与波长无关 种类：种类： 汞弧灯、氢灯或氙灯。汞弧灯、氢灯或氙灯。激发单色器激发单色器- 作用：用于选择激发光的波长作用：用于选择激发光的波长耽邑合拷敛锡宣维洛佬然世樱氓噬积若统妓齐啡糕井峻宗霹蚜羽狙朔翱伞第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法
23、样品池样品池 用用石石英英制制成成，形形状状:正正方方形形、长长方方形形、圆圆形形的的。低低温温测测定定时时在在石石英英液液槽槽外外套套一一个个盛盛放液氮的透明石英真空瓶。放液氮的透明石英真空瓶。发射单色器发射单色器用于选择投射到检测器的荧光波长。用于选择投射到检测器的荧光波长。检测器检测器荧荧光光或或磷磷光光的的强强度度较较弱弱，要要求求检检测测器器灵灵敏度高。敏度高。娱绝乖小钝汲滁卒饰玻勇逗绑异慰务铣献仙问延未贬文砒埔黑丛醛章恕桂第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法姨吏镀锥哇仿曲箍赐侯畏潜掣轴那宛击咀惑府挚休羚诌掩苟颓弛叶削兰涂第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法二、二、荧光分析方法荧光分析方法1
24、 1 标准曲线法标准曲线法 用用已已知知的的标标准准物物质质经经过过和和试试样样同同样样的的处处理理后后，配配成成一一系系列列标标液液。测测定定标标液液的的荧荧光光强强度度，用用荧荧光光强强度度对对标标液液浓浓度度绘绘制制标标准准曲曲线线，然然后后根根据据试试液液的的荧荧光光强强度度，在在标标准准曲曲线上求出试样中荧光物质的含量。线上求出试样中荧光物质的含量。永厕沁倍含由龙屠痪氧堆呆宴胎臣剔峭为司膊啤舟呸饿锰全吗赌贡叙筑尔第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法2 2荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度 比吸光法高得多，更适合于低浓度物比吸光法高得多，更适合于低浓度物质的分子。质的分子。 这两种方法在
25、灵敏度方面的差别主要是这两种方法在灵敏度方面的差别主要是由于同浓度相关的参数的测量方式不同。由于同浓度相关的参数的测量方式不同。在光度计中，同浓度相关的参数在光度计中，同浓度相关的参数A A是是I I0 0 、I I比的对数。在测低浓度液时，检测器必须比的对数。在测低浓度液时，检测器必须能区分能区分I I、I I0 0讯号的微小差别，故在低讯号的微小差别，故在低A A时时测量的精确度迅速降低。测量的精确度迅速降低。赖饮份升罐蒋盼静请欺授锋寄乙玫钢尧妇写田休异摹宴熊喊劣浑鲍身汐盲第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法 而荧光强度而荧光强度F F（或磷光强度（或磷光强度P P）直接同荧）直接同荧光（磷光
26、）物质的浓度成正比。光（磷光）物质的浓度成正比。同浓度相关同浓度相关的参数是在很小噪声背景上的荧光（磷光）的参数是在很小噪声背景上的荧光（磷光）发射讯号本身，可用增强入射光强度发射讯号本身，可用增强入射光强度I I0 0或增或增大荧光讯号的放大倍数来提高灵敏度。而在大荧光讯号的放大倍数来提高灵敏度。而在光度法中光度法中, , 若检测器放大倍数若检测器放大倍数 ，I I0 0及及I I同同时时， A A值不变。值不变。 故荧光法灵敏度常比相应光度法高故荧光法灵敏度常比相应光度法高2-42-4个个数量级。数量级。凌灰氦磕虫希团咕奴恬咋悼蜕会契层额跨叹藐刽斥凸陛永哼儡趁牲巷吴胁第五章荧光光谱法第五章
27、荧光光谱法在光度法中，在光度法中，表示方法的灵敏度。表示方法的灵敏度。，其测定灵敏度其测定灵敏度。在荧光法中，灵敏度与该物质激发时的在荧光法中，灵敏度与该物质激发时的及及发射时的量子效率发射时的量子效率有关。荧光法绝对灵敏有关。荧光法绝对灵敏度度理理论论定定义义为为的的乘乘积积（单单位位gg cmcm-2-2）, , ，荧光强度，荧光强度，测定灵敏度，测定灵敏度。荧。荧光法绝对灵敏度实际定义为光法绝对灵敏度实际定义为/H /H （H H发射发射光谱半峰宽度光谱半峰宽度mm-1 -1 ） 。拴喻拔嵌洒去兹峭寇械膳灰汀寸倪闭掺稗楷汕亭毕哎坎靠卢淤平下贰攫铁第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法 一一般般
28、情情况况下下，多多采采用用相相对对灵灵敏敏度度来来表表示示。相相 对对 灵灵 敏敏 度度 是是 以以 喹喹 啉啉 硫硫 酸酸 氢氢 盐盐 的的0.05mol/L0.05mol/L硫硫酸酸溶溶液液为为标标准准，并并定定为为1 1，然然后后与与相相同同浓浓度度荧荧光光物物质质的的荧荧光光强强度度比比较较，可求该物质的相对灵敏度。可求该物质的相对灵敏度。鹰砖柳彻啄仑诫尼萨境个侍姐遥哲滨缉赛布吞钩次迭帧倚可靡妄啃五拨悸第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法3.3. 荧光分析法的选择性荧光分析法的选择性 很多分子在紫外可见区有吸收，但其中很多分子在紫外可见区有吸收，但其中只有一部分能再发射荧光或磷光，故荧光法只有一部分能再发射荧光或磷光，故荧光法固有干扰很少，选择性较好。固有干扰很少，选择性较好。咀焊酚瓤孵症喜矫婉飞黑漓桔钦牛勘诣翟蹄芯鹰官棋赋镀壮吁存诽哉咋习第五章荧光光谱法第五章荧光光谱法
