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1、实验一实验一 细菌的染色细菌的染色尹会方2019.3.12球菌杆菌杆菌 弧菌弧菌 实验二实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色细菌的简单染色和革兰氏染色n n一、实验目的一、实验目的n n1. 学习掌握简单染色的操作技术和无菌操学习掌握简单染色的操作技术和无菌操作技术。作技术。n n2. 了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。术。n n3.了解芽孢染色机理，掌握芽孢染色的方法。了解芽孢染色机理，掌握芽孢染色的方法。二、实验原理二、实验原理-简单染色简单染色n n细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必需
2、对它们进展染色。利用单一染料对细菌进展染色，使必需对它们进展染色。利用单一染料对细菌进展染色，使经染色后的菌体与背景构成明显的色差，从而能更清楚地经染色后的菌体与背景构成明显的色差，从而能更清楚地察看到其形状和构造。此法操作简便，适用于菌体普通外察看到其形状和构造。此法操作简便，适用于菌体普通外形和细菌陈列的察看。形和细菌陈列的察看。 n n常用碱性染料进展简单染色，这是由于在中性、碱性或弱常用碱性染料进展简单染色，这是由于在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部时，其
3、分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景构成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简背景构成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培育基糖类产酸使培育基pHpH下降时，细菌所带正电荷添加，此时下降时，细菌所带正电荷添加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。二、实验原理二、实验原理-简单染色简单染色n n染色前必需固定细菌。
4、其目的有二：一是杀染色前必需固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是添加其死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是添加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形。两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形。二、实验原理二、实验原理-革兰氏染色革兰氏染色n n革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创建的，革兰氏染色法可将一切的细菌区分为革兰氏阳性菌G+和革兰氏阴性菌G-两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。n n革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细
5、胞壁的构造和组成不同决议的。 二、实验原理二、实验原理-革兰氏染色革兰氏染色n n革兰氏染色法的根本步骤是：先用初染剂结晶紫进展初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保管初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；假设细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。二、革兰氏染色机理二、革兰氏染色机理n n当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，一切细菌当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，一切细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而加
6、强了染结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而加强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处置时，两类细菌料与细菌的结合力。当用脱色剂处置时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖构成的网状构造组成，壁厚、类脂质含要由肽聚糖构成的网状构造组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇量低，用乙醇( (或丙酮或丙酮) )脱色时细胞壁脱水、使肽聚脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状构造孔径减少，透性降低，从而使结晶糖层的网状构造孔径减少，透性降低，从而使结晶紫紫- -碘的复合物不易被洗脱而保管在细胞内，经脱碘的复合物不易被洗脱而保管在细胞内，经脱色和复染后仍
7、保管初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌色和复染后仍保管初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌那么不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量那么不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处置时，类脂质被乙醇高，所以当脱色处置时，类脂质被乙醇( (或丙酮或丙酮) )溶溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫解，细胞壁透性增大，使结晶紫- -碘的复合物比较碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。染剂的红色。三、实验器材三、实验器材 n n1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌种。n n2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、盖玻片、
8、试管、水浴锅。n n3、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双层瓶香柏油和二甲苯。四、实验方法和步骤四、实验方法和步骤细菌的简单染色细菌的简单染色细菌的简单染色细菌的简单染色1 1 1 1、涂片：用、涂片：用、涂片：用、涂片：用1%1%1%1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充
9、分混匀涂成薄膜。水中，并充分混匀涂成薄膜。水中，并充分混匀涂成薄膜。水中，并充分混匀涂成薄膜。2 2 2 2、枯燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然枯燥。、枯燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然枯燥。、枯燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然枯燥。、枯燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然枯燥。3 3 3 3、固定：涂面朝上，经过微火、固定：涂面朝上，经过微火、固定：涂面朝上，经过微火、固定：涂面朝上，经过微火2-32-32-32-3次。次。次。次。4 4 4 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫、染色：待玻片泠却后加结晶紫、染色：待玻片泠却后加结晶紫、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-21-21-21-2滴于涂片
10、上，覆滴于涂片上，覆滴于涂片上，覆滴于涂片上，覆盖涂面染色盖涂面染色盖涂面染色盖涂面染色1-21-21-21-2分钟。分钟。分钟。分钟。5 5 5 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端悄然冲洗至流、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端悄然冲洗至流、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端悄然冲洗至流、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端悄然冲洗至流下的水变无色为止注：勿冲去菌体。下的水变无色为止注：勿冲去菌体。下的水变无色为止注：勿冲去菌体。下的水变无色为止注：勿冲去菌体。6 6 6 6、枯燥：自然枯燥，或用吸水纸吸干。、枯燥：自然枯燥，或用吸水纸吸干。、枯燥：自然枯燥，或用吸水纸吸干。、枯燥：自然枯燥，或用
11、吸水纸吸干。7 7 7 7、镜检：油镜察看并绘图。、镜检：油镜察看并绘图。、镜检：油镜察看并绘图。、镜检：油镜察看并绘图。四、实验步骤四、实验步骤1、菌落形状察看：2、细菌简单染色：3、细菌革兰氏染色。 留意：菌落颜色、湿度、外形、大小、透明度、颜色、边缘能否规那么等特征。染色过程：涂片枯燥固定染色1min水洗枯燥镜检本卷须知： 涂片：取菌量不能太大 枯燥：自然枯燥 水洗：水流不能直接冲在涂菌处滴加少量水滴加少量水挑取菌体挑取菌体涂片涂片枯燥枯燥固定固定染色染色水洗水洗枯燥枯燥2. 革兰氏染色革兰氏染色n n1 1、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端1/41/4
12、处下面用记号笔分别标明处下面用记号笔分别标明S S和和E E见图示，并见图示，并滴一滴蒸馏水，分别将金黄色葡萄球菌和大肠滴一滴蒸馏水，分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌涂布在相应的区域内。杆菌涂布在相应的区域内。2. 革兰氏染色革兰氏染色n n2、枯燥与固定：方法同一中2，3步骤n n3、染色：n n 结晶紫染色1-2分钟-水洗-碘液媒染1-2分钟-水洗-酒精脱色15-20秒-水洗-番红复染色2-3分钟-水洗-枯燥-镜检记录。本卷须知：n n酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，那么革兰氏阳性菌能够被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，那么革兰氏阴性菌能够被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很
13、好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，普通涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。被检菌的培育条件、培育基成分、菌龄的不同等缘由会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培育物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄普通最好在1824h之内。 染色结果染色结果金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果染色结果染色结果大肠杆菌革兰氏染色结果染色结果染色结果金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果四、实验结果四、实验结果n n绘图记录察看结果显微微镜放大倍数物放大倍数物镜放大倍数放大倍数目目镜放大倍数放大倍数 附：油镜的运用附：油镜的运用双目显微镜双目显微镜单目显微镜单目显微镜2.2.油镜的原理油镜的原理n
14、n油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线经过空气时，因油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线经过空气时，因油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线经过空气时，因油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线经过空气时，因介质折光率不同，光线将发生散射景象，使射入镜筒的介质折光率不同，光线将发生散射景象，使射入镜筒的介质折光率不同，光线将发生散射景象，使射入镜筒的介质折光率不同，光线将发生散射景象，使射入镜筒的光线很少，物象不清。假设在油镜与玻璃片之间参与与光线很少，物象不清。假设在油镜与玻璃片之间参与与光线很少，物象不清。假设在油镜与玻璃片之间参与与光线很少，物象不清。假设在油镜与玻璃片之间参与与玻璃折射率相近的香柏油
15、，那么使经过的光线不至因折玻璃折射率相近的香柏油，那么使经过的光线不至因折玻璃折射率相近的香柏油，那么使经过的光线不至因折玻璃折射率相近的香柏油，那么使经过的光线不至因折射而减弱，因此能清楚地看到物象。射而减弱，因此能清楚地看到物象。射而减弱，因此能清楚地看到物象。射而减弱，因此能清楚地看到物象。芽孢染色原理芽孢染色原理n n用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保管初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。 芽孢染色步骤
16、芽孢染色步骤1 1 1 1将培育将培育将培育将培育24242424小小小小时时左右的枯草芽左右的枯草芽左右的枯草芽左右的枯草芽孢孢杆菌或其他芽杆菌或其他芽杆菌或其他芽杆菌或其他芽孢孢杆杆杆杆菌，作涂片、枯燥、固定。菌，作涂片、枯燥、固定。菌，作涂片、枯燥、固定。菌，作涂片、枯燥、固定。 2 2 2 2滴加滴加滴加滴加35353535滴孔雀滴孔雀滴孔雀滴孔雀绿绿染液于已固定的涂片上。染液于已固定的涂片上。染液于已固定的涂片上。染液于已固定的涂片上。 3 3 3 3用木用木用木用木夹夹夹夹住住住住载载玻片在火焰上加玻片在火焰上加玻片在火焰上加玻片在火焰上加热热，使染液冒蒸汽，使染液冒蒸汽，使染液冒
17、蒸汽，使染液冒蒸汽但勿沸但勿沸但勿沸但勿沸腾腾，切忌使染液蒸干，必要，切忌使染液蒸干，必要，切忌使染液蒸干，必要，切忌使染液蒸干，必要时时可添加少可添加少可添加少可添加少许许染液。染液。染液。染液。加加加加热时间热时间从染液冒蒸汽从染液冒蒸汽从染液冒蒸汽从染液冒蒸汽时时开开开开场计场计算算算算约约45454545分分分分钟钟。4 4 4 4倾倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿绿不再褪色不再褪色不再褪色不再褪色为为止。止。止。止。 5 5 5 5用番用番用番用番红红水溶液复染水溶液复染水溶液复染水溶液复染1
18、 1 1 1分分分分钟钟，水洗至水，水洗至水，水洗至水，水洗至水为为无色。无色。无色。无色。 6 6 6 6待枯燥后，置油待枯燥后，置油待枯燥后，置油待枯燥后，置油镜镜察看，芽察看，芽察看，芽察看，芽孢孢呈呈呈呈绿绿色，菌体呈色，菌体呈色，菌体呈色，菌体呈红红色。色。色。色。 本卷须知：本卷须知：1选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未构成芽孢，而老龄菌芽孢囊曾经破裂。 2加热染色时必需维持在染液冒蒸汽的形状，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够那么芽孢难以着色。 附：革兰染色液配方附：革兰染色液配方n n1 1草酸铵结晶紫染液草酸铵结晶紫染液n nA A液：结晶紫液：结晶紫(crystal vi
19、olet)2g 95%(crystal violet)2g 95%酒精酒精 20ml 20ml n nB B液：草酸铵液：草酸铵(ammonium oxalate)0.8g (ammonium oxalate)0.8g 蒸馏水蒸馏水 80m 80m 混合混合A A、B B二液，静置二液，静置4848小时后运用。小时后运用。 n n2 2卢戈氏卢戈氏(Lugol)(Lugol)碘液碘液n n碘片碘片 1 10g 0g 碘化钾碘化钾 2 20g 0g 蒸馏水蒸馏水 300ml 300mln n先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。待碘全溶后，加足水分即成。 n n3. 95%3. 95%的酒精的酒精n n4.4.番红复染液番红复染液n n 沙黄沙黄 0.25g 95% 0.25g 95%的酒精的酒精 10ml 10ml n n 蒸馏水蒸馏水 90ml 90ml 将沙黄溶于乙醇中，再用蒸馏水稀释。将沙黄溶于乙醇中，再用蒸馏水稀释。思索题思索题n n1、在制造涂片中，为什么要进展固定这一步？n n2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？n n3、芽孢染色要本卷须知？
