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1、第二章第二章基因工程工具酶基因工程工具酶自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反响中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别本人和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研讨掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。 基因工程的工具酶instrumental enzyme of gene engineering是运用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标志探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需求的酶类。第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 在限制修饰系统中，限制造用
2、是指一定类型的细菌可以经过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵遭到限制； 而生物细胞(如宿主)本身DNA分子经过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭本身限制性内切酶的破坏。 限制修饰作用实践就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA ，维护本身遗传稳定的维护机制。 限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶限限制制酶酶：在在细细胞胞内内可可以以识识别别双双链链DNA分分子子中中的的特特定定核核苷苷酸序列，并对酸序列，并对DNA分子进展切割的一种酶。分子进展切割的一种酶。 功功能能：降降解解不不同同源源DNA，而而不不降降解解同同源源
3、DNA。 基基因因工工程程所所用用的的限限制制性性内内切切酶酶可可从从消消费费厂厂家家购购买买，如如NEB, Fermentas, SibEnzyme。国内市场上常用的是国内市场上常用的是TaKaRa。一、限制性内切酶的命名和种类一、限制性内切酶的命名和种类命名：以微生物属名第一个字母和种命名：以微生物属名第一个字母和种名前两个字母命名，后面加菌株代号的名前两个字母命名，后面加菌株代号的一个字母。假设从同一菌株分别到多种一个字母。假设从同一菌株分别到多种酶，那么依次用罗马数字酶，那么依次用罗马数字I、II、III、IV来表示。来表示。前三个字母用斜体，其他字母用正前三个字母用斜体，其他字母用正
4、体。体。同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d株株属名属名 种名种名 株名株名限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名H i n d H i n d 特性型型型限制和修饰活性单一功能单一功能双功能识别与切割位点分别，随机切割，相距较远同一位点相距5-10bp在基因工程中意义无用非常有用意义不大限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型主要特性I 型 IIII型型型型 III 型限制修饰多功能单功能单功能单功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚
5、体同源二聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP Mg2+ SAMMgMg2+2+ATP Mg2+ SAM识别序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋转对称序列旋转对称序列旋转对称序列旋转对称序列GAGCCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处随机性切割识别序列内或附近识别序列内或附近识别序列内或附近识别序列内或附近特异性切割特异性切割特异性切割特异性切割距识别序列下游24-26bp处二、限制性内切二、限制性内切酶作用机制作用机制限制性内切限制性内切酶以双以双链DNA为底物，底物，识别特定的核苷酸序列，切断特定位置的磷特定的核苷酸序列，切断特定位置的磷酸二酸二酯链，产生具有生具有3-
6、OH和和5-P的的DNA片片段。段。限制性内切酶作用过程点点击击播放播放三、限制性内切三、限制性内切酶的的识别序列序列限制性内切限制性内切酶在双在双链DNA上上识别的特殊的特殊核苷酸序列称核苷酸序列称为识别序列。序列。绝大多数的大多数的型限制性核酸内切型限制性核酸内切酶都可都可以以识别由由48个核苷酸个核苷酸组成的特定的核苷酸成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切序列。限制性核酸内切酶就是从其就是从其识别序序列内切割列内切割DNA分子的，因此分子的，因此这些些识别序列序列又叫核酸内切又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。的切割位点或靶序列。实际上，某限制性内切上，某限制性内切酶的的识别序列序列长度度
7、为n个核苷酸，那么个核苷酸，那么该酶切割切割DNA的的频率率为1/4n，也就是，也就是说DNA每隔每隔4n个核苷酸便个核苷酸便会出会出现一次一次该酶的的识别序列。序列。识别序列序列识别序列有延续的如GATC和延续的(如GANTC)两种，它们都呈回文构造。A B C C B AA B C C B AA B N B AA B N B AA B B AA B B A或或回文构造palindrome：序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。四、限制性内切四、限制性内切酶切割切割D
8、NA的位点的位点限制性内切限制性内切酶切断切断DNA链上磷酸二上磷酸二酯键的位的位置普通在置普通在识别序列内部，如序列内部，如GGATCC,ATCGAT;也有少数在也有少数在识别序列的两端序列的两端,如如GATC,CATG。环状状DNA分子上，假分子上，假设某种限制性内切某种限制性内切酶有有n个个识别序列，那么完全切割后可序列，那么完全切割后可获得得n个片段。个片段。线状状DNA分子，假分子，假设某种限制性内切某种限制性内切酶有有n个个识别序列，那么完全切割后可序列，那么完全切割后可获得得n+1个片段。个片段。几种几种IIII型限制性核酸内切酶的酶切位点型限制性核酸内切酶的酶切位点Pst IP
9、rovindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd EcoR IPst I5 C T G C A G33 G A C G T C .5不同核酸内切酶的特异识别位点5 G A A T T C 33 C T T A A G 5A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A DNAABCDDNAHindHind切割位点切割位点核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用 限制性核酸内切酶的切割类型：1两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴陈列，这种方式的断裂结果构成具有粘末端
10、的DNA片段；2两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样方式的断裂是构成具有平末端的DNA片段。三种三种酶切末端切末端平平齐末端如末端如Sma、Alu、Hae 5-GG CC-3 3-CC GG-5 5-GG- -CC-3 3-CC- -GG-55粘性末端如粘性末端如EcoR 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 5-G- -AATTC-3 3-CTTAA- -G-53粘性末端如粘性末端如Pst同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶 同裂酶isoschizomers ：来源不同的限制酶识别一样的核苷酸靶序列。产生同样的切割，构成同样的末端。 如：Hpa和Msp均可切割CCGG。 当胞嘧啶甲基
11、化后， Msp不能再切割。 同尾酶isocaudamers ：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不一样，但切割后DNA分子产生的粘性末端一样的限制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一组同尾酶。 留意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新衔接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新衔接构成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。例如例如Hpa和和Msp是同裂是同裂酶，识别顺序都是序都是5CCGG33GGCC5假假设其中有其中有5-甲基胞甲基胞嘧啶，Hpa不可以切割，不可以切割，MspI能切割。能切割。经同尾酶消化的经同尾酶消化的DNA末端衔接表示图末端衔接表示图5 X
12、XXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5BamH I5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5Bgl II5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 55 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX 5BamH IBgl II五、限制性内切酶反响系统五、限制性内切酶反响系统一底物一底
13、物DNA1.DNA纯度纯度含有蛋白质、醇等杂质降低酶活性；含有蛋白质、醇等杂质降低酶活性；2.DNA分子构型分子构型切割线状切割线状DNA的效率高于切割超螺的效率高于切割超螺旋旋DNA。3.识别序列的旁邻序列识别序列的旁邻序列 限制性内切酶不会切割仅含有识别序列的寡限制性内切酶不会切割仅含有识别序列的寡核苷酸时，识别序列两端必需求有假设干个核苷核苷酸时，识别序列两端必需求有假设干个核苷酸才干切割。酸才干切割。4.位点偏爱位点偏爱site preference 某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。与识别序列两侧的核列表现出不同的
14、切割效率。与识别序列两侧的核苷酸序列有关。苷酸序列有关。5.DNA甲基化甲基化 DNA过大，抑制酶活，影响酶分子分散 如：4g DNA/1U Hpa 50l 37 15h 1g DNA/1U Hpa 50l 37 1h(二二)限制性内切限制性内切酶的用量的用量50LBuffer中，含中，含1g底物底物DNA，于最适反响条件和温度下，保温于最适反响条件和温度下，保温1小小时，能，能使使1gDNA完全降解所需的完全降解所需的酶蛋白量即蛋白量即为一个一个酶单位，用位，用U表示。表示。bufferpH=8.0：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或或巯基乙醇基
15、乙醇100gBSA/mlDDT：二硫：二硫苏糖醇糖醇BSA：牛血清蛋白：牛血清蛋白)DNA浓度高，那么度高，那么酶的用量高；的用量高；识别序列出序列出现的的频率高，率高，酶的用量也要高。的用量也要高。(三三)限制性内切限制性内切酶反响反响缓冲液冲液消消费厂家提供限制性内切厂家提供限制性内切酶时，包装中，包装中会附会附赠该酶的最适的最适10反响反响缓冲液。冲液。有些有些酶可在几种可在几种缓冲液中冲液中发扬最大活性，最大活性，有些有些酶必需求在必需求在该酶特定的特定的缓冲液中才干冲液中才干发扬最大活性。有些最大活性。有些酶在某些在某些缓冲液中会冲液中会出出现星号活性。星号活性。消消费厂家的目厂家的目录中会提供不同中会提供不同缓冲液中冲液中酶活力的活力的详细信息。信息。(四四)限制性内切限制性内切酶反响温度反响温度大多数大多数酶的最正确反响温度的最正确反响温度为37C，也，也有的高于或低于此温度。有的高于或低于此温度。酶酶 切切 反反 应应 的的 基基 本本 步步 骤骤电泳紫外分析37 1h加反响液CKMBuffer (10) 2.0 LddH2O 约16.5 LDNA 0.21.0 gEnzyme 12UVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT
