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1、器材预备器材预备斜面培育物斜面培育物4 4支，营养肉汤支，营养肉汤4 4支，生理盐水支，生理盐水2 2支，支，镜油瓶、拭镜纸镜油瓶、拭镜纸1 1套，吸水纸套，吸水纸1 1本，载玻片本，载玻片4 4张。张。染色瓶染色瓶6 6组，染色架组，染色架8 8个。个。医学微生物学实验综合性实验一v脓汁和粪便标本中病原菌的检测四v斜面培育物的察看v革兰染色法v肉汤接种法v显微镜油镜的运用斜面培育物的察看v分别从斜面的正面和反面察看。v从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。v从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔曾经没有原来菌落的颜色。菌苔灰
2、白色、外表潮湿、光滑、不透明紫黑或半透明粉红。v为了讲解方便，以后的实验，依然沿用初次分别得到菌落的颜色，紫黑色或粉红色。v从斜面上取菌时，不论是涂片，还是接种，每次只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在培育基外表悄然刮一下即可。 细菌染色法细菌染色法v单染色法：只用一种染料染色，如美蓝或复单染色法：只用一种染料染色，如美蓝或复红，能清楚察看菌体大小、形状与陈列，不红，能清楚察看菌体大小、形状与陈列，不能鉴别细菌。能鉴别细菌。v复染色法鉴别染色：采用两种或两种以复染色法鉴别染色：采用两种或两种以上的不同染料进展先后染色，可将细菌染成上的不同染料进展先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别
3、细菌。不同的颜色，以便鉴别细菌。v抗酸染色抗酸染色: :用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸性细菌，阳性者为红色。杆菌等抗酸性细菌，阳性者为红色。v特殊染色：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，特殊染色：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，极体染色用于白喉杆菌异染颗粒染色。极体染色用于白喉杆菌异染颗粒染色。结核分枝杆菌结核分枝杆菌抗酸染色抗酸染色麻风分枝杆菌麻风分枝杆菌抗酸染色抗酸染色产气荚膜梭菌荚膜产气荚膜梭菌荚膜Hiss Hiss 染色染色破伤风梭菌芽胞破伤风梭菌芽胞芽胞染色芽胞染色变形杆菌鞭毛变形杆菌鞭毛LeifsonLeifson染色染色 白喉棒状杆菌异染颗粒白喉
4、棒状杆菌异染颗粒AlbertAlbert染色染色革兰染色法革兰染色法 Gram Staining Gram Staining 革兰染色法是丹麦内科医生革兰染色法是丹麦内科医生 Christain Christain GramGram于于18841884年创建的一种细菌染色方法，已有年创建的一种细菌染色方法，已有120120多年的历史，仍在广泛运用，是细菌学中最为经多年的历史，仍在广泛运用，是细菌学中最为经典的染色法。典的染色法。革兰染色法原理的三种学说革兰染色法原理的三种学说v通透性学通透性学说：G+G+菌菌细胞壁构造比胞壁构造比较致密，致密，肽聚糖聚糖层厚，厚，脂脂质含量少，酒精不易透入，反
5、而可使含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而胞壁脱水而构成一道屏障，阻止染料向构成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。胞外渗。G-G-菌菌细胞壁比胞壁比较疏松，疏松，肽聚糖聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂含有大量脂质，易被酒精溶解，致使，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增胞壁通透性增高，高，细胞内的胞内的结晶紫晶紫碘复合物容易被酒精脱出。碘复合物容易被酒精脱出。v等等电学学说：G+G+菌等菌等电点点(pH2(pH23)3)比比G-G-菌菌(pH4(pH45)5)低，低，普通染色普通染色时染液的酸碱度在染液的酸碱度在pH7.0pH7.0左右，左右，电离后阳
6、性菌离后阳性菌带的的负电荷比阴性菌多，因此与荷比阴性菌多，因此与带正正电荷的荷的结晶紫染晶紫染料料结合合结实，不易脱色。，不易脱色。v化学学化学学说：G+G+菌菌细胞内含有某种特殊化学成分，普通胞内含有某种特殊化学成分，普通以以为是核糖核酸是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料与多糖的复合物，它与染料媒媒染染剂复合物复合物结合，使已着色的合，使已着色的细菌不易脱色。菌不易脱色。 革革兰染色的意染色的意义鉴别细菌：把菌：把细菌分成菌分成G+和和G-两大两大类。选择抗菌抗菌药物：物：G+球菌球菌对青霉素敏感青霉素敏感,G-杆菌耐杆菌耐药。了解了解细菌的致病机理：菌的致病机理：G+菌大多菌大多产生外
7、毒素生外毒素,G-菌菌产生内毒素。生内毒素。革革兰染色的步染色的步骤 涂片涂片 枯燥枯燥 固定固定 染色染色接种环取生理盐水34ul，2滴。菌苔少许1mm小菌落的半量与盐水混匀，涂成1cm2。涂毕环移至涂膜中央侧立，环内菌膜破裂，接种环灭菌。涂片的制备涂片的制备甲黄色，紫黑。乙黄色，紫黑。丙白色，粉红。丁白色，粉红。涂片涂片涂片枯燥固定革兰染色方法步骤革兰染色方法步骤涂片涂片 枯燥枯燥 固定固定 结晶紫晶紫 初染初染1 1分分钟水洗水洗 卢戈碘液戈碘液媒染媒染1 1分分钟水洗水洗 9595乙醇乙醇脱色脱色约2020秒秒钟水洗水洗 稀稀释复复红复染复染1 1分分钟水洗水洗 吸干吸干, ,镜检。取
8、菌适量取菌适量, ,涂片均匀涂片均匀, ,水洗水洗轻缓, ,脱色适当。脱色适当。影响革影响革兰染色的关染色的关键是涂片太厚和脱色。是涂片太厚和脱色。革兰阳性菌革兰阳性菌 革兰阴性菌革兰阴性菌G+G+链球菌链球菌G-G-双球双球菌菌G+G+杆菌杆菌G+G+短杆菌短杆菌G-G-弧菌弧菌G-G-螺菌螺菌甲黄色, 乙白色, 丙紫黑, 丁粉红。标志：组号，颜色36培育4小时45108cfu/ml液体培育基接种液体培育基接种 Broth Transfer Broth Transfer 悬浮法浮法 Suspending Method Suspending Method细菌在液体培育基的生菌在液体培育基的生长
9、情况情况v均匀浑浊：例如金黄色葡萄球菌均匀浑浊：例如金黄色葡萄球菌, 大肠杆菌。大肠杆菌。v外表生长构成菌膜：例如枯草杆菌。外表生长构成菌膜：例如枯草杆菌。v沉淀生长：例如链球菌。沉淀生长：例如链球菌。生物平安警告v本次实验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。v气溶胶粒径100um沉降很快,50um在0.4s内分散开,5um经过呼吸道直接到达肺泡。vPike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明缘由的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中分散引起的。v实验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，坚持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。100倍浸油物镜运用方法v油镜放入光路之前
10、，一定要在标本的察看部位上加一滴浸油。v旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。v假设浸油内有气泡，会影响察看，可略微旋转物镜转盘，使油镜来回经过12次浸油，排除油内气泡。香柏油折射率香柏油折射率n=1.515n=1.515空气折射率空气折射率n=1.00n=1.00玻片折射率玻片折射率n=1.52n=1.52油浸镜的原理光线光线 滴加香柏油可使滴加香柏油可使光光线更多更多进入物入物镜,防防止光止光线经过折射率低折射率低的空气而散失的空气而散失,以提高以提高物物镜的分辨率的分辨率,使物象使物象亮堂明晰。亮堂明晰。 放大倍数：目放大倍数：目镜10倍倍物物镜90或或100倍倍显微镜油镜的
11、运用P13v10物镜标本位置滴加香柏油100油镜浸泡油中,几乎与标本接触任务间隔0.13mm细调理调焦，察看物像记录结果封锁电源。v油镜处置：擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚7:3混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。v显微镜罩上防尘罩 横放在实验柜内。v(顺德校区实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离他最近的电源插座。v校本部实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能运用，只能用两侧的插座。 v革兰染色法P15v 甲黄色，紫黑 乙黄色，紫黑v 丙白色，粉红 丁白色，粉红v肉汤接种法P10 v 甲黄色 乙白色 v 丙紫黑 丁粉红v油镜的运用P13 v 10物镜标本位置滴加香柏油1
12、00油镜浸泡油中,几乎与标本接触任务间隔0.13mm细调理调焦，察看物像记录结果封锁电源 擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚7:3混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。思索题v革兰染色法的关键步骤是什么?为什么?v染色时为什么通常要用新颖的细菌培育物? v如何运用油镜?实验小结实验小结用普通平板，从浓汁标本中分别得到黄色、用普通平板，从浓汁标本中分别得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为镜下均为G+球菌，陈列不规那么，呈葡球菌，陈列不规那么，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌能够是金黄色葡色素，
13、这两株葡萄球菌能够是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。萄球菌和白色葡萄球菌。电镜油镜葡萄葡萄球菌三个种的鉴别葡萄球菌三个种的鉴别试验金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌血浆凝固酶+-甘露醇发酵+-新生霉素敏感性SSRA蛋白+-注：敏感（Sensitive S）, 耐药（Resistant R）。用伊红美蓝平板,从粪便标本分别、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，均为G-杆菌，散在陈列，从形状上不能鉴别是什么细菌。电镜油镜常用器材常用器材摆放放顺序：序：电源插座源插座试管架管架酒精灯酒精灯污物物盘。试管架上器材：接近插座一管架上器材：接近插座一侧第第1和第和第2列分列分别放置接种放置接种针和接种和接种环，另一，另一侧中中间两行放置油性笔和打火机。两行放置油性笔和打火机。器材运用后，必需放回原器材运用后，必需放回原处，依次，依次摆整整齐。实验器材实验器材 整齐有序整齐有序革兰染色瓶革兰染色瓶染色架染色架石蜡油石蜡油拭镜纸拭镜纸吸吸水水纸乙乙醇醇乙乙醚微生物学器材柜微生物学器材柜-1-1边台西侧中段边台西侧中段革革兰染色器材染色器材 拾掇入柜拾掇入柜 依次依次摆整整齐
