《常见的生化与分子生物学技术PPT课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《常见的生化与分子生物学技术PPT课件（135页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、常见的生化与分子生物学技术常见的生化与分子生物学技术生物大分子的提取和纯化生物大分子的提取和纯化电泳技术电泳技术PCR技术技术核酸序列的测定核酸序列的测定蛋白质相互作用蛋白质相互作用AgrosePAGE双向电泳 杂交技术酶联免疫技术层析技术、超滤技术、膜技术层析技术、超滤技术、膜技术 检测和纯化检测和纯化分离生命现象生化组分分析1、结构与性质2、功能3、代谢及其细胞调控改造利用生物化学研究技术方法v经典的研究步骤：分离生化组分（细胞器和生物分子）；分析生化组分的结构；分析生化组分的功能和代谢（合成与分解）及其相互作用。2024/9/43生物化学研究技术方法l生物化学研究技术：分离技术：沉淀、吸
2、附、膜分离（过滤、透析等）、离心、层析、电泳等；分析检测技术：电泳、层析、光谱、质谱、电化学技术、分子标记等。分子生物学研究技术：基因重组、分子杂交、PCR与反转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。2024/9/44生物大分子生物大分子分离纯化分离纯化的一般步骤和原则的一般步骤和原则层析法层析法 电泳法电泳法 超离心法超离心法 透析和透析和超滤超滤盐析（盐析（硫酸铵盐析硫酸铵盐析）等点电沉淀等点电沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀离心离心前处理前处理 粗分级粗分级 细分级细分级 材料选择与处理材料选择与处理细胞破碎（机械破细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）酶解、化学处
3、理）生物组织生物组织 提取液提取液 粗产品粗产品结晶结晶分子大小分子大小溶解度溶解度电荷性质电荷性质吸附性质吸附性质生物亲和力生物亲和力依据原理依据原理要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：p 在水和各种有机溶剂中的溶解性。p 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。p固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。p各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。p其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。p对其他生物分子的特殊亲和力。分离纯化的一般程序分离纯化的一般程序1、材料的选择
4、和预处理、材料的选择和预处理 2、破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器、破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）的分离） 3、分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离、分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。理。生物大分子的浓缩p沉淀法沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。p盐析法：盐析法：有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉
5、淀法等 。 p 吸附法吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。p 超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。p 透析浓缩法p 减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。p 冰冻干燥法纯度鉴定纯度鉴定l生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。度。l蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超
6、速离心沉降分析法等。心沉降分析法等。l纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。l选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用的纯度，必须同时采用2-32-3种不同的方法才能确定。种不同的方法才能确定。蛋白质、核酸的定性定量检测蛋白质、核酸的定性定量检测1、蛋白质的测定、蛋白质的测定 凯氏定氮法（凯氏定氮法（含含N量量
7、6. 25） 双缩脲法、双缩脲法、Folin-酚法酚法 紫外光度法（紫外光度法（ max=280nm） 离心法、电泳法、层析法离心法、电泳法、层析法2、酶活力的测定酶活力的测定 终点法、动力学法终点法、动力学法3、氨基酸的测定、氨基酸的测定 茚三酮法茚三酮法 Sangerf法、法、Edmam法、法、DNS法法4、核酸的测定、核酸的测定 紫外光度法（紫外光度法（ max=260nm） 分子杂交法分子杂交法 离心法、电泳法离心法、电泳法l核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A
8、280A260/A280）等方法。等方法。v同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-32-3种方种方法才能确定。法才能确定。电泳基本原理l电电泳泳是是不不同同的的物物质质颗颗粒粒在在一一定定的的电电场场强强度度下下，由由于于所所带带电电荷荷及及颗颗粒粒大大小小形形状状等等不不同同，因因此此向向相相反反电电极极泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。l在在一一定定pH条条件件下下，每每一一种种分分子子都都具具有有特特定定的的电电荷荷（种种类类和和数数量量）、大大小小和和形形状状，在在一一定定时时间间内内它它们们在在相相同同电
9、电场场中中泳泳动动速速度度不不同同，各各自自集集中中到到特特定定的的位位置置上上而而形形成成紧紧密密的的泳泳动动带带。这这就就是是带带电电粒粒子子可可以以用用电泳技术进行分离、分析和鉴定的电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理基本原理。电泳带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷大小、形状、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在的差异，使得带电分子的“泳动”速度不同，因而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定或纯化。电泳技术有多种方式，但一般根据有无支持物将其分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支
10、持物的纸电泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳，以及与凝胶（例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶）为支持物的凝胶电泳。等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、二维电泳、脉冲场凝胶电泳。l影响泳动度的因素：影响泳动度的因素：1. 电场强度：l电电场场强强度度是是指指每每厘厘米米的的电电位位降降，也也称称电电位位梯梯度度(电电势势梯梯度度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。2. 溶液溶液pHl为为使使电电泳泳时时pH值值恒恒定定，必必须须采采用用缓缓冲冲液液作作为为电电极极液液，溶溶液液的的pH值值决决定定带带电电颗颗粒粒的的解解离离程程度度，亦亦即即决决定定其
11、其所所带带电电荷荷的的多少。多少。3.离子强度（离子强度（I） 溶溶液液的的I 越越高高，质质点点的的泳泳动动速速度度越越慢慢，但但区区带带分分离离度度却却较较清清晰。晰。4. 电渗电渗l电电泳泳缓缓冲冲液液相相对对于于固固体体支支持持物物的的移移动动称称电电渗渗。如如纸纸电电泳泳时时，滤滤纸纸吸吸附附OH-OH-离离子子带带负负电电荷荷，与与纸纸接接触触的的缓缓冲冲液液带带正正电电荷荷向向负负极极移移动动，会会对对颗颗粒粒的的移移动动造造成成不不良良影影响响，故电泳时，电渗小些为好故电泳时，电渗小些为好5. 温度温度 电电泳泳时时会会产产生生焦焦耳耳热热，使使介介质质粘粘度度下下降降，分分子
12、子运运动动加加快快，迁迁移移率率增增加加，同同时时温温度度过过高高会会使使样样品品中中的的生生物物大大分分子子变变性性失失活活，因因此此电电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。6.支持物支持物|现现代代电电泳泳多多在在固固体体支支持持物物上上进进行行，使使样样品品中中的的不不同同组组分分形形成成不不同同的的区区带带，称称区区带带电电泳泳。电电泳泳结结束束后后，支支持持物物可可以以方方便便地地进进行行染染色色等后续处理。等后续处理。电泳技术分类|按电泳的原理来分，可分为四种：区区带带电电泳泳：电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系中分
13、离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。移移界界电电泳泳：是Tiselius最早建立的电泳，它是在U 形管中进行的，由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。等等速速电电泳泳：需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各组分的区带相随并形成清晰的界面，并以等速移动。等等电电聚聚焦焦：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点pH处聚集成很窄的区带，且分辨率较高。（表面看与区带电泳相似，但原理不同）DNA的琼脂糖凝胶电泳：l琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳对对核核酸酸的的分分离离作作用用主主要要依依据据它它们们的的相相对对分分子子质量及分子构型质量及分子构型，同时
14、与，同时与凝胶的浓度凝胶的浓度也有密切关系。也有密切关系。l核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系lDNA分子的大小：l在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。l但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。l琼脂糖的浓度：不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 2. 琼脂糖凝胶电泳l核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂
15、糖凝胶电泳分离的关系F不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA（cccDNA）直线DNA开环的双链环状DNAF当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rf = 0），而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进（Rf0），由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。 聚丙烯酰胺凝胶电泳l聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶是是由由单单体体丙丙烯烯酰酰胺胺（简简称称Acr）和和交交联联剂剂N，N-甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺（简简称称Bis）在在加加速速剂剂和和催催化化剂剂的的作作用用下下聚聚合合
16、并并联联成成三三维维网网状状结结构构的的凝凝胶胶，以以此此凝凝胶胶为为支支持持物物的的电电泳泳称称为为聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶电泳胶电泳（简称（简称PAGE）。）。l聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。对对pH和温度变化较稳定。和温度变化较稳定。几几乎乎无无电电渗渗作作用用，只只要要Acr纯纯度度高高，操操作作条条件件一一致致，则则样样品分离重复性好。品分离重复性好。样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达样品不易
17、扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。分分辨辨率率高高，尤尤其其在在不不连连续续凝凝胶胶电电泳泳中中，集集浓浓缩缩、分分子子筛筛和和电电荷荷效效应应为为一一体体，因因而而较较醋醋酸酸 纤纤维维薄薄膜膜电电泳泳、琼琼脂脂糖糖电电泳等有更高的分辨率。泳等有更高的分辨率。l聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：p分离范围不同分离范围不同 琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。p凝胶配置程序不同凝胶配置程序不同l
18、琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。p凝胶的厚度不同凝胶的厚度不同l琼脂糖凝胶最薄只能达到；聚丙烯酰胺凝胶可以制成.，分辨率高。p成本不同成本不同。琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高p安全性不同安全性不同。琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性l凝胶聚合的原理及有关特性凝胶聚合的原理及有关特性催化系统常用有两种：催化系统常用有两种：l过硫酸氨过硫酸氨TEMED化学催化聚合系统化学催化聚合系统此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入
19、，可使过硫酸氨（APS，引发剂）形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。l核黄素核黄素TEMED光聚合催化系统光聚合催化系统此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。凝胶聚合的原理及有关特性影响凝胶聚合的因素AP、核黄素、TEMED：是是凝凝胶胶聚聚合合不不可可缺缺少少的的试试剂剂，AP应应在在干干燥燥、避避光光的的条条件件下下保保存存，其其水水溶溶液液应应置置棕棕色色瓶瓶中中，4冰冰箱箱贮贮存存，一一般般仅仅能能存存放放
20、一一周周。TEMED（液液状状）应应密密闭闭贮贮于于4冰冰箱箱中中。增增加加AP和和TEMED可可加加快快聚聚合合速速率率，但但过过量量的的AP和和TEMED会会引引起起电电泳泳时烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在时烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。内完成。pH：碱碱性性条条件件下下聚聚合合快快，但但碱碱性性过过强强时时胶胶硬硬而而脆脆，需需高高pH时时应应减减少少AP和和TEMED用量，制酸性胶可加用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。等促进聚合。温度：温温度度高高聚聚合合快快，但但高高浓浓度度凝凝胶胶聚聚合合时时易易产产生生小小气气泡泡，低低温温(5)
21、聚合凝胶会变得脆聚合凝胶会变得脆 而混浊，一般而混浊，一般25-35聚合较好。聚合较好。氧分子：氧氧分分子子阻阻碍碍凝凝胶胶聚聚合合，故故不不含含SDS的的凝凝胶胶最最好好先先抽抽真真空空脱脱气，再加引发剂。气，再加引发剂。 PAGE原理lPAGE据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，分分为为连连续续系系统统与与不不连连续续系系统统两两大大类。类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；不连续系统电泳体系中由于缓缓冲冲液液离离子子成成分分、pH、凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电电荷效应荷效应、
22、分子筛效应分子筛效应，还具有浓缩效应浓缩效应，故分离效果更好。l不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。所谓所谓变性凝胶变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如即在凝胶中加入变性剂，如尿素、尿素、SDS(十二烷基磺酸十二烷基磺酸钠钠)、巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚
23、基。同时在蛋白质分子周围包把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。任何电荷。l由于由于SDSSDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用MrMr
24、差异将各种蛋白质分开。差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入在蛋白质溶解液中，加入SDSSDS和疏基乙醇，巯和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。膜分离基本技术 膜分离与常规的分离技术相比膜分离与常规的分离技术相比具有无相变化、能耗低、过程简单、不污染环境等优点特别适用于生物物质、酶制剂及同分异构体等的分离。2024/9/427膜纵切面模式图膜纵切面模式图以分离应用领域过程分类微滤(micro-filtration, MF)超滤(untra-filtration, UF)反渗透(reverse o
25、smosis, RO)透析(Dialysis, DS)电透析(electro-dialysis, ED)纳米膜分离(NF)亲和过滤(affinity filtration, AF)渗透气化(pervaporation, PV 膜分离基本技术膜膜分分离离过过程程的的推推动动力力是是静静压压差差、浓浓度度差差或或者者电电位位差差，有的分离过程可能是几种推动力都兼而有之。有的分离过程可能是几种推动力都兼而有之。膜在分离过程中有三种功能：膜在分离过程中有三种功能：物质的识别与透过，这是使混合物各组分之间实现分离的内在因素界面作用，以膜为界面将透过液和保留液分为互不混合的两相反应场作用，膜表面及孔内表面
26、含有与特性溶质有相互作用能力的官能团，通过物理作用、化学反应或生化反应提高膜分离的选择性和分离速度。2024/9/4生命科学学院生命科学学院292024/9/429生命科学学院生命科学学院分离膜分离膜应具备的基本条件为：好的选择透过性；良好的分离性能（即截留率高，透过率大）；理化性能良好；污染小，使用寿命长；价廉易得。各种分离膜按所使用的材质不同可分为无机材料膜和有机材料膜。无机材料膜有陶瓷膜和不锈钢膜，无机材料膜有陶瓷膜和不锈钢膜，有有机机膜膜多多为为合合成成高高分分子子材材料料膜膜，主主要要有有纤纤维维素素类类、聚矾类、聚烯烃类、聚酞胺类和芳香杂环类等。聚矾类、聚烯烃类、聚酞胺类和芳香杂环
27、类等。2024/9/4生命科学学院生命科学学院302024/9/430生命科学学院生命科学学院膜分离基本技术分离膜分分离离膜膜的的性能参数主主要要有有：孔孔道道特特征征、渗渗透透通通量量、截留率和截留相对分子质量等。截留率和截留相对分子质量等。孔道特征包括孔道特征包括孔径大小，孔径大小用最大孔径和平均孔径来描述孔径分布，孔径分布指各种孔径的孔占全部孔的体积分数。孔隙率，孔隙率是指孔体积占膜总体积的百分数。2024/9/4生命科学学院生命科学学院312024/9/431生命科学学院生命科学学院透析和超滤透析和超滤 J透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜，但小分子物质和离子能够通过而进行纯化
28、的一种方法。这种方法经常被用于去除大分子溶液中的小分子物质。J超滤 对透析原理进行了改进，它利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，在常压、加压或减压条件下对生物大分子溶液进行过滤，使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、浓缩或更换缓冲液的目的。透析方法示意图透析方法示意图沉淀与离心沉淀与离心J沉淀是根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同而对它们进行选择性沉淀从而达到分离目的的一种粗纯化方法。它通常用于将目的蛋白从大体积的粗抽取物中沉淀出来。这种方法既能除去许多杂质，又有浓缩之效。J实现选择性沉淀的方法有改变pH 或改变离子强度或者加入特殊的化合物。无论是哪一种沉淀方法，
29、产生的沉淀物都需要借助于离心的手段与上清分开。J离心方法是根据分子的特征密度来分离大分子。如果一种颗粒的密度大于其介质溶液的密度，那么这种颗粒有可能通过溶液发生沉降。颗粒沉降的速度与颗粒与介质溶液之间的密度之差成正比。任何一种颗粒在离心力作用下通过溶液发生沉降。J差速离心和密度梯度离心 离心机的使用高高速速与与超超速速离离心心机机因因其其转转速速高高，产产生生的的离离心心力力大大，使使用用不不当当或或缺缺乏乏定定期期的的检检修修和和保保养养，都都可可能能发发生生严严重重事事故故，因因此此使用离心机时都必须严格遵守操作规程：使用离心机时都必须严格遵守操作规程：使用各种离心机时，必须事先在天平上精
30、密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各离心机说明书所规定的范围。装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护。2024/9/4南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院37 层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流
31、过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。 层析技术操作简便，样品可多可少，既可用于实验室的研究工作，又可用于工业生产， 还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。 层析层析层析法又被称为色谱。所有的层析系统都由两相组成：一个是固定相，它可以是固体物质，也可以是固定在固体物质上的成分；另一个是由可以流动的物质组成的流动相，如水和各种溶剂。当待分离样品随着流动相通过固定相时，各组份在理化性质上的差别使得各自与两相发生相互作用（如吸附、溶解或结合等）的能力不同，最终导致它们在两相中的分配不同，而且随着流动相向前移动，各组份会不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随
32、流动相移动时受到的阻力就越小，向前移动的速度越快；反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。经过分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到分离各组份的目的。表表1 1 主要的层析方法及其原理主要的层析方法及其原理名称分离原理吸附层析各组份在作为固定相的固体吸附剂表面的吸附能力不同分配层析各组份在流动相和静止液相（固定相）中的分配系数不同离子交换层析固定相是离子交换树脂，各组份因所带电荷状况不同与离子交换树脂的亲和力不同凝胶层析固定相为多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在通过凝胶时受阻滞的程度不同疏水层析固定相为带有强疏水基团的树脂，各组分的疏水性不同，导致其与树脂的结合
33、能力不同亲和层析固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此达到和无亲和力的其它组份分离的目的层析基本操作过程层析基本操作过程 装置选择装置选择上样和洗脱上样和洗脱结果检测结果检测 上样均一性上样均一性 洗脱装置洗脱装置目的不同目的不同 检测方法不同检测方法不同活性检测活性检测基质均匀性基质均匀性柱层析的柱层析的L/d比值比值洗脱装置洗脱装置v 不改变溶剂体系不改变溶剂体系 依靠液面的水位差产生的依靠液面的水位差产生的静压力静压力致使洗致使洗脱液不断流经层析柱脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。流速也在变小。改善：蠕动泵或
34、恒流泵蠕动泵或恒流泵 改变溶剂系统改变溶剂系统 分级洗脱分级洗脱 在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺点：缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。化的目的。递减递增pH阴离子交换树脂阳离子交换树脂离子强度疏水层析离子交换层析 改变溶剂系统改变溶剂系统 梯度洗脱梯度洗脱 一种溶液以一种溶液以恒定的速度恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的连续地进入处于温和搅
35、拌的盛有另一种溶液的容器中，经盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度混合后的液体以同速度沉入层析柱沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以种溶液的浓度以线性梯度方式线性梯度方式连续地发生改变。连续地发生改变。注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。接近的蛋白质。 性能未知样品的蛋白质分离：性能未知样品的蛋白质分离： 改变缓慢的梯度洗脱改变缓慢的梯度洗脱若为单峰：分级洗脱若为单峰：分级洗脱离子交换层析离子交换层析原原 理理l离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交
36、换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 l原理：原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的。选择离子交换剂的一般原则：选择离子交换剂的一般原则：根根据据所所带带的的电电荷荷性性质质。如如带带正正电电荷荷，应应选选择择阳阳离离子子交交换换剂剂；如如带带负负电电荷荷，应应选选择择阴阴离离子子交交换换剂剂；如如为为两两性性离离子子，根根据据其其在在稳稳定定pHpH范范围内所带电荷的性质选择。围内所带电荷的性质选择。在在分分离离生生命命大大分分子子物物质质时时，选选用用亲亲水水性性基基质质的的交交换换剂剂较较为为
37、合合适适，它它们们对对被被分分离离物物质质的的吸吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。离子交换树脂的处理，再生等概念离子交换层析技术的应用离子交换树脂分离氨基酸离子交换树脂分离氨基酸分子筛示意图分子筛示意图亲和层析示意图亲和层析示意图亲和层析亲和层析 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。 在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分
38、子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化。 配基与偶联凝胶的选择与处理配基与偶联凝胶的选择与处理 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基(ligand)。配基必须偶联于不溶性母体(matrix) (又称载体或担体)上，常用的载体主要有：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素等。 当用小分子作为配基时，由于空间位阻不易与载体偶联，或不易与配对分子载体结合。为此通常在载体和配基之间接入不同长度的连接臂(space arm)。 偶联时，必须首先使载体活化。即通过某种方法(如溴化氰法、
39、叠氮法等)为载体引入某一活泼的基团。 亲和层析的操作条件亲和层析的操作条件 亲和柱层析装柱方法与凝胶层析相同，层析操作与离子交换层析相似。但由于亲和层析的对象都是生物分子，为防止生物大分子变性，常在低温(4)下进行。亲和层析柱所用的平衡缓冲液应与样品缓冲液一致，pH一般在近乎中性的范围内。上柱时流速应尽可能缓慢。上柱后，用大量平衡缓冲液洗去杂质，然后用洗脱液洗脱亲和物。洗脱结束后，继续用洗脱液洗涤，直至无亲和物为止。最后用平衡缓冲液使亲和层析柱平衡，即可重复使用。暂时不用时，亲和层析柱应置于4低温保存。 蛋白质研究方法蛋白质研究方法假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质假定你发现一种新的蛋白质：蛋白
40、质X X1. 如何得到这种蛋白质? 蛋白质的分离、纯化技术2. 这种蛋白质的大小？ （SDS-PAGE）3.它的pI是多少？ （等电聚焦）4. 其他细胞或其他生物体内是否存在？ （Western印迹）5. 其一级结构如何？ （序列分析）6.其三维结构又如何？ X-射线衍射和核磁共振蛋白质纯化蛋白质纯化一、准备工作：要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。二、纯化步骤：（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（5）鉴定蛋白质和酶纯化的常见方法和方案设计分离纯化蛋白质的各
41、种方法都是利用蛋白质的理化性质，例如溶解性、质量和形状、表面电荷、表面疏水性、与特定配体结合的性质等。常用的方法有：沉淀（溶解性）； 离子交换（电荷）；聚焦层析（电荷）；凝胶过滤（大小和形状）；疏水作用层析（疏水性）；亲和层析（与特定配体的特异性结合）。蛋白质纯化的准备工作。在进行蛋白质纯化之前首先要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。一个典型的蛋白质纯化方案开始于完整的组织，一般经过四个阶段：（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（4）鉴定，包括纯度、大小或pI
42、的测定。蛋白质纯度的鉴定（1）电泳法：如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦和毛细管电泳等，纯净的蛋白质电泳的结果应该是一条带。如果使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则应该特别小心，因为SDS能够破坏蛋白质的四级结构，如果一种蛋白质由不同的亚基组成，则会出现几条带。此外，电泳法检测蛋白质的纯度时，应取分布在蛋白质等电点两侧的两个不同的pH 值分别进行检测，这样得出的结论才更可靠；（2）化学法：N-端测定，C-端测定。纯品蛋白质应该具有恒定的N-端或C-端组成。如果一种蛋白质只有一条链组成，则只会检测到一种N-端或C-端氨基酸；（3）仪器法：HPLC或质谱。如果一种蛋白质样品在HPLC上只表现单一的峰，则
43、可视为其为纯品；如果纯化的是一种已知蛋白，经质谱分析测定出来的相对分子量与实际的值一致，那么也可认为它是纯品。 等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pI蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定直接测定法间接测定法： 先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。WesternWestern印迹印迹蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本
44、技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽肽指纹图指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与内动态变化的蛋
45、白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 蛋白质的双向电泳蛋白质的双向电泳双向凝胶电泳（双向凝胶电泳（2 2DEDE）原理）原理: : 先根据蛋白质的等电点不同在先根据蛋白质的等电点不同在pH梯度介质中梯度介质中进行第一次分离，即进行第一次分离，即等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusing, IEF），），然后根据蛋白质分子量的不同然后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即进行第二次分离，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳完整的实
46、验步骤包括：完整的实验步骤包括： 样品分离、等电聚焦、平衡、第二向分离、样品分离、等电聚焦、平衡、第二向分离、 染色、成像、软件分析、蛋白质鉴定染色、成像、软件分析、蛋白质鉴定 1.样品制备样品制备样品的制备是实验成败的关键，需根据不同的研究目的来样品的制备是实验成败的关键，需根据不同的研究目的来决定具体的实验方法。决定具体的实验方法。蛋白样品的蛋白样品的有效溶解有效溶解是成功分离蛋白质的最关键的因素之是成功分离蛋白质的最关键的因素之一。可以根据样品性质的不同，选用具有单一的增溶作用一。可以根据样品性质的不同，选用具有单一的增溶作用的溶液，还可用含多种变性剂、去垢剂、还原剂的复杂混的溶液，还可
47、用含多种变性剂、去垢剂、还原剂的复杂混合溶液，以使样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚集体合溶液，以使样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚集体完全破坏。完全破坏。制备样品的原则样品制备步骤越简单越好，避免目的蛋白的损失或丢失。裂解细胞或组织要防止蛋白降解。裂解细胞应在低温下进行(冰水浴或4)，最好用加有蛋白酶抑制剂的裂解液直接裂解。样品裂解液应新鲜配制，或分装冻存，而且要采用高纯度的去离子尿素蛋白样品应在等电聚焦前新鲜配制，或-80分装冻存，绝对避免将样品反复冻融。通过超离心去除所有颗粒性物质，因为颗粒性物质或脂会阻塞凝胶孔路。为了防止蛋白质被修饰，加入尿素后，不要加热蛋白样品。当样品中含有尿素时
48、，加热绝对不要超过37.升高温度会使尿素水解成异氰酸盐(isocyanate),使蛋白发生氨甲酰化(carbamylation)修饰。最好用强烈变性剂直接裂解样品，这样可以使蛋白水解酶立即变性失活。 双向电泳分析中的样品制备双向电泳分析中的样品制备|应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有
49、可重现性。|防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。|防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。|完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。|尽量去
50、除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。证待研究蛋白的可检测性。证待研究蛋白的可检测性。证待研究蛋白的可检测性。提高2DE分辨率的策略首先采用宽首先采用宽pHpH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采用采用pH3-10pH3-10的胶条的胶条如果如果pHpH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条条加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率加大蛋白上样量，提高局部蛋白
51、的分辨率采用窄采用窄pHpH范围的胶条，提高某范围的胶条，提高某pHpH范围蛋白的分辨率范围蛋白的分辨率第二向采用梯度胶进行分离第二向采用梯度胶进行分离去除高丰度蛋白，进行蛋白的去除高丰度蛋白，进行蛋白的fractionationfractionation处理处理, ,富集低丰富集低丰度蛋白度蛋白分子杂交技术分子杂交技术分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子的一门技术。生物分子的一门技术。样 品 制 备电 泳杂 交转 膜结果显示探探 针针 制制 备备分分 子子 杂杂 交交 原原 理理 及及 流流 程程 图图表表2 各种印迹技术各种印迹技
52、术印迹类型 转移到膜上的分子探针获得的信息Southern DNA片段 放射性标记的互补RNA或DNA 基因结构等 Northern RNA放射性标记的互补RNA或DNA特定RNA的大小、分布和含量Western 蛋白质 一级抗体和与酶偶联的二级抗体 特定蛋白质的大小、分布和含量核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。核酸序列称探针。
53、 杂交有固一液相杂交和液相杂交。杂交有固一液相杂交和液相杂交。 影响杂交的因素影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度：、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂浓度过高影响杂 交效率交效率2、温度：、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较杂交，适宜温度较Tm值低值低2025 （2）RNA/DNA或或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低杂交，加甲酰胺降低 Tm值值 （3）用寡核苷酸探
54、针杂交，适宜温度较）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低值低5 3、离子强度：、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度 4、甲酰胺：、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交
55、更稳定，当待液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542 杂交杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在液在68杂交杂交 5、核酸分子的复杂性：、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度的总长度 （2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于杂交率取
56、决于DNA的相对复杂性的相对复杂性 6、非特异性杂交反应：、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分和高分子化合物。如鲑精子化合物。如鲑精DNA或或小牛胸腺小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉溶液或脱脂奶粉 一个理想的标记物应满足：(1)(1)标记前后探针基本结构、化学性质相标记前后探针基本结构、化学性质相同同; ;(2)(2)特异性强、本底低、重复性好；特异性强、本底低、重复性好；(3)(3)操作简单、节时
57、；操作简单、节时；(4)(4)安全、无环境污染。安全、无环境污染。Northern印迹与印迹与Southern 印迹的不同点印迹的不同点 1、变性：、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持持RNA处于变性状态，处于变性状态，DNA电泳前和电泳电泳前和电泳 中不变性中不变性 2、转膜：、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为、靶核酸为RNA探针的标记探针的标记一、探针的种类一、探针的种类 基因组基因组DNA探针探针 cDN
58、A探针探针 RNA探针探针 寡核苷酸探针寡核苷酸探针核酸分子杂交实验因素的优化核酸分子杂交实验因素的优化|探针的选择探针的选择 在大多数情况下，可以选择克隆的在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或或cDNA双双链探针链探针|在检测单链靶序列时应选用与其互补的在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链单链探针或探针或RNA探针探针 |长的双链长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交交 p探针的标记方法探针的标记方法 选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而选择什么标记方
59、法主要视个人的习惯和可利用条件而定；定； 但还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等但还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等 一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高 在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统 五、核酸分子杂交实验因素的优五、核酸分子杂交实验因素的优化化p探针的浓度探针的浓度总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加在较窄的范围内，随探
60、针浓度增加，敏感性增加膜杂交中膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为标记探针与非放射性标记探针的用量分别为510ng/ml和和251000ng/ml，而原位杂交中，无论应，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为用何种标记探针，其用量均为0.55.0g/ml 受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响 五、核酸分子杂交实验因素的优五、核酸分子杂交实验因素的优化化p杂交率杂交率 现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行探针过剩的条件下进行 在探针过量的条件
61、下，杂交率主要依赖于在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长探针长度（复杂度）和探针浓度。度（复杂度）和探针浓度。下面列出的公式适用于过剩单链探针对靶序列杂下面列出的公式适用于过剩单链探针对靶序列杂交的情形交的情形 t1/2=ln2/kct1/2半数探针与固定靶序列杂交所需的时间（半数探针与固定靶序列杂交所需的时间（s）k =形成杂交体的速率常数形成杂交体的速率常数mol/(Lxntxs)决定于探针长度（决定于探针长度（L）、探针）、探针复杂度（复杂度（N）、温度、离子强度、粘度和）、温度、离子强度、粘度和pHc =溶液中的探针浓度（溶液中的探针浓度（mol/L）五、核酸分子杂交实验因素的优
62、五、核酸分子杂交实验因素的优化化杂交最适温度杂交最适温度 杂交技术最重要的因素之一杂交技术最重要的因素之一 反应温度低于反应温度低于Tm 1015，碱基顺序高度同源的互，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（低（Tm-30），虽然互补链之间也可形成稳定的双），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱更弱 最适复性温度（最适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：）：Tor =Tm 2
63、5苛刻复性温度：苛刻复性温度：Ts = Tm (10或或15)非苛刻复性温度：非苛刻复性温度：Tns =Tm (30或或35) 五、核酸分子杂交实验因素的优化五、核酸分子杂交实验因素的优化p杂交的严格性杂交的严格性 影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。一般认为在低于杂交体一般认为在低于杂交体Tm值值25时杂交最佳时杂交最佳 p 通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性所需的严格性 p 在实际应用中，寡核苷酸探针的最佳杂交温度必在实际应用中，寡核苷酸探针的最佳杂交温度必须精确确定。最方
64、便的一种方法是制备一张含不同须精确确定。最方便的一种方法是制备一张含不同稀释度靶稀释度靶DNA和非特异靶和非特异靶DNA（如鱼精或大肠杆（如鱼精或大肠杆菌菌DNA）的膜。在不同温度下使膜与探针杂交，特）的膜。在不同温度下使膜与探针杂交，特异靶序列结合探针信号很强，而非特异靶序列与探异靶序列结合探针信号很强，而非特异靶序列与探针无任何反应的温度就是最适温度针无任何反应的温度就是最适温度 五、核酸分子杂交实验因素的优化五、核酸分子杂交实验因素的优化杂交反应时间杂交反应时间 在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间温时间 一般杂交反应要进行一
65、般杂交反应要进行20h左右左右 推荐用推荐用Cot =值来计算杂交反应时间值来计算杂交反应时间 Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应）和反应时间（时间（t）的乘积，实验表明）的乘积，实验表明Cot =100时，杂交反应基时，杂交反应基本完成本完成 五、核酸分子杂交实验因素的优化五、核酸分子杂交实验因素的优化杂交促进剂杂交促进剂 惰性多聚体可用来促进惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率，个碱基以上的探针的杂交率，对单链探针可增加对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达随机引
66、物标记的探针可增加高达100倍倍硫酸葡聚糖、聚乙二醇（硫酸葡聚糖、聚乙二醇（PEG）、聚丙烯酸）、聚丙烯酸 小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交 五、核酸分子杂交实验因素的优化五、核酸分子杂交实验因素的优化Western Blot一般流程一般流程蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 凝胶电泳凝胶电泳l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色蛋白质的印迹技术蛋白质的印迹技术(免疫印迹免疫印迹) 首先将混合蛋白质用首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小按分子大小分开，再将蛋白质转移到分开，再将蛋白质转移到NC膜
67、上，蛋白质膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。的位置可保持在胶中的原位上。与与DNA和和RNA印迹相似之处印迹相似之处蛋白质的转移只有靠电转移。蛋白质的转移只有靠电转移。蛋白质的检测以蛋白质的检测以抗体抗体作探针。作探针。用碱性磷酸酶（用碱性磷酸酶（ALP）、）、辣根过氧化酶辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，）标记第二抗体，底物显色底物显色来检测来检测蛋白区带的信号，底物亦可与蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂化学发光剂结合以提高敏感度。结合以提高敏感度。或用同位素标记第二抗体，或用同位素标记第二抗体，放射自显影法放射自显影法检测蛋白区带的信号。检测蛋白区带的信号。与与DNA和和RNA
68、印迹不同之处印迹不同之处Western blotting应用应用 检测样品中的特异蛋白质的存在。检测样品中的特异蛋白质的存在。 细胞中特异蛋白质的定量分析。细胞中特异蛋白质的定量分析。 蛋白质分子的相互作用研究。蛋白质分子的相互作用研究。 定义：定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内，是通过模拟体内 DNA 复制的复制的 方式，在体外选择性地将方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩某个特殊区域扩 增出来的技术。增出来的技术。n PCR技术技术:加热加热变变 性性复复性性复温DNA的变性和复性加热
69、或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 PCRPCR技术与体内技术与体内DNADNA复制的区别：复制的区别：1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；3. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。 对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可
70、作为扩增模板可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测PCR技术的特点简便、快速简便、快速PCR反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广PCR技术的特点灵敏度高灵敏度高FPCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克 ( pg=10-12 ) 量级的起始待测模板扩增到微克( ug=10-6)水平F从 100 万个细胞中检出一个靶细胞F在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个RFU (空
71、斑形成单位) F在细菌学中最小检出率为3个细菌PCR技术的特点PCR原理原理5533d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5353535353535353添加反应混合液添加反应混合液及样本及样本变性变性535353535353退火退火加入试管中加入试管中延伸延伸53535353继续延伸继续延伸535355TaqTaq353TaqTaq55循环循环PCR原理原理5353535355335353第二个循环第二个循环4个拷贝个拷贝第三个循环第三个循环8个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353第第n个循环个循环2n个拷贝个拷贝PCR原理原理n指数增长期n线形增长期n平台期
72、循环数 # 理论值 实际值Log 产物DNAPCR过程的实时监测7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/LPCRPCR反应五要素反应五要素引物（引物（primer） 酶酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板模板 （template） Mg2+ （magnesium
73、）PCR技术的基本过程(1)模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer预变性预变性模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBufferTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶9494oC52 基本过程PCR技术的基本过程(2)Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer循循环环仪仪949455 55 72 72 Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer
74、72 572 57 min7 minPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA引物引物引物是引物是PCR特异性反应的关键特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度互补的程度理论上，只要知道任何一段模板理论
75、上，只要知道任何一段模板DNA序序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用引物，用 PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大在体外大量扩增量扩增引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系F10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq
76、DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul2）循环参数(1)变性 (2) 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加PCR的主要类型 不对称PCR 反向PCR (reverse PCR) 多重PCR LP-PCR 锚式PCR PCR固相分析法固相分析法 实时实时PCR技术技术思考题什么
77、是PCR？简述PCR的主要过程。PCR的主要组成成分，以及每个成分的主要作用和注意事项。举例说明PCR技术主要包括哪些？简述PCR技术主要应用于哪些方面？酶联免疫吸附反应酶联免疫吸附反应(Enzyme-linked (Enzyme-linked ImmunosorbentImmunosorbent Assay,ELISA)Assay,ELISA) 免疫标记技术放射物标记技术酶标技术免疫荧光技术其他标记技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法双抗体夹心法竞 争 法双抗原夹心法间 接 法双位一点法基本原理基本原理 是利用抗原抗体进行的检测技术。是利用抗原抗体进行的检测技术。即利用制备好的特异
78、抗原或抗体作为试即利用制备好的特异抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂）ELISA原理原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化
79、变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关 一：灵敏性一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。众该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。众所周知所周知, , 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。因此该体系常被称为酶放大体系。 ELISAELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。进行定量
80、。 ELISAELISA的特点的特点二：特异性二：特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。抗原抗体反应具有高度的特异性。 ELISAELISA的试剂的试剂(A(A、B B、C C三部分三部分) )ELISA中有三个必要的试剂：中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的免疫吸附剂、结合物和酶的底物。底物。
81、（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；）洗涤液；（7）酶反应终止液）酶反应终止液DNA的体外合成A.DNA的化学合成DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸义寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用。目前
82、寡核苷酸均是用DNA合合成仪合成的，成仪合成的，大多数大多数DNA合成仪是以固相合成仪是以固相磷酰亚胺法为基础设磷酰亚胺法为基础设 计制造的计制造的。1291. 合成的原理核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过于接长的核酸链始终被固定
83、在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。法除去。合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。 核酸序列测定DNA测测序序是是指指分分析析特特定定DNA片片段段的的碱碱基基序序列列，也也就就是是核核苷苷酸酸排排列列方方式式。RNA测测序序则则通通常常将将RNA提提取取后后，反反转转录录为为DNA后使用后使用DNA测序的方法进行测序。测序的方法进行测序。在在分分子子生生物物学学研研究究中中
84、，DNA的的序序列列分分析析是是进进一一步步研研究究和和改改造目的基因的基础。造目的基因的基础。目前应用最广泛的是：目前应用最广泛的是：Sanger双脱氧链终止法。Maxam-Gilbert DNA化学降解法。新技术：杂交测序法， 质谱法， 单分子测序法， 原子探针显微镜测序法，DNA 芯片法 。2024/9/4131核酸序列测定A.Sanger双脱氧链终止法基本原理：在在模模板板指指导导下下，DNA聚聚合合酶酶不不断断将将dNTP加加到到引引物物的的3-OH末末端端，使使引引物物延延长长，合合成成出出新新的的互互补补的的DNA链链，如如果果加加入入双脱脱氧氧三三磷磷酸酸核核苷苷(ddNTP)
85、，由由于于双双脱脱氧氧核核糖糖的的3位位置置上上缺缺少少一一个个羟羟基基，故故不不能能同同后后续续的的dNTP形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键，即即形形成成一一种种全全部部具具有有相相同同5-引引物物端端和和以以ddNMP残残基基为为3端端结结尾的一系列长短不一片段的混合物。尾的一系列长短不一片段的混合物。由由于于双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸在在每每个个DNA分分子子中中掺掺入入的的位位置置不不同同，采采用用聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳区区分分长长度度差差一一个个核核苷苷酸酸单单链链DNA，从而读取从而读取DNA核苷酸序列。核苷酸序列。2024/9/4南京农业大学 生命科学学院132化学降解法
86、与双脱氧法的比较Maxam-Gilber化化学学降降解解法法所所能能测测定定DNA序序列列的的长长度度要要比比Sanger法法短短一一些些，通通常常说说来来，化化学学降降解解法法对对放放射性标记末端射性标记末端250个核苷酸以内的个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。序列效果最佳。如如今今双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸末末端端终终止止法法远远比比Maxam-Gilbert化化学学降降解解法法应应用用得得更更为为广广泛泛。但但是是，化化学学降降解解法法具具有有一个一个Sanger 法所不具备的明显优点：法所不具备的明显优点：即所测核酸序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此，利用Maxam
87、-Gilbert法可以对合成的寡核苷酸进行测序，分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，也可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。然然而而，由由于于Sanger法法的的简简便便快快速速，仍仍不不失失为为现现今今DNA测序的最佳选择方案。测序的最佳选择方案。2024/9/4133“测序”思考回答问题1、Sanger双脱氧链终止法原理是什么双脱氧链终止法原理是什么2、Maxam Gilbert化学修饰法的原理是什么化学修饰法的原理是什么3、DNA杂交测序原理是什么杂交测序原理是什么4、什么是寡核苷酸矩阵芯片、什么是寡核苷酸矩阵芯片5、杂交测序有什么应用、杂交测序有什么应用组与组学4基因组与基因组学4蛋白质组与蛋白质组学4转录组与转录组学4代谢组与代谢组学
