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1、大肠杆菌、质粒和噬菌体大肠杆菌、质粒和噬菌体郑丽舒郑丽舒 中国疾控中心中国疾控中心 病毒病预防控制所病毒病预防控制所2013.04.152013.04.15主主 要要 内内 容容大肠杆菌大肠杆菌 中文名称：中文名称：大肠杆菌大肠杆菌外文名称：外文名称：Escherichia coli (T. Escherich 1885)界：界：原核生物界原核生物界门：门：变形菌门变形菌门(Bacteria)纲：纲：-变形菌纲变形菌纲(Proteobacteria)目：目：肠杆菌目肠杆菌目(Enterobacteriales)科：科：肠杆菌科肠杆菌科(Enterobacteriaceae)属：属：埃希氏菌属埃
2、希氏菌属(Escherichia)种：种：大肠杆菌种大肠杆菌种(E. coli)大肠杆菌一般特征大肠杆菌一般特征 属于原核生物，是革兰氏阴性棒状杆菌属于原核生物，是革兰氏阴性棒状杆菌( (红色红色) ) 有鞭毛，无芽孢，能运动，有的有荚膜有鞭毛，无芽孢，能运动，有的有荚膜 其染色体是长约其染色体是长约30kb30kb的双链环状的双链环状DNADNA分子分子 生长需求非常简单，在仅含碳水化合物和少量氮源及生长需求非常简单，在仅含碳水化合物和少量氮源及 无机盐的培养基上即可生长无机盐的培养基上即可生长 兼性兼性兼性兼性厌厌厌厌氧氧氧氧 长度大约长度大约长度大约长度大约2 2 2 2umumumum
3、，宽，宽，宽，宽0.80.80.80.8umumumum DNADNA长度约为体长的长度约为体长的10001000倍倍大肠杆菌在分子生物学实验中的应用大肠杆菌在分子生物学实验中的应用 生物工程用菌株优点：生物工程用菌株优点： 背背景景清清楚楚：全全基基因因组组测测序序，共共有有44054405个个开开放放阅阅读读框框架架。由由于于该该菌菌株株遗遗传传背背景景清清楚楚，并并经经过过一一系系列列突突变变筛筛选选，使使外外源源DNADNA在在胞胞内内不不易易发发生生重重组或修饰，更适于作为基因操作的宿主菌。组或修饰，更适于作为基因操作的宿主菌。 生生物物安安全全：生生物物工工程程用用菌菌株株是是在在
4、不不断断筛筛选选后后被被挑挑选选出出的的，这这些些菌菌株株由由于于失失去去细细胞胞壁壁的的重重要要组组分分，在在自自然然条条件件下下无无法法生生长长，甚甚至至普普通通的的清清洁洁剂剂都都可可以以轻轻易易杀杀灭灭。即即便便由由于于操操作作不不慎慎导导致致活活菌菌从从实实验验室室流流出出，也可避免对自然界造成危害。也可避免对自然界造成危害。 菌菌株株基基因因优优化化：生生物物工工程程用用的的菌菌株株基基因因组组都都被被优优化化过过，使使之之带带有有不不同同基因型（例如基因型（例如半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。 操操作作简简便便，表表达达量量高高：大
5、大肠肠杆杆菌菌操操作作和和培培养养条条件件简简单单，适适于于大大规规模模发发酵。表达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的酵。表达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的80%80%。 目目前前大大肠肠杆杆菌菌是是应应用用最最广广泛泛，最最成成功功的的表表达达体体系系，常常做做高高效效表表达的首选体系。美国达的首选体系。美国FDAFDA批准为安全的基因工程受体生物。批准为安全的基因工程受体生物。大肠杆菌在分子生物学实验中的应用大肠杆菌在分子生物学实验中的应用 缺点：缺点： 基因结构差异：基因结构差异：大多数真核基因含有内含子，细菌中没有除去内含子机制，外源基因编大多数真核基因含有内含子，细菌
6、中没有除去内含子机制，外源基因编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5 5非编码区。非编码区。 原核：原核：CDNACDNA； 真核：真核：DNADNA 转录信号不同：转录信号不同：真核基因转录的真核基因转录的mRNAmRNA分子不具有结合细菌核糖体所必须的分子不具有结合细菌核糖体所必须的SDSD序列序列 细菌细菌RNARNA聚合酶不能识别真核生物启动子聚合酶不能识别真核生物启动子 SD SD序列（序列（Shine-Shine-DalgarnosequenceDalgarnosequence）：）： mRNA mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。
7、中用于结合原核生物核糖体的序列。 SD SD序列在细菌序列在细菌mRNAmRNA起始密码子起始密码子AUGAUG上游上游 10 10个碱基处，有一段富含嘌呤的碱基序个碱基处，有一段富含嘌呤的碱基序 列，能与细菌列，能与细菌16SrRNA316SrRNA3端识别，帮助端识别，帮助 从起始从起始AUGAUG处开始翻译。处开始翻译。大肠杆菌在分子生物学实验中的应用大肠杆菌在分子生物学实验中的应用 缺点：缺点： mRNAmRNA的分子结构差异：的分子结构差异：绝大多数真核绝大多数真核mRNAmRNA分子的分子的3 3 末端有末端有poly(Apoly(A) )尾巴，尾巴，在在5 5 末端有一个帽结构。
8、影响末端有一个帽结构。影响mRNAmRNA在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结合的能力，阻止正常的转录和转译合的能力，阻止正常的转录和转译 缺乏对真核生物蛋白质的缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工修饰加工系统：表达产生的蛋白质不能进行糖基系统：表达产生的蛋白质不能进行糖基化、磷酸化修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构想折叠，因而产生的化、磷酸化修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构想折叠，因而产生的蛋白质没有足够的生物学活性（缺乏对真核生物蛋白质的蛋白质没有足够的生物学活性（缺乏对真核生物蛋白质的复性功能复性功能）。）。 表达的蛋白质经常是不溶的，在细菌内形成包涵
9、体，当表达的蛋白量超过表达的蛋白质经常是不溶的，在细菌内形成包涵体，当表达的蛋白量超过菌体总蛋白菌体总蛋白10%10%时，容易形成包涵体。时，容易形成包涵体。 细菌的蛋白酶：可以细菌的蛋白酶：可以识别降解识别降解真核生物的蛋白质产物。真核生物的蛋白质产物。应用实例应用实例大肠杆菌的培养与保存大肠杆菌的培养与保存常用培养基常用培养基 取取2-52-5毫升液体毫升液体LBLB培养基，到无菌培养管中；培养基，到无菌培养管中； 用接种环从琼脂培养板上挑取单个菌落，接种用接种环从琼脂培养板上挑取单个菌落，接种到培养基中。注意要先蘸取少许液体在管壁到培养基中。注意要先蘸取少许液体在管壁将菌落研磨开，再轻摇
10、试管使细菌均匀分散将菌落研磨开，再轻摇试管使细菌均匀分散到培养基中；到培养基中； 盖上盖子，保证通气。盖上盖子，保证通气。3737摇床摇床 60rpm60rpm，培养，培养过夜过夜; ; 1:1001:100转种到培养瓶中。通常转种到培养瓶中。通常250ml250ml培养瓶中加培养瓶中加培养液不超过培养液不超过100ml100ml。3737摇床（摇床（250rpm250rpm）培）培养，直至细菌生长到所需密度。养，直至细菌生长到所需密度。大肠杆菌的培养与保存大肠杆菌的培养与保存大肠杆菌的液体培养大肠杆菌的液体培养在固体培养基上培养在固体培养基上培养大肠杆菌的培养与保存大肠杆菌的培养与保存菌株的
11、保存与复苏菌株的保存与复苏穿刺保存穿刺保存菌株的保存与复苏菌株的保存与复苏冷冻保存冷冻保存质粒概述质粒概述质粒概述质粒概述LSCOC质粒概述质粒概述质粒概述质粒概述细菌质粒细菌质粒定义：定义：定义：定义：细菌细胞中染色体以外的共价细菌细胞中染色体以外的共价细菌细胞中染色体以外的共价细菌细胞中染色体以外的共价闭合环状闭合环状闭合环状闭合环状DNADNADNADNA分子分子分子分子 ( ( ( (cccDNAcccDNAcccDNAcccDNA) ) ) )，能，能，能，能 独立于细胞核进行自主复制。独立于细胞核进行自主复制。独立于细胞核进行自主复制。独立于细胞核进行自主复制。大小：大小：大小：大
12、小：其大小在其大小在其大小在其大小在1-1700 kb1-1700 kb1-1700 kb1-1700 kb之间。之间。之间。之间。携带有数个到数十个甚至上百个基因。携带有数个到数十个甚至上百个基因。功能：功能：进入宿主菌后，带有一些基因，产生毒素、进入宿主菌后，带有一些基因，产生毒素、抗药性抗药性、固氮、产生、固氮、产生酶类、降解功能等。酶类、降解功能等。分类：分类：根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成抗性质粒、降解质粒、抗性质粒、降解质粒、抗性质粒、降解质粒、抗性质粒、降解质
13、粒、毒力质粒、共生质粒毒力质粒、共生质粒毒力质粒、共生质粒毒力质粒、共生质粒等类型。等类型。等类型。等类型。重组：重组：在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生存在范围：存在范围：很多细菌如很多细菌如E.coliE.coli、ShigellaShigella、S.aureusS.aureus、Streptococcus Streptococcus lactislactis、根癌土壤杆菌等、根癌土壤杆菌等细菌质粒功能分类细菌质粒功能分类克隆质粒克隆质粒: : 克隆一个基因或克隆一个基因或DNADNA片断片断表达质粒表达质粒: : 用于一个基因的蛋白表达用于一个基因
14、的蛋白表达细菌质粒性质：细菌质粒性质： 1 1、可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在、可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），（游离态），也可以通过交也可以通过交换掺入染色体上，以换掺入染色体上，以附加体（附加体（episomeepisome）的形式存在；的形式存在；细菌质粒性质：细菌质粒性质： 2 2、质粒是一种、质粒是一种复制子（复制子（repliconreplicon），根据自我复制能力的不同，可把，根据自我复制能力的不同，可把 质质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种；粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种；严紧型质粒严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体的复制受细胞核控
15、制，与染色体DNADNA复制相伴随，一般一个寄主复制相伴随，一般一个寄主细胞内只有少数几个（细胞内只有少数几个（1-51-5）个拷贝；）个拷贝；松弛型质粒松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体的复制不受细胞核控制，在染色体DNADNA复制停止的情况下仍可以复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到进行复制，在细胞内的数量可以达到10-20010-200个或更多。如果用一定的药物个或更多。如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成，会使质粒拷贝数增至几千份。处理抑制寄主蛋白质的合成，会使质粒拷贝数增至几千份。pBR322pBR322即属于松弛型质粒，经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。
16、即属于松弛型质粒，经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。严紧型严紧型松弛型松弛型细菌质粒性质：细菌质粒性质：3、可以通过可以通过转化、转导或接合转化、转导或接合作用作用( (通过细胞间紧密接触而实现遗传物质通过细胞间紧密接触而实现遗传物质交换的过程交换的过程) )由一个细菌细胞转移到另一个细胞中，使两个细胞都成为带由一个细菌细胞转移到另一个细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起转移，质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起转移，所以可成为基因工程的载体。所以可成为基因工程的载体。细菌质粒性质：细菌质粒性质：
17、 5 5、质粒对于细菌的生长不是必须的、质粒对于细菌的生长不是必须的代表性细菌质粒（代表性细菌质粒（1 1）F F因子，又称致育因子或性因子，因子，又称致育因子或性因子，626210106 6DaltonDalton，94.5kb94.5kb，环状双链，环状双链DNADNA，编码，编码9494个中等大个中等大小多肽，其中小多肽，其中1/31/3基因（基因（tratra区）与接合作用有关。区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。F F质粒的整个基因组结构由三个主要区
18、段组成：（质粒的整个基因组结构由三个主要区段组成：（1 1）转移区（）转移区（2 2）复制区（）复制区（3 3）重组区）重组区重组区中有重组区中有4 4个插入顺序（个插入顺序（ISIS），通过和宿主染色体上的），通过和宿主染色体上的ISIS同源重组或通过转座，同源重组或通过转座，F F因子可因子可以整合到宿主不同位点上。由于宿主染色体上以整合到宿主不同位点上。由于宿主染色体上ISIS方向不同，所以整合的方向也随之不同。方向不同，所以整合的方向也随之不同。F因子（因子（fertilityfactor）代表性细菌质粒（代表性细菌质粒（1 1）代表性细菌质粒（代表性细菌质粒（2 2）：）：R R因子
19、（因子（resistanceresistance），抗药因子，），抗药因子，带带R R因子的细菌有大肠杆菌、沙门氏因子的细菌有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌等菌、志贺氏菌、绿脓杆菌等G G- -菌，菌，60-90%60-90%的的G G- -菌耐药性由菌耐药性由R R因子转移。因子转移。 R R因子是细胞质性质粒，具有使寄主因子是细胞质性质粒，具有使寄主菌对链霉素、菌对链霉素、氯霉素氯霉素、四环素等抗菌、四环素等抗菌素或磺胺剂产生抗药性的基因群。和素或磺胺剂产生抗药性的基因群。和F F因子一样，通过接合进行转移，获因子一样，通过接合进行转移，获得该因子的细菌获得对多种药剂的抗得该因子的
20、细菌获得对多种药剂的抗性，给治疗带来很大麻烦。性，给治疗带来很大麻烦。R R因子为环状双链因子为环状双链DNADNA分子，由相连两分子，由相连两个个DNADNA片段组成，即片段组成，即抗性转移因子抗性转移因子和和抗性决定因子抗性决定因子，R R因子在细胞内的因子在细胞内的copycopy数可从数可从1-21-2个到几十个，分为严个到几十个，分为严紧型和松弛型，经氯霉素处理后，松紧型和松弛型，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达弛型质粒可达2000-30002000-3000个个/ /细胞。细胞。R因子（因子（resistencefactor）代表性细菌质粒（代表性细菌质粒（3 3）：）：ColCol
21、因子，产大肠杆菌素因子，编码因子，产大肠杆菌素因子，编码合成大肠杆菌素合成大肠杆菌素, , 通过抑制复制、转通过抑制复制、转录、转译或能量代谢而专一性地杀死录、转译或能量代谢而专一性地杀死不含不含ColCol因子的其他肠道细菌。因子的其他肠道细菌。ColCol因子可分为两类：因子可分为两类： ColE1ColE1：无接合作用，松弛型多：无接合作用，松弛型多copycopy；广泛地用于重组；广泛地用于重组DNADNA研究和体外复研究和体外复制系统。制系统。ColIbColIb：与：与F F因子相似，通过接合作用因子相似，通过接合作用转移，属于严紧型控制，只有转移，属于严紧型控制，只有1-21-2
22、个个copycopy。Col因子（因子（colicinogenicfactor）真核生物真核生物DNA质粒质粒环状环状DNADNA质粒：质粒：酵母质粒，植物线粒体中的环状酵母质粒，植物线粒体中的环状DNADNA质粒，人和质粒，人和动物的核动物的核DNADNA质粒等，都是不知其功能的隐蔽质粒。质粒等，都是不知其功能的隐蔽质粒。线状线状DNADNA质粒：质粒：乳酸克鲁维酵母的嗜杀线状乳酸克鲁维酵母的嗜杀线状DNADNA质粒，植物线粒质粒，植物线粒体中与雄性不育有关的线状体中与雄性不育有关的线状DNADNA质粒。质粒。真核生物真核生物RNA质粒质粒有有壳壳体体的的dsRNAdsRNA质质粒粒：由由蛋
23、蛋白白质质壳壳体体包包裹裹，存存在在于于某某些些真真菌菌和和植植物物细细胞胞中中，由由于于它它们们酷酷似似病病毒毒，所所以以也也常常被被称称作作真真菌菌病病毒毒和和植植物物隐隐蔽蔽病病毒毒，或或称称类类病病毒毒颗颗粒粒，典典型型代代表表是是酿酿酒酒酵酵母母的的嗜嗜杀杀dsRNAdsRNA质粒。与质粒。与RNARNA病毒的主要区别是它们不具有感染性病毒的主要区别是它们不具有感染性无无壳壳体体的的dsRNAdsRNA质质粒粒：存存在在于于脂脂质质小小囊囊中中的的栗栗疫疫菌菌减减毒毒dsRNAdsRNA质粒，玉米线粒体中与雄性不育有关的质粒，玉米线粒体中与雄性不育有关的dsRNAdsRNA质粒。质粒
24、。分子生物学实验中常用质粒载体分子生物学实验中常用质粒载体载体分类载体分类载体分类载体分类质粒载体的选择质粒载体的选择质粒载体的选择质粒载体的选择常见质粒常见质粒1 1：pBR322pBR322 优点：优点：1 1、具有较小的分子量；、具有较小的分子量； 分子量为分子量为4363bp4363bp，克隆载体的分，克隆载体的分子量大小不要超过子量大小不要超过10kb10kb。2 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。转化子的选择记号。 共有共有2424种种核酸内切酶单一酶切识核酸内切酶单一酶切识别位点。别位点。 其中其中7 7种种内切酶的识别位点在四环内切酶
25、的识别位点在四环素抗性基因内部，素抗性基因内部，2 2种种识别位点在识别位点在于这个基因的启动区内，所以于这个基因的启动区内，所以9 9个个限制酶切位点插入外源片断可以限制酶切位点插入外源片断可以导致导致tettetr r基因的失活；基因的失活； 另外有另外有3 3种种限制酶在氨苄青霉素抗限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点。性基因有单一的识别位点。3 3、具有较高的拷贝数，而且经过氯具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累霉素扩增之后每个细胞中可积累1000-30001000-3000个拷贝（氯霉素抑制宿个拷贝（氯霉素抑制宿主菌蛋白质合成主菌蛋白质合成, ,阻止细胞染色
26、体阻止细胞染色体复制复制, ,而质粒本身复制不受影响而质粒本身复制不受影响, ,增加质粒的拷贝数）。增加质粒的拷贝数）。Example:a.在pBR322质粒的BamHBamH或或SalSal位点插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出Ampr rTets s表型的重组pBR322质粒，转化入Amps sTets s的大肠杆菌。 涂布在含青霉素的选择培养基上，可生长 涂布于含四环素的选择培养基上，不能生长。常见质粒常见质粒2 2：pGEMpGEM-T-T 互互补补的的检检测测PUC18/19PUC18/19由由pBR322pBR322和和M13M13噬菌体改
27、造噬菌体改造常用表达质粒：常用表达质粒：质粒质粒DNADNA的分离与纯化的分离与纯化 1 1、氯化铯密度梯度离心法、氯化铯密度梯度离心法 2 2、碱变性法、碱变性法 3 3、微量碱变性法、微量碱变性法 1.1.氯化铯密度梯度离心法原理氯化铯密度梯度离心法原理 质粒质粒DNADNA占总占总DNADNA的的1%1%2%2%； 在细胞裂解及在细胞裂解及DNADNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒片断，而质粒DNADNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；分子量小，结构紧密仍保持完整的状态； 染色剂溴化乙锭（染色剂溴化乙锭（EBEB）
28、能掺入到能掺入到DNADNA链的碱基中，导致链的解旋；而链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的且形成的EB-DNAEB-DNA复合物中，复合物中，EBEB含量越高，密度会越低（完整的质粒含量越高，密度会越低（完整的质粒DNADNA结合结合EBEB少，密度大）。少，密度大）。 离心流程离心流程 离心收集菌体，加入溶菌酶或离心收集菌体，加入溶菌酶或SDSSDS，促进大肠杆菌细胞裂解，离心收集含促进大肠杆菌细胞裂解，离心收集含质粒质粒DNADNA的上清。的上清。 将将EBEB的的CsClCsCl溶液加到清亮的大肠杆溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，菌裂解液中，EBEB会嵌入到会嵌入到DNADNA链的碱链
29、的碱基中。基中。 在在EBEB达到饱和时，进行氯化铯密度达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。梯度离心。2.2.碱变性法原理：碱变性法原理：原理：原理：cccDNAcccDNA与与线性染色体线性染色体DNADNA片断之间，拓扑学上存在差异片断之间，拓扑学上存在差异 在在pH12.0pH12.012.512.5范围内：范围内： 线性的线性的DNADNA双螺旋双螺旋结构解开而被变性；结构解开而被变性；共价闭环质粒共价闭环质粒DNADNA的氢键会被断的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。 恢复恢复pHpH值中性时：值中性时：
30、 共价闭合环状的质粒共价闭合环状的质粒DNADNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，恢复原来构型，保持可溶性状态。准确，恢复原来构型，保持可溶性状态。 线性染色体线性染色体DNADNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构。准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构。 通过离心，去除线性染色体通过离心，去除线性染色体DNADNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNARNA，蛋白质，蛋白质-SDS-SDS复复合物等，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒合物等，
31、最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNADNA。挑取单个菌落接种到挑取单个菌落接种到5ml5ml含适当抗菌素的含适当抗菌素的LBLB培养基中，培养基中， 3737摇床培养过夜。摇床培养过夜。取取1.5ml1.5ml菌液加入菌液加入EppendorfEppendorf管中，管中，5000rpm5000rpm离心离心1min1min，弃上清，弃上清，沉淀沉淀悬浮悬浮于于150l150l溶液溶液（500mmol/L500mmol/L葡萄糖，葡萄糖，25mmol/L 25mmol/L Tris-HClTris-HCl，10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA，pH pH 8.08.0）冰浴
32、）冰浴5 5分钟；分钟；此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。 加入新配置的加入新配置的200l200l溶液溶液（0.2mol/L 0.2mol/L NaOHNaOH，1%SDS1%SDS），混匀，冰浴），混匀，冰浴1010分钟。分钟。这一步操作这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNADNA片断会慢慢断裂；片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组第二，必须温柔混合，不然基因组DNADNA也会断裂。也会断裂。加入加入
33、150l 150l 溶液溶液（ 3mol/L3mol/L乙酸钾乙酸钾，pH4.8pH4.8），冰浴），冰浴5 5分钟；分钟；碱处理的时间要短，而且碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNADNA污染。污染。 12000rpm12000rpm离心离心3 3分钟，转移上清至新的离心管；分钟，转移上清至新的离心管；加入等体积酚加入等体积酚/ /氯仿抽提一次；转移上层水相至新的离心管；氯仿抽提一次；转移上层水相至新的离心管；等体积氯仿抽提一次。等体积氯仿抽提一次。取上清，加入取上清，加入2 2倍体积无水乙醇，混匀，倍
34、体积无水乙醇，混匀，-20-20沉淀沉淀3030分钟；分钟；12000rpm12000rpm离心离心5 5分钟。分钟。70%70%乙醇洗涤沉淀一次；乙醇洗涤沉淀一次；干燥后加入干燥后加入50l50l含含RNARNA酶（酶（20ug/ml20ug/ml）的）的TETE（10mmol/L 10mmol/L TrisTris-HCL-HCL，1mmol/L EDTA1mmol/L EDTA，pH pH 8.08.0），），3737水浴水浴3030分钟。分钟。-20-20保存备用。保存备用。质粒的小量提取质粒的小量提取碱裂解法碱裂解法 自自QiagenQiagen公司推出快速小量提取质粒公司推出快速小
35、量提取质粒DNADNA试剂盒以来，很多公司都开发试剂盒以来，很多公司都开发出类似产品，其原理及实验步骤大同小异。具体步骤如下出类似产品，其原理及实验步骤大同小异。具体步骤如下( (天为时代天为时代) )：挑取单菌落接种于挑取单菌落接种于5ml5ml含适当抗菌素的含适当抗菌素的LBLB培养基中，培养基中，3737振荡培养过夜；振荡培养过夜；取取1.5ml1.5ml菌液加入菌液加入EppendorfEppendorf管中，管中，13000rpm13000rpm离心离心1min1min，弃上清，加入，弃上清，加入250ul 250ul S1 Buffer,S1 Buffer,最大速度旋涡震荡；最大速
36、度旋涡震荡；加入加入250ul 250ul S2 BufferS2 Buffer，轻轻颠倒混匀轻轻颠倒混匀4-64-6次；次；加入加入350ul 350ul S3 BufferS3 Buffer，立即迅速颠倒混匀，可见白色絮状沉淀；立即迅速颠倒混匀，可见白色絮状沉淀；将上清加入纯化柱中，将上清加入纯化柱中，5000rpm5000rpm离心离心10min10min；弃去收集管中液体，加入弃去收集管中液体，加入500ul500ul除蛋白液除蛋白液PD BufferPD Buffer，13000rpm13000rpm离心离心1min1min；弃去收集管中液体；加入弃去收集管中液体；加入700ul P
37、E Buffer700ul PE Buffer，13000rpm13000rpm离心离心1min1min；弃去收集管中液体；加入弃去收集管中液体；加入500ul PE Buffer500ul PE Buffer，13000rpm13000rpm离心离心1min1min；弃去收集管中液体；弃去收集管中液体；13000rpm13000rpm离心离心3min3min，以彻底去除乙醇；，以彻底去除乙醇；将柱子放到一只干净的将柱子放到一只干净的1.5ml 1.5ml EppendorfEppendorf管中，加入管中，加入50l ddH2O50l ddH2O；静止放置静止放置2min, 13000rpm
38、 2min, 13000rpm 离心离心1min,1min,收集离心液，收集离心液，-20-20保存。保存。 质粒的小量提取质粒的小量提取碱裂解法（试剂盒）碱裂解法（试剂盒）挑取单菌落接种挑取单菌落接种5 5毫升含适当抗菌素的毫升含适当抗菌素的LBLB培养基中，培养基中，3737震荡培养过夜。震荡培养过夜。将培养物转接将培养物转接200ml200ml含同样抗菌素的含同样抗菌素的LBLB培养基中，培养基中，3737剧烈振荡培养剧烈振荡培养12-1612-16小时，细菌密度小时，细菌密度(OD600nm)(OD600nm)达到达到1.01.0；5000rpm5000rpm离心离心1515分钟，弃上
39、清；分钟，弃上清；重悬细菌于重悬细菌于100ml100ml冰预冷冰预冷STE STE （0.1mol/L 0.1mol/L NaClNaCl，10mmol/L 10mmol/L Tris-HClTris-HCl，1mmol/L EDTA1mmol/L EDTA，pH 8.0pH 8.0）。）。5000rpm5000rpm离心离心1515分钟，弃上清；分钟，弃上清；加加10ml10ml溶液溶液1 1（50mmol/L50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，25mmol/L 25mmol/L Tris-HClTris-HCl，10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA，pH8.0pH8.0）重悬
40、，混匀，冰浴）重悬，混匀，冰浴1010分钟；分钟；加入加入20ml20ml新配置的新配置的溶液溶液2 2（0.2mol/L NaOH,1%SDS0.2mol/L NaOH,1%SDS），混匀，冰浴），混匀，冰浴1010分钟；分钟；加入加入15ml15ml预冷的预冷的溶液溶液3 3（3.0mol/L 3.0mol/L KClKCl，pH 4.8pH 4.8），混匀，冰浴），混匀，冰浴1010分钟；分钟；10000rpm10000rpm离心离心1515分钟，弃沉淀；分钟，弃沉淀；加入等体积的预冷异丙醇，混匀，加入等体积的预冷异丙醇，混匀，-20-20沉淀沉淀1 1小时；小时；10000rpm100
41、00rpm离心离心1515分钟，弃上清，将沉淀置室温干燥；分钟，弃上清，将沉淀置室温干燥；用用3 ml TE3 ml TE（10mmol/L 10mmol/L Tris-HClTris-HCl，1mmol/L EDTA1mmol/L EDTA，pH 8.0pH 8.0）溶解沉淀；）溶解沉淀；加入加入3 ml3 ml冰预冷的冰预冷的5mol/L 5mol/L LiClLiCl溶液，充分混匀，溶液，充分混匀，10000rpm10000rpm离心离心1515分钟，弃沉淀；分钟，弃沉淀；上清中加入等体积冰预冷的异丙醇，充分混匀，上清中加入等体积冰预冷的异丙醇，充分混匀，10000rpm10000rpm
42、离心离心1515分钟，弃上清，将沉淀置室温干燥；分钟，弃上清，将沉淀置室温干燥；500l500l含含RNARNA酶（酶（20ug/ml20ug/ml）TETE（10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA，pH8.0pH8.0）溶解沉淀，转移到）溶解沉淀，转移到EppendorfEppendorf管中，室温放置管中，室温放置3030分钟；分钟；加入加入500l500l含含13%13%聚乙二醇聚乙二醇80008000的的1.6mol/L 1.6mol/L NaClNaCl，充分混匀，充分混匀，-20-20沉淀沉淀2 2小时；小时；于台式离心机上于台式离心机上12000rpm12000rp
43、m离心离心1010分钟，弃上清；分钟，弃上清；加入加入400l TE400l TE（pH8.0pH8.0）溶解沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次；）溶解沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次；转移水相至新的转移水相至新的EppendorfEppendorf管，加管，加100l 10M 100l 10M 乙酸铵，充分混匀；乙酸铵，充分混匀；加加2 2倍体积无水乙醇，倍体积无水乙醇，-20-20沉淀沉淀1 1小时；小时；12000rpm12000rpm离心离心1010分。用冰预冷的分。用冰预冷的70%70%乙醇洗涤沉淀一次，晾干；乙醇洗涤沉淀一次，晾干；50l TE50l TE（pH 8.0pH 8.
44、0）溶解沉淀，储存于）溶解沉淀，储存于-20-20冰箱。冰箱。质粒的大量提取质粒的大量提取聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法分子克隆步骤分子克隆步骤转化及感受态细胞转化及感受态细胞 目前常用的原核细胞转化方法有两类：目前常用的原核细胞转化方法有两类： 电穿孔转化法、化学转化法电穿孔转化法、化学转化法 电穿孔转化法属于物理方法，但由于受到仪器的限电穿孔转化法属于物理方法，但由于受到仪器的限制，实验室更常用的是化学转化法。制，实验室更常用的是化学转化法。 化学转化法原理：利用低温（化学转化法原理：利用低温（00）和）和CaClCaCl2 2低渗溶低渗溶液的处理，使宿主细胞处于容易吸收外源液的处理，使宿主
45、细胞处于容易吸收外源DNADNA的状态，的状态，即感受态（即感受态（competence cellcompetence cell）。此时菌体膨胀成球）。此时菌体膨胀成球形，细胞壁和膜的通透性增强。形，细胞壁和膜的通透性增强。DNADNA与与CaCa2+2+形成的羟形成的羟基基- -磷酸钙复合物黏附于菌体表面，磷酸钙复合物黏附于菌体表面，4242短暂热冲击短暂热冲击处理（热休克）后，黏附表面的重组处理（热休克）后，黏附表面的重组DNADNA被吸收进入被吸收进入宿主细胞，在营养丰富的培养基上生长宿主细胞，在营养丰富的培养基上生长1 1小时左右，小时左右，细胞形态复原，进入增殖分裂期。细胞形态复原，
46、进入增殖分裂期。挑取单菌落，接种无抗菌素的挑取单菌落，接种无抗菌素的LBLB培养基，培养基，3737摇床培养过夜。摇床培养过夜。次日按次日按1 1：100100转种新鲜转种新鲜LBLB培养基，继续摇床培养培养基，继续摇床培养2 2小时左右，至菌液小时左右，至菌液OD OD 600nm600nm值为值为0.4-0.60.4-0.6时停止培养。时停止培养。置冰上预冷置冰上预冷1010分钟，然后分钟，然后44、5000rpm5000rpm离心离心1010分钟，弃上清；分钟，弃上清；以以10ml10ml冰预冷的冰预冷的0.1mol/L CaCl0.1mol/L CaCl2 2重悬细胞，放置于冰浴中重悬
47、细胞，放置于冰浴中2020分钟；分钟；44、5000rpm5000rpm离心离心10min10min，弃上清；，弃上清；按每按每50ml50ml培养物加入培养物加入2ml2ml冰预冷的冰预冷的0.1mol/L CaCl0.1mol/L CaCl2 2的比例重悬细胞沉淀，的比例重悬细胞沉淀，再加入再加入15%15%体积灭菌甘油，混匀，然后分装于体积灭菌甘油，混匀，然后分装于EppendorfEppendorf管中，管中，-70-70低温低温冰箱中保存。冰箱中保存。感受态宿主菌的制备感受态宿主菌的制备氯化钙法氯化钙法 1前夜接种受体菌（DH5、DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜
48、； 2取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6； 3将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 54下3000g冷冻离心5分钟； 6弃去上清，加入1500l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 74下3000g冷冻离心5分钟 8弃去上清，加入750l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 94下3000g冷冻离心5分钟 10加入20l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11立即使用或迅
49、速置于-70C超低温保存。感受态宿主菌的制备感受态宿主菌的制备电转化法电转化法感受态宿主菌的制备感受态宿主菌的制备注意事项注意事项1 1细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞对数生长期的细胞（一般通过检测（一般通过检测OD600OD600来控制。来控制。DH5DH5 菌株菌株OD600OD600为为0.50.5时细胞密度是时细胞密度是5 510107 7/ml/ml）；）；2 2 所有操作均应在所有操作均应在无菌条件和冰上无菌条件和冰上进行；进行；3 3 经经CaClCaCl2 2处理的细胞，
50、在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，2424小时小时达到最高达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4 4 化合物及无机离子的影响：在化合物及无机离子的影响：在Ca2+Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如的基础上联合其他二价金属离子（如MnMn2+2+或或CoCo2+2+）、）、DMSODMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000100-1000
51、倍）；倍）；5 5 所使用的器皿必须所使用的器皿必须干净干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；效率；6 6 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的超螺旋的DNADNA；7 7 一定范围内，转化效率与外源一定范围内，转化效率与外源DNADNA的浓度呈正比；的浓度呈正比；转化（转化（transformation）转化的方法转化的方法化学的方法化学的方法( (热击法热击法) )：使用化学试剂（如：使用化学试剂（如CaClCaCl2 2）制）制备的感受态细胞，通过热
52、击处理将载体备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNADNA分子导分子导入受体细胞；入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体胞，通过高压脉冲的作用将载体DNADNA分子导入受体分子导入受体细胞。细胞。 取取100100 l l感受态细胞悬液感受态细胞悬液( (如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作) )，加入适，加入适量质粒量质粒DNADNA。将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min30min（1 1）抑制细胞的旺盛生理代谢；（）
53、抑制细胞的旺盛生理代谢；（2 2）有助于）有助于DNA-CaDNA-Ca2+2+吸附于细胞表面；（吸附于细胞表面；（3 3）防止）防止DNAaseDNAase降解降解DNADNA ，于，于4242水浴中保温水浴中保温1-2min1-2min使细使细胞摄入吸附于其表面的胞摄入吸附于其表面的DNADNA ，然后迅速冰上冷却，然后迅速冰上冷却2min2min。立即向上述管中分别加入。立即向上述管中分别加入0.4ml 0.4ml LBLB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.5ml0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于匀后
54、于3737振荡培养约振荡培养约60min60min，使受体菌恢复正常生长状态。，使受体菌恢复正常生长状态。各样品培养液各样品培养液0.1ml0.1ml，分别接种于含抗菌素，分别接种于含抗菌素LBLB平板培养基上，涂匀平板培养基上，涂匀。菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于3737恒温培养箱内培养过夜恒温培养箱内培养过夜(12-16(12-16小时小时) )，待，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。此时应该能
55、清楚地看到蓝色和白色菌落。转化步骤转化步骤转化结果分析转化结果分析噬菌体噬菌体噬菌体概述噬菌体概述噬菌体概述噬菌体概述噬菌体概述噬菌体概述 噬菌体的一般生物特性噬菌体的一般生物特性 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。除了对寄主的依赖性，还可可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。除了对寄主的依赖性，还可保护自己的核苷酸分子（保护自己的核苷酸分子（DNA/RNADNA/RNA）免遭环境化学物质的破坏免遭环境化学物质的破坏噬菌体噬菌体:基因组基因组DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong (left)armshort (right)armExogeno
56、us DNA(20-23 kb) phagephage12bp 溶菌阶段溶菌阶段 ( (复制和释放复制和释放) )噬菌体噬菌体溶源阶段溶源阶段噬菌体载体噬菌体载体Lytic phase(Replicate and release)Lysogenic phase (integrate into host genome)噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型 1.1.插入式载体插入式载体 一种只具有一种只具有一个一个可供外源可供外源DNADNA插入的克隆位点的载体。插入的克隆位点的载体。 2.2.替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体） 具有具有成对成对的克隆位点，
57、在这两个位点之间的的克隆位点，在这两个位点之间的DNADNA区段可以区段可以被外源插入的被外源插入的DNADNA片段所取代。片段所取代。插入式载体插入式载体 cIcI基因插入失活：基因插入失活：如如gt10gt10、NM1149NM1149等载体，在等载体，在cIcI基因上有基因上有EcoREcoR I I及及Hind IIIHind III的酶切位点。外源基因插入后将导致的酶切位点。外源基因插入后将导致cIcI基因的失活。基因的失活。 若不插入外源基因 溶源 混浊斑 若CI插入外源基因 溶菌 透明噬斑 cIEcoRI LA32.7RA10.6gt10lacZLA19.9RA21.9EcoRI
58、 Charon16A外源外源DNADNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体感染和复制非必要的片段取代噬菌体染色体中对于噬菌体感染和复制非必要的片段( (小小于于20kb20kb) )高感染效率高感染效率(10(109 9转化株转化株/ /ugug载体载体DNA, DNA, 比质粒高比质粒高100100倍倍) )替换型载体克隆外源替换型载体克隆外源DNADNA的步骤的步骤1.1.应用适当的核酸内切酶消化应用适当的核酸内切酶消化载体，载体， 除去可取代的除去可取代的DNADNA片段；片段；2.2.将上述所得的将上述所得的DNADNA载体臂同外源载体臂同外源 DNA DNA片段的连接；片段的连接；3.3.
59、对重组体的对重组体的DNADNA分子进行包装和增殖，分子进行包装和增殖， 以得到有感染性的以得到有感染性的重组噬菌体重组噬菌体体外包装体外包装 噬菌体噬菌体DNADNA体外重组后，先要在体外包装成噬菌体颗粒，然后以体外重组后，先要在体外包装成噬菌体颗粒，然后以噬菌体感染的方式将重组噬菌体感染的方式将重组DNADNA导入细胞内。导入细胞内。 体外包装需要用体外包装需要用包装提取物包装提取物，即噬菌体感染大肠杆菌的溶菌液。，即噬菌体感染大肠杆菌的溶菌液。这这种溶菌液含有噬菌体的空壳（头部），未吸附的尾部，和包装所需的种溶菌液含有噬菌体的空壳（头部），未吸附的尾部，和包装所需的噬菌体编码的蛋白质。噬
60、菌体编码的蛋白质。通过通过coscos位点相连成多聚体的位点相连成多聚体的DNADNA逐渐进入噬逐渐进入噬菌体头部，并在菌体头部，并在coscos位点处切开。然后噬菌体的尾部吸附到已填满的头位点处切开。然后噬菌体的尾部吸附到已填满的头部，从而完成了一个病毒颗粒的装配。部，从而完成了一个病毒颗粒的装配。 以感染方式导入细胞的频率可达以感染方式导入细胞的频率可达10106 6-10-108 8/gDNA/gDNA，而以转染方式导而以转染方式导入的频率仅为入的频率仅为10103 3-10-105 5/gDNA/gDNA。 噬菌体的包装限制为野生噬菌体噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNADNA（约约48
61、.5kb48.5kb）的的75%-105%75%-105%。M13M13噬菌体载体噬菌体载体 M13 M13是一种含是一种含ssDNAssDNA的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb6.4kb，90% 90% 以上以上的序列可编码蛋白质，共有的序列可编码蛋白质，共有1111个编码基因，基因之间间隔区多为几个碱基。较大的个编码基因，基因之间间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因间隔位于基因和和以及基因以及基因和和之间，其间有调节基因表达和之间，其间有调节基因表达和 DNA DNA 合成的元合成的元件。件。DNADNA为正链，按基因为正链，按基因至至方向
62、合成。方向合成。M13M13噬菌体基因组可编码噬菌体基因组可编码3 3类蛋白质，包括复制蛋白（类蛋白质，包括复制蛋白（，和和），形态发生），形态发生蛋白（蛋白（，和和），结构蛋白（），结构蛋白（、 和和 ）。）。M13M13单链单链DNADNA噬菌噬菌体的生命周体的生命周期期RF DNA M13 M13载体载体 这类载体主要用来获得大量的单链片段，主要用来测序这类载体主要用来获得大量的单链片段，主要用来测序（sangersanger双脱氧法）、基因的定点突变、异源双链双脱氧法）、基因的定点突变、异源双链DNADNA的分析等。的分析等。 具有具有MCSMCS，方便克隆。许多，方便克隆。许多M13
63、M13载体的载体的MCSMCS与质粒载体与质粒载体pUCpUC序列的序列的MCSMCS相同，相同，在克隆位点选择上更为方便。在克隆位点选择上更为方便。 M13M13子代噬菌体中总是只含有（）链，所以子代噬菌体中总是只含有（）链，所以M13M13载体克隆的外源载体克隆的外源DNADNA片片段在子代噬菌体中究竟是含有段在子代噬菌体中究竟是含有DNADNA分子中的哪条链，则完全取决于外源分子中的哪条链，则完全取决于外源克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源分子的两条链带克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的的方法就是定向克隆技术。来一定的麻烦，解决这一问题的
64、的方法就是定向克隆技术。 可以定向地克隆可以定向地克隆DNADNA片段，克隆在片段，克隆在M13 RF DNAM13 RF DNA分子上的双链分子上的双链DNADNA片段，到片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的双链，则需要两种独立的克隆。双链，则需要两种独立的克隆。M13M13载体系列的优点载体系列的优点这类载体基因组中有一条饰变的这类载体基因组中有一条饰变的LacZLacZ片段，插入了一段密集片段，插入了一段密集MCSMCS；M13M13载体系载体系列应用基因工程技术成对地构建，可有效克隆双链列应用基因工程技
65、术成对地构建，可有效克隆双链DNADNA分子中每一条链。分子中每一条链。单链单链DNADNA噬菌体载体噬菌体载体M13、f1、fd优越性：优越性：1.1.单链单链DNADNA噬菌体的复制，以双链环形的噬菌体的复制，以双链环形的DNADNA为媒介，这种复制形式的为媒介，这种复制形式的DNADNA简称简称RFDNARFDNA；2.2.不论是不论是RFDNARFDNA还是还是ssDNAssDNA都能感染大肠杆菌；都能感染大肠杆菌；3.3.单链单链DNADNA噬菌体颗粒的大小，是受其噬菌体颗粒的大小，是受其DNADNA的制约的，不存在包装限制问题，这一点正好的制约的，不存在包装限制问题，这一点正好与与
66、噬菌体相反。噬菌体相反。4.4.容易测定外源容易测定外源DNADNA片断的插入取向；片断的插入取向；5.5.可产生含外源片断的单链可产生含外源片断的单链DNADNA分子。分子。缺点：缺点：1.1.插入外源插入外源DNADNA后，遗传稳定性显著下降；后，遗传稳定性显著下降； 2.2.实际克隆能力小于实际克隆能力小于1500bp1500bp（虽无包装限制，并非无限包装）。（虽无包装限制，并非无限包装）。 质粒质粒受体细胞受体细胞结构结构插入片断插入片断举例举例 E.coliE.coli环状环状 8kb 8kbp pUCUC18/19 , T-18/19 , T-载体载体pGEMpGEM- - 3z
67、3z等等 噬菌体噬菌体E.coliE.coli线状线状9 - 24kb9 - 24kbEMBLEMBL系列，系列， gtgt系列系列丝状噬菌体及噬菌粒丝状噬菌体及噬菌粒E.coliE.coli环状环状 10 kb 10 kbM13mpM13mp系列系列粘粒载体粘粒载体E.coliE.coli环状环状35- 45kb35- 45kbpJB8,c2RB, pJB8,c2RB, pcoslEMBLpcoslEMBL, , pWE15/16, pWE15/16, pCVpCV BAC (Bacterial Artificial BAC (Bacterial Artificial ChroChromom
68、osome)some)细菌人工染色体（细菌人工染色体（BACBAC） E.coliE.coli环状环状300 kb300 kbPelPel oBACoBAC系列系列PAC (P1-derived Artificial PAC (P1-derived Artificial chromosome)chromosome)噬菌体噬菌体P1P1衍生的人工染色体衍生的人工染色体E.coliE.coli环状环状100 - 2000 kb100 - 2000 kbPCYPAC1PCYPAC1YAC (Yeast Artificial YAC (Yeast Artificial chromosome )chro
69、mosome )酵母细胞酵母细胞线性染色体线性染色体100 - 2000 kb100 - 2000 kbMAC (Mammalian Artificial MAC (Mammalian Artificial Chromosome)Chromosome)哺乳类细胞哺乳类细胞线性染色体线性染色体 1000 kb 1000 kb病毒载体病毒载体动物细胞动物细胞环状环状SV40 SV40 载体，昆虫载体，昆虫杆状病毒载体杆状病毒载体穿梭载体穿梭载体动物细胞动物细胞和细菌和细菌环状环状pSVK3pSVK3质粒，质粒，PBV,PBV,TiTi质粒质粒载体的种类和特征载体的种类和特征重组重组DNA技术相关概
70、念技术相关概念克隆克隆(clone)(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化（cloning），即，即无性繁殖无性繁殖。技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)(molecular clone)即即DNA DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）DNADNA克隆克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源或异应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源或异源、原核或真核、天然或人工源、原核或真核、天然或人工DN
71、ADNA）与载体）与载体DNADNA接合成一具有自我复制能接合成一具有自我复制能力的力的DNADNA分子分子复制子复制子( (repliconreplicon) )，继而通过转化或转染宿主细胞，筛，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNADNA分分子，也称子，也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA(recombinantDNA(recombinant DNA) DNA)。生物技术工程生物技术工程基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因工程（基因
72、工程（geneticengineering）实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程目的目的分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）重组重组DNADNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNADNADNA连接酶连接酶催化催化DNADNA中相邻的中相邻的5 5磷酸基和磷酸基和3 3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNADNA切口封合或使
73、两个切口封合或使两个DNADNA分子或片段连接分子或片段连接DNADNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNAcDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNADNA序列分析序列分析填补填补3 3末端末端KlenowKlenow片段片段又名又名DNADNA聚合酶聚合酶I I大片段，具有完整大片段，具有完整DNADNA聚合酶聚合酶I I的的5 53 3 聚合、聚合、3 35 5 外切活性，而无外切活性，而无5 53 3 外切活性。外切活性。常用于常用于cDNAcDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合
74、成cDNAcDNA替代替代DNADNA聚合酶聚合酶I I进行填补，标记或进行填补，标记或DNADNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定定义义：限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(restriction (restriction endonucleaseendonuclease, , RE)RE)是是识识别别DNADNA的的特特异异序序列列,
75、 , 并在识别位点或其周围切割双链并在识别位点或其周围切割双链DNADNA的一类内切酶。的一类内切酶。分类：分类：根据限制酶的结构根据限制酶的结构, ,辅因子的需求切位与作用方式，分为三种辅因子的需求切位与作用方式，分为三种型限制性内切酶型限制性内切酶: :既能催化宿主既能催化宿主DNADNA的甲基化，又催化非甲基化的的甲基化，又催化非甲基化的DNADNA的水解的水解型限制性内切酶型限制性内切酶: :只催化非甲基化的只催化非甲基化的DNADNA的水解（基因工程技术中常用）；的水解（基因工程技术中常用）； IIIIII型限制性内切酶型限制性内切酶: :同时具有修饰及认知切割的作用同时具有修饰及认
76、知切割的作用作用：作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNADNA，保护自身，保护自身DNADNA。平端切口平端切口粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHincGTCGACCAGCTGGACCTG+1：DH5a菌株菌株DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用在使用pUC系列质粒载体转化时，可系列质粒载体转化时，可与载体编码的与载体编码的-半乳糖苷酶氨基端实现半乳糖苷酶氨基端实现-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。互补。可用于蓝白
77、斑筛选鉴别重组菌株。基因型：基因型：F-，80dlacZM15，(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk)，phoA，supE44，-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3)菌株菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如启动子的表达载体（如pET系列）的基因。系列）的基因。T7噬菌体噬菌体RNA聚合酶位于聚合酶位于噬菌体噬菌体DE3区，该区整合于区，该区整合于BL21的染色体上，适合表达非毒性的染色体上，适合表达非毒性蛋白。蛋白。基因型：基因型：F-，ompT，hs
78、dS（rBB-mB），），gal，dcm（DE3）3：BL21(DE3)pLysS菌株菌株该菌株含有质粒该菌株含有质粒pLysS，具有氯霉素抗性。，具有氯霉素抗性。PLysS含有表达含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达，适合表达毒性和非毒性蛋白。的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达，适合表达毒性和非毒性蛋白。基因型：基因型：F-，ompThsdS（rBB-mB），），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr常用菌株常用菌株4：JM109菌株菌株该菌株在使用该菌株在使用pUC系列质粒载体进行系列质粒载体进行DNA转化
79、或用转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体载体进行转染时，由于载体DNA产生的产生的LacZa多肽和多肽和JM09编码的编码的LacZM15进行进行-互补，从而显示互补，从而显示-半乳糖苷酶活性，半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株由此很容易鉴别重组体菌株基因型：基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi1，hsdR17，supE44，relA1，（lacproAB）/FtraD36，proAB，lacIq，lacZM155：TOP10菌株菌株该菌株适用于高效的该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传基
80、因型：基因型：F-，mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)，80，lacZM15，lac74，recA1，ara139(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr)endA1，nupG6：HB101菌株菌株该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验基因型：基因型：supE44，hsdS20（rB-mB），），recA13，ara14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1常用菌株常用菌株以以质质粒粒为为载载体体的的DNA克克隆隆过过程程外源基因表达产量外源基因表达产量单位体积产量单位体积产量细胞浓度细胞浓度每个细胞平均表达产量每个细胞平均表达产量生长生长速率速率外外 源源 基基 因因拷贝数拷贝数表达产表达产物产量物产量外外 源源 基基 因因拷贝数拷贝数基因表基因表达效率达效率产物稳产物稳定性定性细胞代细胞代谢负荷谢负荷谢谢谢谢
