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1、第二节第二节 食品中细菌检验技术基础食品中细菌检验技术基础一、细菌的形态学观察一、细菌的形态学观察二、细菌的分离与培养技术二、细菌的分离与培养技术三、细菌的生化反应三、细菌的生化反应食品卫生细菌常规检验项目食品卫生细菌常规检验项目 卫生指标菌卫生指标菌大肠菌群测定大肠菌群测定菌落总数测定菌落总数测定 沙门氏菌检验沙门氏菌检验志贺氏菌检验志贺氏菌检验金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验溶血性链球菌检验溶血性链球菌检验致病菌致病菌1、细菌的显微镜检查、细菌的显微镜检查l显微镜：光学显微镜l放大倍数：101001000l镜头：油镜头l镜油：香柏油或石蜡油l香柏油折光率（n）与玻片折光率（n）接近l显
2、微镜使用完毕须擦拭镜头。一、细菌形态学检查一、细菌形态学检查（1）不染色标本检查）不染色标本检查l应用：主要用于观察活菌的动力和形态l常用方法：压滴法、悬滴法载玻片载玻片细菌悬液细菌悬液盖玻片盖玻片压滴法压滴法接种环取细菌接种环取细菌菌悬液菌悬液23环环镊子取盖玻片镊子取盖玻片覆盖于菌液上覆盖于菌液上载玻片中央载玻片中央注意注意：使盖玻片先接触菌液，缓慢放下，避：使盖玻片先接触菌液，缓慢放下，避 免产生气泡免产生气泡镜检镜检悬滴法悬滴法取一凹玻片，在凹取一凹玻片，在凹窝周围涂凡士林窝周围涂凡士林盖玻片中央放盖玻片中央放1环菌液环菌液凹玻片倒置于盖玻片，凹凹玻片倒置于盖玻片，凹窝到准盖玻片中央菌
3、液窝到准盖玻片中央菌液反转盖玻片，轻压，使其反转盖玻片，轻压，使其与凹窝边缘黏紧与凹窝边缘黏紧有鞭毛的菌，可看到其移动有鞭毛的菌，可看到其移动（2）染色标本的检查）染色标本的检查染色方法的种类l单染法单染法:采用一种染料染色l复染法复染法（鉴别染色）:采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使不同种类的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上不同的颜色，以便鉴别细菌。染色标本检查的基本程序染色标本检查的基本程序l涂片干燥固定染色涂片方式：菌液、菌苔干燥的方法：自然干燥、外焰烘干固定的方法、目的染料种类：碱性染料、酸性染料、中性染料，碱性染料最常用复染法基本程序复染法基本程序l初染媒染脱色复染革兰染
4、色法（革兰染色法（Gram染色）染色）l染液组成： 结晶紫染液、卢戈碘液、95乙醇、稀释复红l染色方法：结晶紫结晶紫 初染初染卢戈碘液卢戈碘液 媒染媒染95乙醇乙醇 脱色脱色稀释复红稀释复红 复染复染1分钟分钟30S1min1分钟分钟影响革兰染色的关键步骤是影响革兰染色的关键步骤是脱色脱色革兰染色结果革兰染色结果l紫色革兰阳性菌l红色革兰阴性菌革兰阴性菌革兰阴性菌革兰阳性菌革兰阳性菌革兰染色意义革兰染色意义有助于鉴别细菌有助于选择用药有助于了解细菌的致病性影响革兰染色的因素影响革兰染色的因素l操作因素操作因素 涂片的厚薄 脱色时间的长短l染液因素染液因素 卢戈碘液放置时间过长 95乙醇挥发 结
5、晶紫与草酸铵混合时间太长l细菌因素细菌因素 细菌种类 细菌菌龄抗酸染色抗酸染色l用于区别抗酸菌与非抗酸菌细菌特殊染色细菌特殊染色白喉杆菌异染粒 伤寒杆菌 负染色法负染色法肺炎链球菌荚膜负染色2、微生物直接计数、微生物直接计数l仪器：血细胞计数板 l菌种：酿酒酵母 l原理原理：利用血细胞计数板在显微镜下直接计数，常用的微生物计数法。将经过适当稀释的菌悬将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在计数板载玻片与盖玻片液（或孢子悬液）放在计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下计数。之间的计数室中，在显微镜下计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目微生物数目来换算成来换算成单位体积单位体积内的微生物
6、总数目内的微生物总数目。l优点：直观、快速。l缺点：计得的是活菌体和死菌体的总和，又称为总菌计数法。每个大方格中的小方格数相同，即每个大方格中的小方格数相同，即1625=400小方格小方格 每个计数室选每个计数室选5个（或个（或4个）中格中的菌体进行计数。个）中格中的菌体进行计数。 1mL菌液的菌数菌液的菌数=每小格内菌数每小格内菌数4106稀释倍数稀释倍数 （一）培养基（一）培养基l常用玻璃器材的准备l培养基的成分和作用l培养基的种类l培养基的制备二、细菌的培养与分离技术二、细菌的培养与分离技术常用玻璃器材的准备常用玻璃器材的准备l玻璃器材的种类及用途l玻璃器材的清洗新购置的：12盐酸浸泡清
7、水清洗用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷清水清洗l细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷盛培养基试管和平皿：高压灭菌趁热倒出洗涤剂洗刷清水冲洗吸管：3来苏浸泡清水冲洗玻片和盖玻片：3来苏和清洁液浸泡清水冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗涤含油脂的器皿：单独灭菌培养基的成分和作用培养基的成分和作用l培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。l营养物质：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类l水l凝固剂：琼脂、明胶l抑制剂l指示剂培养基的种类培养基的种类（按用途分类按用途分类）l基础培养基基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板l营养培养基营养培
8、养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板l鉴别培养基鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培养基（KIA）l选择培养基选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目的菌，如SS平板l增菌培养基增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。l厌氧培养基厌氧培养基：用于培养厌氧菌培养基的种类培养基的种类（按物理性状分类按物理性状分类）l液体培养基液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。l半固体培养基半固体培养基：含琼脂，用于观察细菌的动力。l固体培养基固体培养基：含2琼脂，多用于细菌的分离培养。培养基制备的一般程序培养基制备的一般程序调配调配
9、溶化溶化矫正矫正pH过滤澄清过滤澄清分装分装灭菌灭菌检定检定培养基灭菌培养基灭菌 基础培养基：基础培养基：121高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌15分钟分钟 含糖培养基：含糖培养基：113 灭菌灭菌15分钟分钟 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天天3次次 不耐高温的液体成分：滤过除菌不耐高温的液体成分：滤过除菌保存保存培养基培养基pH测定及矫正测定及矫正 材料：l待测培养基、l标准比色管、4孔比色架、酚红、l氢氧化钠、1mol/L） l盐酸（、1mol/L）l蒸馏水l试管（与比色管口径一致）、l刻度吸管（5ml、1ml、）、（二）细菌的接种与培养（二）细菌的接种与培养l无菌技术l
10、细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。l无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。l细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌l标本的采集l无菌试管、烧瓶的使用细菌接种的基本程序细菌接种的基本程序灭菌接种环灭菌接种环沾取标本沾取标本接种接种灭菌接种环灭菌接种环杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境细菌接种法细菌接种法l平板划线接种法平板划线接种法： 目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。 方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本l液体培养基接种
11、法液体培养基接种法l穿刺接种法穿刺接种法 :用于观察细菌动力用于观察细菌动力l斜面接种法斜面接种法 l倾注培养法倾注培养法:用于细菌计数分区划线法分区划线法第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环连续划线法连续划线法细菌培养法细菌培养法l一般培养（需氧培养）：培养温度：37（采用恒温培养箱）培养时间：1824hl厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等细菌在细菌在固体固体培养基中的生长现象培养基中的生长现象l菌落定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：
12、大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）l菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。细菌在细菌在液体液体培养基中的生长现象培养基中的生长现象l混浊l沉淀：多见于链状排列的细菌l菌膜：多见于厌氧菌细菌在细菌在半固体半固体培养基中的生长现象培养基中的生长现象l有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。l无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。菌菌 落落菌落与菌苔菌落与菌苔细菌在液体培养基中的生长现象细菌在液体培养基中的生长现象细菌在半固体培养基中的生长现象细菌在半固体培养基中的生长现象有动力有动力 现象现象无动力无动力 现象现象
