基因克隆及克隆基因的表达

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1、LOGO吉林大学白求恩医学院吉林大学白求恩医学院分子生物学教研室分子生物学教研室讲讲师师孙孙巍巍Tel:0431-856193692012-10基因克隆、基因克隆、克隆基因的表达克隆基因的表达LOGO荧光蛋白基因克隆猫科学家复活冰冻死老鼠修正基因蚊子防控疾病基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛基因克隆胚芽造就健康婴儿基因克隆趣闻基因克隆趣闻LOGO荧光蛋白基因克隆猫荧光蛋白基因克隆猫具有荧光蛋白基因的克隆具有荧光蛋白基因的克隆猫在紫外线照射下会变色猫在紫外线照射下会变色由韩国科学技术部公布的对比由韩国科学技术部公布的对比照片显示出照片显示出3只具有荧光蛋白只具有荧光蛋白基因的克隆猫（上图为普通光基因的克

2、隆猫（上图为普通光线照射下，下图为紫外线照射线照射下，下图为紫外线照射下）下）LOGO科学家复活冰冻死老鼠科学家复活冰冻死老鼠一只老鼠死亡后被冷冻了一只老鼠死亡后被冷冻了1616年之久年之久, ,日本科学家从其体内日本科学家从其体内提取基因克隆了一只新老鼠提取基因克隆了一只新老鼠, ,这这是人类首次成功克隆冷冻动物。是人类首次成功克隆冷冻动物。LOGO修正基因蚊子防控疾病修正基因蚊子防控疾病科学家把一种可防疟疾的科学家把一种可防疟疾的基因植入蚊子基因之中基因植入蚊子基因之中,对蚊子对蚊子基因进行修正。基因进行修正。在实验中在实验中,科学家们不仅仅科学家们不仅仅在蚊子体内植入了防疟疾基因在蚊子体

3、内植入了防疟疾基因,还植入了另一种可以使蚊子眼还植入了另一种可以使蚊子眼睛发出荧光的基因。这样睛发出荧光的基因。这样,科学科学家就可以很容易识别它们。家就可以很容易识别它们。LOGO基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛2007年年,英国科学家在实验室英国科学家在实验室中利用基因转换技术成功地在蝌蚪中利用基因转换技术成功地在蝌蚪头部培育出第三颗眼球。这个消息头部培育出第三颗眼球。这个消息对盲人来说是一个天大的喜讯。利对盲人来说是一个天大的喜讯。利用这种技术用这种技术,干细胞科学家们真的干细胞科学家们真的有可能实现他们再造眼球的梦想。有可能实现他们再造眼球的梦想。LOGO基因克隆胚

4、芽造就健康婴儿基因克隆胚芽造就健康婴儿基因的秘密随着科技的日益发达而基因的秘密随着科技的日益发达而被逐渐揭开。血友病、色盲、白化被逐渐揭开。血友病、色盲、白化病病这些遗传病困扰着一个又一这些遗传病困扰着一个又一个家庭，也激励着一代又一代科学个家庭，也激励着一代又一代科学家为之奋斗。家为之奋斗。LOGO分子生物学关键的技术突破：分子生物学关键的技术突破：DNA重组技术重组技术1972年，年，世界上第一个重组世界上第一个重组DNA分子诞生分子诞生PaulBergabiochemistryatStanford猿猴病毒猿猴病毒DNA 噬菌体噬菌体DNA限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶D

5、NA连接酶连接酶重组重组DNA分子分子1980年，年，获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖LOGO克隆：通过克隆：通过无性繁殖无性繁殖无性繁殖无性繁殖过程所产生的与亲代过程所产生的与亲代完全相同完全相同完全相同完全相同的子代群体。的子代群体。moleculeCell colonyorganismDNA clone基因克隆基因克隆: : 是指来自不同生物的是指来自不同生物的基因基因基因基因同有自主复制同有自主复制能力的能力的载体载体载体载体DNADNADNADNA在在体外体外体外体外人工连接，构建成新的人工连接，构建成新的重组重组重组重组DNADNADNADNA，然后送入受体生物中去表达，从而，然后送入

6、受体生物中去表达，从而产生遗传物质转移和重新组合。产生遗传物质转移和重新组合。 LOGO一、目的一、目的DNA的的分分离获取（分）；离获取（分）；二、载体的选二、载体的选择择与准备（择）；与准备（择）；三、目的三、目的DNA与载体连与载体连接接（接）；（接）；四、重组四、重组DNA转转入受体细胞（转）；入受体细胞（转）；五、重组体的五、重组体的筛筛选与鉴定（筛）。选与鉴定（筛）。DNA克隆的过程包括五个基本部分：克隆的过程包括五个基本部分：LOGO一、一、目的目的DNA的分离获取（分）的分离获取（分）分离获取目的分离获取目的DNA有多种方法：有多种方法：(一一) PCR待扩增目的基因两端序列已

7、知待扩增目的基因两端序列已知（据此设计引物）（据此设计引物）(二二) 基因文库基因文库先构建，后筛选先构建，后筛选(三三)化学合成法化学合成法直接合成目的直接合成目的DNA（序列已知、片段较（序列已知、片段较短）短）LOGO随机打碎：随机打碎：物理方法物理方法 缺点：难以重复；获得的缺点：难以重复；获得的DNADNA量少等。量少等。LOGO限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现的发现1970年，年，第一个限制性核酸内切酶第一个限制性核酸内切酶定点定点定点定点剪切剪切DNA操作操作DNA1978年，年，获诺贝尔生理学或医学奖获诺贝尔生理学或医学奖限限制性核酸内切酶制性核酸内切酶用于切割用于切割D

8、NALOGO限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 Restriction endonucleasel可分为可分为、型，分子生物学中通常使用的是型，分子生物学中通常使用的是型型：能在能在DNA双链内部的双链内部的特异特异位点识别并切割位点识别并切割DNA，“分子剪刀分子剪刀”GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H核酸水解酶，裂解磷酸二酯键。核酸水解酶，裂解磷酸二酯键。LOGO型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：1. 具有特定的识别和切割位点具有特定的识别和切割位点 限制性内切酶限制性内切酶识别位点识别位点限制性内切酶限制性内切酶识别位点识别位点

9、Apa IGGGCCCCCCGGGSma ICCCGGGGGGCCCBamH IGGATCCCCTAGGSau 3A IGATCCTAGPst ICTGCAGGACGTCNot IGCGGCCGCCGCCGGCGEcoR IGAATTCCTTAAGSfi IGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG II型限制性内切酶的识别位点举例（型限制性内切酶的识别位点举例（示切割位点）示切割位点） 识别位点通常为识别位点通常为6或或4碱基序列碱基序列LOGO2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） 两条核苷酸链中，从两条核苷酸链中，从5到到3

10、方向的核苷酸序列完全一致方向的核苷酸序列完全一致型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：LOGO3. 切割双链切割双链DNA分子后产生黏端或平端分子后产生黏端或平端Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口黏端切口黏端切口（sticky end） （blunt end） 型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：LOGO粘性末端又可分为两种：粘性末端又可分为两种：1 1）5 5 - -端突出端突出2 2）3 3 - -端突出端突出CTGCAOH G

11、GHOACGTC5 3 5 3 -5 5 -PstICTGCAGCACGTC5 5 3 3 GOH AATTC.CTTAAHOG5 3 -5 5 -5 3 EcoRIGAATTCCTTAAG5 3 5 3 LOGO4. 不同的酶可以产生同样的末端不同的酶可以产生同样的末端 同尾酶同尾酶（isocaudarner）：）：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。这两个相同的黏端称为配伍末端这两个相同的黏端称为配伍末端(compatible end)。

12、Bam Bam HHBgBg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A互连后？互连后？型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：LOGO5. 不同的酶可以识别同一个序列不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶）或同裂酶能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。 GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bs

13、tCCCGGGGGGCCCCCCCGGCCGGG G+XmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+Sma为为DNA操作增加了酶的可选余地操作增加了酶的可选余地型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：LOGO6. 切割会受其他因素的影响切割会受其他因素的影响l 通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。l 缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。如，如，EcoR I在正常情况下识别在正常情况下识别“-GAATTC-”序列，但在甘油序列，但在甘油浓度大于浓度大于5%

14、（v/v）或反应温度较低时识别序列可变为）或反应温度较低时识别序列可变为“-AATT-”或或“-嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶-”，这种现象称为，这种现象称为星号星号星号星号活性活性活性活性（star activitystar activity），以），以EcoR I*表示。表示。型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：LOGOM6. 切割会受其他因素的影响切割会受其他因素的影响5.不同的酶可以识别同一个序列不同的酶可以识别同一个序列 4. 不同的酶可以产生同样的末端不同的酶可以产生同样的末端 3. 切割双链切割双链DNA分子后产生黏端或平端分子后产生黏端或平

15、端2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） 1. 具有特定的识别和切割位点具有特定的识别和切割位点 型限制性内切酶具有一些共性和特性：型限制性内切酶具有一些共性和特性：在在DNA双链内部的特异位点识别并切割双链内部的特异位点识别并切割DNALOGO文库法：文库法：一个细胞只接受一个一个细胞只接受一个重组重组DNA分子分子一般一个载体只携带一般一个载体只携带一段外源一段外源DNA 单克隆单克隆LOGO基因组基因组DNADNA文库（文库（genomic DNA librarygenomic DNA library）：）：包含某一个生物细胞或组织全

16、部基因组包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNADNA序列的随机克序列的随机克隆群体，以隆群体，以DNADNA片段的形式贮存了所有的基因组片段的形式贮存了所有的基因组DNADNA信息。信息。如何从文库中钓取基因？如何从文库中钓取基因？LOGO 用用带有标记的带有标记的、已知序列的核酸片段已知序列的核酸片段 (单链单链RNA或或DNA)作为作为探针探针，与待测，与待测DNA或或RNA 样品进行核酸分子杂交，样品进行核酸分子杂交，来检测被测样品中来检测被测样品中是否有与探针序列同源的目标序列，以及目是否有与探针序列同源的目标序列，以及目标序列的量。标序列的量。LOGO转膜、转膜、变性、变性、封闭、

17、封闭、加入变性的探针、加入变性的探针、杂交、杂交、洗涤、洗涤、检测杂交体。检测杂交体。LOGO如何实现特异性的获得目的基因？如何实现特异性的获得目的基因？LOGO聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction, PCR体外高效体外高效特异性特异性的扩增目的的扩增目的DNA片段片段LOGOLOGOLOGOLOGOLOGO1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DN

18、A加倍LOGOLOGOTaq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性( ( ( (% % % %) ) ) )温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 LOGO7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环LOGOPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0 0.1 12ug2ugTaqTaq DNA DNA聚合酶聚合

19、酶 2 2.5u5uMgMg2+ 2+ 1 1.5mmol/L5mmol/LLOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNALOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点50引物1引物2DNA引物LOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRP

20、CR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶LOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点第1轮结束95第2轮开始LOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点72TaqTaqTaqTLOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vPCRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点72第2轮结束LOGOPCRPCR的基本原理的基本原理vPCRPCR反应条件反应条件vP

21、CRPCR过程过程vPCRPCR的特点的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增LOGOPCR Primer DesignlPCR反应中有两条引物，即反应中有两条引物，即5引物和引物和3引物。引物。553355First cycleATG TAAATG TAA33Targetsequence下游引物、下游引物、3 引物、引物、antisense primer上游引物、上游引物、5 引物、引物、Sense primerl 引物设计的引物设计的总原则总原则总原则总原则提高引物与模板结合的特异性提高引物与模板结合的特异性提高引物与模板结合的特异性提高引物与模板结合的

22、特异性。l PCR反应扩增的就是一对引物之间的反应扩增的就是一对引物之间的DNA片段，片段，PCR反应反应成功扩增的关键在于引物的正确设计。成功扩增的关键在于引物的正确设计。LOGOPCR引物设计的基本原则：引物设计的基本原则：1.引物与模板的序列要紧密互补。引物与模板的序列要紧密互补。2.引物自身、引物之间不应存在互补序列。引物自身、引物之间不应存在互补序列。3.引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发PCR。LOGO 长度：长度：特异性序列一般特异性序列一般15-18bp15-18bp。 碱基分布：碱基分布： 引物方向：引物方向：5 5 33 引引物物的的3 3 端端：

23、是是DNADNA延延伸伸的的起起点点，一一定定要要严严格格与与模模板板DNADNA配对。配对。 引物的引物的5 5 端端：可以加非特异性序列：可以加非特异性序列, ,如酶切位点等。如酶切位点等。 同同源源性性比比较较：引引物物与与非非特特异异扩扩增增序序列列的的同同源源性性不不要要超过超过70%70%或有连续或有连续8 8个互补碱基同源。个互补碱基同源。 PCR引物设计的具体方法：引物设计的具体方法：尽量随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象。尽量随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象。GCGC比在比在45-55%45-55%。33和和55引物具有相似的引物具有相似的TmTm值。值。Tm=4(G+

24、C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T)。LOGOPCR引物的设计实例引物的设计实例已知已知IFN- cDNA序列如下序列如下, 该如何设计该如何设计PCR引物？引物？LOGOatgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagt3535上游引物结合上游引物结合cttctcgtagggtcatt下游引物结合下游引物结合设计引物时设计引物时: 特异性序列：特异性序列：5引物照抄，引物照抄，3引物互补倒读，引物互补倒读，即：即： 5引物与位于待扩增片段引物与位于待扩增片段5上游的一小段上游的一小段DNA序列相同序列相同; 3引物与扩增片段引物与扩增

25、片段3端的一小段端的一小段DNA序列互补。序列互补。 酶切位点酶切位点加在引物的加在引物的5；调调GC含量的碱基含量的碱基放在最前边；放在最前边； 此外，无发夹结构、与基因组其它区域的同源性较差。此外，无发夹结构、与基因组其它区域的同源性较差。LOGOSense primer: 5CGCAGCGGATCC ATG AAATATACAAGT315 bpGC=12 AT=15Anti-Sense primer:5ATCGGAATTC TTA CTGGGATGCTCTTC317 bpBamHI start codonGC=12 AT=15EcoRI stop codon引物的方向是引物的方向是5 3

26、 ：atgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagt3535上游引物结合上游引物结合cttctcgtagggtcatt下游引物结合下游引物结合LOGO琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳AgarosegelElectrophoresisPCR产物中产物中只含有只含有目的目的DNA片段吗？片段吗？MLOGO二、二、载体的选择与准备（择）；载体的选择与准备（择）；载体（载体（vectorvector）：携带外源）：携带外源DNADNA，实现外源，实现外源DNADNA在受体细胞中在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些的无性繁殖或表达有意义的蛋白质

27、所采用的一些DNADNA分子。分子。 1.按功能按功能克隆载体（克隆载体（cloning vector）表达载体（表达载体（expression vector） 2.按基本元件按基本元件的来源的来源分类：分类：质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体黏粒载体黏粒载体病毒载体病毒载体人工染色体载体等人工染色体载体等LOGO二、二、载体的选择与准备（择）；载体的选择与准备（择）；（一）根据（一）根据DNA克隆的克隆的目的目的选择与准备适宜载体选择与准备适宜载体1. 获得目的获得目的DNA片段片段选用选用克隆载体克隆载体；2. 获得目的获得目的DNA片段所编码的片段所编码的蛋白质蛋白质选用选用表达载体表

28、达载体。（二）考虑目的（二）考虑目的DNA的的大小大小及受体细胞的种类和来源及受体细胞的种类和来源载体体插入插入DNADNA片段片段宿主宿主细胞胞质粒粒510 kb细菌，酵母菌，酵母噬菌体噬菌体载体体 20 kb细菌菌黏粒黏粒50 kb细菌菌BACBAC400 kb细菌菌YACYAC3Mb酵母酵母（三）含有合适的（三）含有合适的MCSLOGO克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖（一）克隆载体（一）克隆载体（cloning vector）应具备的主要特点应具备的主要特点1.1.至少有一个至少有一个复制起点复制起点（origin of replication, o

29、rigin of replication, oriori）2.2.至少有一个至少有一个选择性标志选择性标志（selection markerselection marker）3.3.有适宜的限制性内切酶的单一切点：有适宜的限制性内切酶的单一切点：多克隆位点多克隆位点（multiple multiple cloning sitescloning sites，MCSMCS）4.4.应有较高的拷贝数应有较高的拷贝数pBR322pBR322质粒图谱质粒图谱 LOGO克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类（二）常用克隆载体的种类1.1.质粒质粒(p

30、lasmid)(plasmid)是最常用的克隆载体是最常用的克隆载体l广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中l独立于宿主细胞染色体外的环状双链的超螺旋结构独立于宿主细胞染色体外的环状双链的超螺旋结构l能在宿主细胞内能在宿主细胞内独立自主复制独立自主复制l带有某些遗传信息带有某些遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些会赋予宿主细胞一些遗传性状遗传性状l质粒的不相容性质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。LOGO目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，可容纳目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，可容纳10kb1

31、0kb以内的外源以内的外源DNA DNA 。pUC18/19pUC18/19质粒图谱质粒图谱pUC18/19pUC18/19质粒质粒，2686bp2686bp，是最常用的质粒载体，是最常用的质粒载体缺乏控制拷贝数的缺乏控制拷贝数的roprop基因，因此其拷贝数达基因，因此其拷贝数达500-700 500-700 LOGOT-T-载体：载体：pMD18-T2692bpAmpicillinresistanceoriginHindIIISplnPstIHincIIAccISalIXbalBamHISmaIXmaIKpnISacIEcoRISp6T7LacZTTLOGO克隆载体用于外源克隆载体用于外源

32、DNA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类（二）常用克隆载体的种类2.2.噬菌体噬菌体(phage)(phage)能感染细菌的病毒能感染细菌的病毒（1 1）噬菌体噬菌体DNADNA改造系统改造系统coscos位点位点: :两端各有一条由两端各有一条由1212个碱基组成、彼此完全互补且个碱基组成、彼此完全互补且55突出的序突出的序列列插入型：插入型：gtgt系列，适用于系列，适用于cDNAcDNA克隆克隆置换型：置换型：EMBLEMBL系列，适用于基因组系列，适用于基因组DNADNA克隆克隆线性双链线性双链DNADNA分子分子coscos12bp12bp48500bpNone

33、ssentialportionforreplicationLong(left)armShort(right)arm（2 2）M13M13噬菌体噬菌体DNADNA改造系统（含改造系统（含lacZlacZ基因）基因）单链闭合环状单链闭合环状DNADNA分子分子LOGO克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类（二）常用克隆载体的种类3.3.穿梭载体穿梭载体(shuttle vector)(shuttle vector) 可在不同宿主细胞中应用可在不同宿主细胞中应用人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源

34、DNADNA序列在不同种类序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。宿主细胞中复制、扩增。例如，既能在原核生物中复制例如，既能在原核生物中复制, ,又能在真核生物中复制的载体。又能在真核生物中复制的载体。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因；还有真这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因；还有真核生物的自主复制序列及选择标记性状；具有多克隆位点。核生物的自主复制序列及选择标记性状；具有多克隆位点。通常穿梭载体：在细菌中用于克隆（扩增克隆的基因），通常穿梭载体：在细菌中用于克隆（扩增克隆的基因）， 在酵母菌中用于基因表达分析。在酵母菌中用于基因表达分析。LOGO表达表达载体用于外源

35、载体用于外源DNA的的表达表达 表达载体（表达载体（expression vectorexpression vector）：用来在宿主细胞中）：用来在宿主细胞中表达外源基因表达外源基因的载体的载体 依据其宿主细胞的不同可分为依据其宿主细胞的不同可分为: : 原核原核表达载体（表达载体（prokaryotic expression vectorprokaryotic expression vector） 真核真核表达载体（表达载体（eukaryotic expression vectoreukaryotic expression vector） LOGO三、目的三、目的DNA与载体连接（接）与载

36、体连接（接）T4DNA LOGOLigation EcoRIEcoRIREdigestion VectorEcoRIVectorREdigestion RecombinantvectorRecombinantvectorRecombinantvectorEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRI 单酶消化的粘性末端连接单酶消化的粘性末端连接：连接效率高连接效率高; ; 载体需去磷酸载体需去磷酸; ;双向连入载体双向连入载体LOGOVectorSmaIHeaIIISmaIREdigestionREdigestionVectorLigationHelfofsmaIRecombinantve

37、ctorSmaIHelfofHeaIIIRecombinantvectorSamIHelfofsmaIHelfofHeaIII 平头末端连接平头末端连接：连接效率低连接效率低双向连入载体双向连入载体自身环化率高自身环化率高LOGOTargetgeneEcoRIBamHIEcoRIBamHIVectorVectordigestiondigestionLigation VectorEcoRIBamHI 双酶消化的粘性末端连接：双酶消化的粘性末端连接：连接效率高连接效率高; ;定向连接定向连接. LOGOVectorEcoRVEcoRVdigestionVectorTaqDNApolymerased

38、TTPT-Vector55 TT55AAPCRproductRecombinantvectorAATTPCRproductLigation T-A T-A粘性末端连接粘性末端连接：连接效率高连接效率高双向双向连入载体连入载体 自身环化率自身环化率LOGO四、重组四、重组DNA转入宿主细胞进行扩增（转）转入宿主细胞进行扩增（转）宿主细胞宿主细胞感受态细胞（感受态细胞（competent cell）：）：处于易于接纳外源物质的状态的细菌处于易于接纳外源物质的状态的细菌LOGO转化转化（transformation） 质粒或黏粒质粒或黏粒细菌细菌 质粒质粒酵母酵母（真核细胞）（真核细胞）转染转染（t

39、ransfection） 外源外源DNA真核细胞（酵母除外）真核细胞（酵母除外）感染感染（infection） 噬菌体颗粒噬菌体颗粒细菌细菌 病毒颗粒病毒颗粒哺乳细胞哺乳细胞几个相关概念：几个相关概念：LOGO将重组将重组DNA转入受体细胞的常用方法：转入受体细胞的常用方法：化学法：化学法： 氯化钙法氯化钙法物理法：物理法： 电击法电击法 显微注射法显微注射法 等等LOGO氯化钙化学转化法氯化钙化学转化法LOGO电击法电击法利用瞬间高压在细胞上打孔利用瞬间高压在细胞上打孔LOGO显微注射法显微注射法LOGORecombinantvectorRecombinantvectorRecombinan

40、tvectorRecombinantvector连接产物连接产物感受态细胞：感受态细胞：E.coliLigationmixtureintroduce plasmid into introduce plasmid into E.coliE.coli cells cellsTransfer onto Transfer onto agar plateagar LOGO筛选出含有筛选出含有重组重组DNA(目的基因目的基因+载体载体)的克隆的克隆转化后的克隆群体：转化后的克隆群体：LOGO五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）1. 抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选2. 蓝白筛选蓝白筛选3.

41、 限制性内切酶法限制性内切酶法4. PCR法法5. DNA测序法测序法主要方法：主要方法：LOGO五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）细胞在含有相应抗生素的培养基中培养：细胞在含有相应抗生素的培养基中培养：无载体转入的细胞无载体转入的细胞dead；含有载体的细胞；含有载体的细胞alive。1. 利用利用抗生素抗性标志抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子可筛选出带有载体的重组子尚需进一步鉴定载体是否为含有目的尚需进一步鉴定载体是否为含有目的DNA的重组载体的重组载体LOGOIPTGBlue-whitescreeningofrecombinants诱导物诱导物 半乳糖苷酶半乳

42、糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶LacOperon?在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）2. 蓝白筛选蓝白筛选 LOGOBluecolonyIPTGX-gal蓝色蓝色吲哚产物吲哚产物 半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶X-gal BLOGO如如果果外外源源基基因因插插入入位位于于LacZ基基因因内内部部的的多多克克隆隆酶酶切切位位点点，则不不能能通通过-互互补编码-半半乳乳糖糖苷苷酶酶，菌落呈菌落呈白色白色白色白色。-互互补菌株菌株菌株菌株带有带有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端端的编码序列的编码

43、序列载体质粒载体质粒载体质粒载体质粒带有带有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端端的编码序列的编码序列蓝白白筛选的基本原理：的基本原理：-半乳糖苷半乳糖苷酶酶可分解培养物中的可分解培养物中的X-gal，使其呈使其呈蓝蓝色色色色。LOGO3. 限制性内切酶法限制性内切酶法：根据限制酶切图谱筛选特定根据限制酶切图谱筛选特定DNA五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）Linearvector(2700bp)insert(300bp) M 空质粒空质粒 重组质粒重组质粒NcoIHindIII2700bp300bp提取阳性克隆的重组提取阳性克隆的重组DNARE消化消化电泳电泳有无有无DNA片

44、段的插入；片段的插入；插入片段的大小插入片段的大小连接前用什么酶，连接前用什么酶，就用什么酶切就用什么酶切LOGO可明确序列和阅读框的正确性可明确序列和阅读框的正确性 5. 核苷酸序列测定核苷酸序列测定是最准确的鉴定目的是最准确的鉴定目的DNA的方法的方法 五、重组体的筛选与鉴定（筛）五、重组体的筛选与鉴定（筛）l利用序列特异性引物，可鉴定阳性克隆。利用序列特异性引物，可鉴定阳性克隆。l如利用克隆位点两侧序列设计引物进行如利用克隆位点两侧序列设计引物进行PCR，再结合序列分析，能，再结合序列分析，能可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。

45、4. PCR法法：直接鉴定目的：直接鉴定目的DNA的存在的存在LOGO基因工程（基因工程（genetic engineering）重组重组DNA技术（技术（recombinant DNA technology）分子克隆（分子克隆（molecular cloning）DNA克隆（克隆（DNA cloning）基因克隆（基因克隆（gene cloning) 基因操作（基因操作（Gene manipulation ）Short Summary of gene cloning：LOGOShort Summary of gene cloning： 是指进行制备是指进行制备DNA片段，并通过载体将其片段，

46、并通过载体将其导入受体细胞，在受体导入受体细胞，在受体细胞中复制、扩增，以细胞中复制、扩增，以获得获得单一单一单一单一DNA分子分子大量大量大量大量拷贝的过程。拷贝的过程。What？How？MLOGOWhy？“获得单一获得单一获得单一获得单一DNADNA分子的大量拷贝分子的大量拷贝分子的大量拷贝分子的大量拷贝”ThewaytogetaDNAcloneGene TherapyGene analysisGene modificationMedicineVaccineTransgenegene knockoutExpressionShort Summary of gene cloning：LOGO1

47、973年，年，Cohen和和Boyer第一次完整地第一次完整地建立起了基因克隆体系建立起了基因克隆体系StanleyCohen(Stanford)HerbertBoyer(UCSF)DNA重组技术创立近重组技术创立近40年来年来所获得的丰硕成果已经把人所获得的丰硕成果已经把人们带进了一个不可思议的科们带进了一个不可思议的科学世界学世界TransformationE.coliPlasmid1Plasmid2REREligaseRLOGO基因克隆技术基因克隆技术重组蛋白重组蛋白人源抗体人源抗体重组多肽药物重组多肽药物重组疫苗重组疫苗基因克隆基因克隆DNA序列测定序列测定重组载体重组载体基因治疗载体

48、基因治疗载体RNA转录载体转录载体打靶载体打靶载体转基因载体转基因载体基因敲除动物模型基因敲除动物模型转基因动物模型转基因动物模型发夹发夹RNARNAi核酸探针标记核酸探针标记分子杂交分子杂交SouthernblotNorthernblot构建文库构建文库基因组文库基因组文库cDNA文库文库基因合成基因合成PCR-克隆克隆-亚克隆亚克隆基因突变基因突变基因克隆技术是分子生物学的核心技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术LOGO克克 隆隆 基基 因因 的的 表表 达达 获取重组蛋白获取重组蛋白重组子目的基因的mRNA表达蛋白质LOGO亚克隆（亚克隆（Subcloning）克隆载体克隆载体表达载体

49、表达载体LOGO原核表达系统原核表达系统ProkaryoticexpressionsystemEukaryoticexpressionsystem真核表达系统真核表达系统大肠杆菌大肠杆菌酵母酵母昆虫昆虫细胞细胞哺乳动物哺乳动物细胞细胞转化宿主细胞转化宿主细胞RecombinantvectorpromoterTargetgeneProteinsTransformation/TLOGO原核表达系统：原核表达系统： 外源基因引入外源基因引入原核原核细胞，使其快细胞，使其快 速高效表达基因产物。速高效表达基因产物。真核表达系统：真核表达系统：外源基因引入外源基因引入真核真核细胞，细胞，使外源使外源 基

50、因在真核细胞中表达。基因在真核细胞中表达。表达体系表达体系LOGO第一部分第一部分. .外源基因在外源基因在原核原核细胞细胞中的表达中的表达原核细胞表达系原核细胞表达系统组成统组成二、原核表达载体二、原核表达载体一、原核宿主细胞一、原核宿主细胞LOGO大肠杆菌大肠杆菌（E.coli)优点：优点：简便简便, , 快速、成本低快速、成本低 可高密度发酵培养可高密度发酵培养20-30min12 hours6-8 Billion bacteriaOncetherecombinantsystemisestablished,itischeaptomanufacture.insulinRecombinant

51、一、原核宿主细胞一、原核宿主细胞注意：注意：用来用来克隆克隆基因和基因和表达表达基因的菌株基因的菌株不一样不一样，表达时，选用与表达载体相匹配的菌株。表达时，选用与表达载体相匹配的菌株。LOGO生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。达产物。 基因组结构简单，便于基因操作和分析。基因组结构简单，便于基因操作和分析。 多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。表达载体。 生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。 不具备真核

52、生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。间构象。 内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。定性。 原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点：原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点：LOGO二、原核表达载体二、原核表达载体在在原核原核细胞中细胞中表达表达外源基因的外源基因的载体载体。质粒：质粒：噬菌体：噬菌体：最方便，最方便，最常用。最常用。长片段长片段原核表达质粒原核表达质粒LOGO强启动子强启动子终止子终止子SDSD序列序列1、原核表达质粒的元件：、原

53、核表达质粒的元件：oriPT7SDMCSTerminatorProkaryotic Expression Plasmid ProkaryoticpromoterLac Istart piontAmpicillin resistance克隆元件：克隆元件：表达元件：表达元件：复制原点复制原点插入位点插入位点筛选标记筛选标记LOGO启动子启动子终止子终止子SDSDmRNAmRNA多肽链多肽链利用利用强强启动子，增加蛋白质的生物合成启动子，增加蛋白质的生物合成转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，因此，选择强的、可调控启动子是组建一个高效因此，选择强的、可调

54、控启动子是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。表达载体首先要考虑的问题。LOGO原核表达载体的启动子都是原核表达载体的启动子都是可诱导的可诱导的,目的是目的是在需要目的蛋白的时候才表达它在需要目的蛋白的时候才表达它.最理想的最理想的可调控可调控启动子应该是：启动子应该是：早期阶段早期阶段：启动子被阻遏：启动子被阻遏当细胞数目达到一定密度时当细胞数目达到一定密度时：通过诱导使阻遏：通过诱导使阻遏物失活，物失活，RNA聚合酶快速起始转录。聚合酶快速起始转录。LOGOPlac： 受受Lac阻遏蛋白负调节，阻遏蛋白负调节， 受受IPTG的诱导。的诱导。PL启动子启动子：噬菌体早期：噬菌体早期 左向启

55、动子。左向启动子。 常用的常用的 原核启动子原核启动子 PR启动子启动子：噬菌体早期：噬菌体早期 右向启动子。右向启动子。受受噬菌体噬菌体CI基基因调控因调控LOGO乳糖操纵子结构：调控元件乳糖操纵子结构：调控元件乳糖操纵子结构：调控元件乳糖操纵子结构：调控元件 +结构基因结构基因结构基因结构基因RNA Pol.阻遏阻遏蛋白以恒定的速度表达，特异性地结合到操作子上，蛋白以恒定的速度表达，特异性地结合到操作子上，对对操作子操作子的调控：的调控：乳糖或类似物是阻遏蛋白的诱导物。乳糖或类似物是阻遏蛋白的诱导物。LOGOOHOHHHHOHHOHCH2OHOHOHHHHHOHCH2OHOOHIPTGis

56、 an analog of lactose but can not be hydrolyzed by galactosidase. LactoseWhy IPTG?(Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside, 异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷)LOGO乳糖操纵子的应用：乳糖操纵子的应用：利用乳糖操纵子的基本原理构建原核细胞表达载体。利用乳糖操纵子的基本原理构建原核细胞表达载体。IPTG: :类乳糖诱导剂类乳糖诱导剂“O”持续开放持续开放培养基培养基葡萄糖耗尽葡萄糖耗尽“P”开放开放pET vectors and BL(DE3) inducible syste

57、m (Novagen)LOGO终止子：终止子： 强终止子、二聚体终止子强终止子、二聚体终止子转录过度的危害：转录过度的危害： 影响目的基因的转录和翻译效率影响目的基因的转录和翻译效率 干扰基因载体的复制等生物学功能干扰基因载体的复制等生物学功能 增加受体细胞的无效能量消耗增加受体细胞的无效能量消耗 启动子启动子终止子终止子SDmRNALOGONNNAAGGAGGNNNNNAUGCAAAUUSD SD 与与16S 16S rRNArRNA 3 3富含嘧啶的碱基互富含嘧啶的碱基互补配对补配对, ,对蛋白质翻对蛋白质翻译的起始非常重要译的起始非常重要! !39nt3-11ntSDSD序列序列 : :

58、 原核原核mRNA具有独特的具有独特的SD序列序列, 是核糖体结合位点是核糖体结合位点.(ribosomebindingsite,RBS)LOGOSDSD序列：影响翻译效率序列：影响翻译效率SDSDSDSD序列与序列与序列与序列与16SrRNA16SrRNA16SrRNA16SrRNA的互补性的互补性的互补性的互补性SDSDSDSD与起始密码子之间的距离与起始密码子之间的距离与起始密码子之间的距离与起始密码子之间的距离LOGO成熟型成熟型融合型融合型分泌型分泌型减少原核细胞对外减少原核细胞对外源蛋白的降解源蛋白的降解-天然完整蛋白天然完整蛋白-融合蛋白融合蛋白-分泌性蛋白分泌性蛋白2、原核表达

59、质粒的类型：、原核表达质粒的类型：LOGO 1 1）成熟型表达载体）成熟型表达载体oripromoterSDMCSExpression vector特点：特点：l外源基因需携带外源基因需携带ATGATG和和TAATAAl只表达目的基因编码的只表达目的基因编码的氨基酸氨基酸l产生天然蛋白，容易被产生天然蛋白，容易被降解，因此降解，因此产量小产量小，也，也可能不稳定。可能不稳定。缺点缺点!PForeign DNALOGO2) 2) 融合型表达载体融合型表达载体载体载体1 1：.ATG .ATG ACGACG TCATCA GATGAT. . 载体载体2 2：.ATG .ATG N NACAC GT

60、CGTC AGAAGA T.T. . 载体载体3 3：ATG ATG NNNNA A CGTCGT CAGCAG AT.AT.第一种情况：第一种情况：ATGATGNATGNATGNATGNNInsertsiteInsertsiteILOGO第二种情况：第二种情况： 表达载体含有一段编码原核蛋表达载体含有一段编码原核蛋白的基因顺序，使表达的蛋白质白的基因顺序，使表达的蛋白质N端或端或C端带着一小段原核多肽。端带着一小段原核多肽。 Protein of interest with a small additional peptide at N or C end.Protein of interes

61、t with a small additional peptide at N or C end.Fig. A schematic structure of fusion proteinFig. A schematic structure of fusion protein2) 2) 融合型表达载体融合型表达载体LOGOMostpopularprokaryoticexpressionplasmidwithhis-tag.融合型表达载体融合型表达载体举例举例LOGO融合蛋白融合蛋白Ni-affinity chromatography if the fused is if the fused is

62、6-hisNiNiHis-his-his-his-his-hisIonicbondHis-tag Protein可以加入蛋可以加入蛋白酶切位点白酶切位点HistaqHistaqTAANcoI(ATG)EcoRIHindIII离子键离子键亲和层析亲和层析LOGO外源蛋白以融合蛋白的形式表外源蛋白以融合蛋白的形式表达达,读码框架固定或可选择读码框架固定或可选择特点：特点：特点：特点：小结小结:融合型表达载体融合型表达载体表达效率高表达效率高产物稳定产物稳定易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性 Fusion protein can be purified easily Can

63、 be made in large amounts.优点：优点：优点：优点：缺点：缺点：缺点：缺点：非天然蛋白，需要表达后切除融合蛋白非天然蛋白，需要表达后切除融合蛋白LOGO 3) 3)分泌型表达载体分泌型表达载体 SecretionexpressionvectorsATG下游构建了信号肽基因序列下游构建了信号肽基因序列Secretedintomedium?(!)E.CLOGOCellwallCytoplasmicmembraneGenome分泌到细胞周间隙中分泌到细胞周间隙中的重组蛋白质的重组蛋白质RLOGOvThe recombinant protein will be secreted

64、 into periplasmv避免目的蛋白被细菌蛋白酶降解vThe high expression levelv利于收集外源蛋白优点：优点：读码框架固定读码框架固定: The target gene does not need start codon because it uses the ATG of signal peptide.特点：特点：LOGOSingle colonySingle colony50 ml LB medium for 5 hours. 50 ml LB medium for 5 hours. OD=0.6 induceOD=0.6 induce foreign ge

65、ne foreign gene expression in host.expression in host.t transformransform recombinant plasmid recombinant plasmid into into expression host cell expression host cell (BL21(BL21DE3DE3) )转化平板转化平板细菌处于对数生长期时细菌处于对数生长期时细菌处于对数生长期时细菌处于对数生长期时扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养留种，然后留种，然后留种，然后留种，然后1/1001/100接种。接种。接种。接种。转化的表达菌要与表

66、转化的表达菌要与表转化的表达菌要与表转化的表达菌要与表达载体相达载体相达载体相达载体相 配套！配套！配套！配套！三、外源基因在三、外源基因在E.coli中的表达中的表达LOGOIPTGaddition IPTG Induction： adding IPTG to the culture if the vector uses Lac operon to regulate foreign gene expression.Quantityoftargetproteinincell,LOGOWhere your expressed protein will be located? Inclusionb

67、odies(insoluble)Cytoplasm(soluble)Secretedintoperiplasmaticspace(solubleorinsoluble) NothingRecombinant protein may be hydrolyzed by proteinasesresistanttoproteinasehydrolysisthatresultsinthehighyield LOGOSDS-PAGE SDS-PAGE PurifyandIdentifytheproteinWestern Blot Western Blot AnalysisAnalysis问题：问题：是不

68、是所有基因都可以在是不是所有基因都可以在E.coli中表达？中表达？LOGO外源基因在原核细胞表达的必要条件外源基因在原核细胞表达的必要条件：1.删除内含子和删除内含子和5非编码区非编码区2.外源基因置于强启动子和外源基因置于强启动子和SD顺序控制下顺序控制下3.维持正确开放阅读框架（维持正确开放阅读框架（ORF）4.mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解不被降解5.蛋白不需要翻译后加工过程蛋白不需要翻译后加工过程LOGO真核基因在真核基因在E.coliE.coli中表达应该如何构建？中表达应该如何构建？（1 1）基因片段应该来源于）基因片段应该来源于mR

69、NAmRNA，因因为为E.coliE.coli不能对基因进行剪接。不能对基因进行剪接。真核基因真核基因原核基因原核基因断裂断裂基因基因连续连续基因基因采用采用RT-PCR法法LOGO（2 2）尽量将密码子改变成）尽量将密码子改变成E.coliE.coli偏爱密码子，如偏爱密码子，如果有困难，可尝试将基因果有困难，可尝试将基因55端前端前5050个碱基变成偏个碱基变成偏爱密码子。爱密码子。E.ColiE.Coli 核糖体蛋白质的密码子使用频率：核糖体蛋白质的密码子使用频率：LOGOCase 1.Case 1. hIFN- hIFN- 2b2b的表达的表达hIFN-hIFN- 2b2b的特点：的特

70、点：1 1）一级结构发挥作用，不需要翻译后加工）一级结构发挥作用，不需要翻译后加工2 2）经过密码子的改造可以在）经过密码子的改造可以在E.coliE.coli中高效表达中高效表达LOGOCase 2.Case 2. HBsAgHBsAg的表达的表达HBsAgHBsAg的特点：的特点：1 1）高度糖基化）高度糖基化E.ColiE.Coli没有蛋白质没有蛋白质加工修饰功能，即加工修饰功能，即使表达出蛋白质也使表达出蛋白质也不具备天然蛋白质不具备天然蛋白质的功能。的功能。2 2）HBVHBV是真核病毒，因此是真核病毒，因此HBsAgHBsAg基因含有基因含有E.coliE.coli的稀有密码子。的

71、稀有密码子。因此，到目前为止，因此，到目前为止，HBsAgHBsAg重组疫苗还是在重组疫苗还是在真核真核CHOCHO细胞或酵母中表达的。细胞或酵母中表达的。LOGO 真核表达系统的必要性及优势：真核表达系统的必要性及优势：1. 具转录后加工系统具转录后加工系统2. 具翻译后修饰系统，具翻译后修饰系统，重组蛋白具有很好的活性重组蛋白具有很好的活性3. 可实现真正的分泌表达可实现真正的分泌表达4. 基因治疗、研究基因的功能等基因治疗、研究基因的功能等 原核表达系统的缺点：原核表达系统的缺点：1. 没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子 2. 缺乏翻译后加工

72、系统，不能对翻译的蛋白质进缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工一步修饰加工LOGO真核细胞真核细胞酵母细胞酵母细胞昆虫细胞昆虫细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞酵母表达系统酵母表达系统昆虫表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞哺乳动物细胞表达系统表达系统以获得大量的有活以获得大量的有活性的蛋白为目的性的蛋白为目的研究基因或其蛋白质研究基因或其蛋白质产物的功能为目的产物的功能为目的第二部分第二部分.外源基因在真核细胞中的表达外源基因在真核细胞中的表达YeastInsectMammalianEukaryotic Expression SLOGO一、酵母表达系统一、酵母表达系统系统组成：系统组成

73、： 酵母细胞酵母细胞 酵母质粒表达载体酵母质粒表达载体比比细菌菌落大而厚，菌细菌菌落大而厚，菌落表面光滑湿润、粘稠、落表面光滑湿润、粘稠、容易挑起，容易挑起，质地、颜色均一，质地、颜色均一，多为乳白色多为乳白色* *低等真核单细胞生物，生长快，可大规低等真核单细胞生物，生长快，可大规模发酵培养模发酵培养, , 成本较低。成本较低。* *可以进行一定程度的蛋白质翻译后修饰。可以进行一定程度的蛋白质翻译后修饰。1.1.酵母细胞：酵母细胞：LOGO大肠杆菌大肠杆菌/酵母菌穿梭载体酵母菌穿梭载体 ：1. 在在E.coli中复制与筛选中复制与筛选 *pUC ori , Ampr2. 在酵母细胞象细菌中质

74、粒一样复制在酵母细胞象细菌中质粒一样复制（2u origin）3. 在酵母细胞中表达外源基因在酵母细胞中表达外源基因 *酵母可识别的启动子酵母可识别的启动子4. 筛选标记：筛选标记： 营养缺陷筛选营养缺陷筛选 URA32. 2. 酵母质粒表达载体酵母质粒表达载体LOGO二、昆虫表达系统二、昆虫表达系统昆虫病毒：昆虫病毒：baculovirus转递质粒载体转递质粒载体1 1、可对蛋白质进行、可对蛋白质进行翻译后加工修饰翻译后加工修饰2 2、可、可高水平表达高水平表达外源基因产物外源基因产物3 3、操作相对简单、操作相对简单-已经商品化已经商品化4 4、蛋白准确定位、蛋白准确定位-如分泌到膜外。如

75、分泌到膜外。载体：载体：昆虫表达系统的组分：昆虫表达系统的组分：昆虫细胞昆虫细胞 优点：优点：LOGO病毒基因组相病毒基因组相对较对较大大，不宜，不宜直接将外源基直接将外源基因克隆到病毒因克隆到病毒基因组。基因组。- the polyhedrin gene becomes unnecessary. -replace polyhedrin coding seq with gene of interest (G of I)Baculovirus genomestrongPromoterPolyhedringene昆虫病毒昆虫病毒昆虫表达载体：昆虫表达载体：提供目的基因的质粒载体提供目的基因的质粒载

76、体昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒LOGO* *首先将外源片段克隆到某质粒上，再以某种机制首先将外源片段克隆到某质粒上，再以某种机制将外源片段递到病毒基因组上将外源片段递到病毒基因组上有两种不同原理构建的昆虫表达系统：有两种不同原理构建的昆虫表达系统：1）根据）根据同源重组同源重组同源重组同源重组原理构建的原理构建的2）根据）根据转座子转座子转座子转座子原理构建的，原理构建的，如如Bac-To-Bac表达系统表达系统昆虫表达载体：昆虫表达载体：提供目的基因的质粒载体提供目的基因的质粒载体LOGO-转座子机制：如转座子机制：如Bac-To-Bac表达系统表达系统Bacmid-insectcellBacm

77、idPolyhedrinpromoter将转座子的靶点构建到昆虫病毒基因组上将转座子的靶点构建到昆虫病毒基因组上（Baculovirusplasmid）带有杆状病毒基因组带有杆状病毒基因组的质粒，的质粒，可在细菌和昆虫细胞可在细菌和昆虫细胞之间穿梭之间穿梭 LOGO是否还记得转座子是在染色体间运动？是否还记得转座子是在染色体间运动？转座子转座子(trans-poson,Tn)是存在于染色体是存在于染色体DNA上可自主复制和位上可自主复制和位移的基本单位。可在细菌的染色体，质粒或噬菌体之间自行移动移的基本单位。可在细菌的染色体，质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分，是基因组中一段特异的具有转位特性

78、的独立的的遗传成分，是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列。序列。LOGO* *将转座子的两个臂构建将转座子的两个臂构建到到MCSMCS两侧。两侧。1.构建重组转递质粒构建重组转递质粒* *通过基因克隆的方通过基因克隆的方法将法将外源片段外源片段克隆到克隆到转递质粒上。转递质粒上。庆大Ppolh真核筛选标记基因真核筛选标记基因promoterofPolyhedrinGofILOGO2 Recombinant bacmid DNA主要是主要是LacZ , Kanr, oriEBaculovirusgenomepFastBac1Tn7LPpolhForeign geneAttachme

79、nt sitehelperCompetent DN10Bac E.coliTransformationhelperForeign genePpolhE.coli containing recombinant BacmidPpolhMini-prepofhighmolecularweightDNA2.ToconstructrecombinantBacmidDNAbased on transposition mechanism in E.coli.1Recombinant donor plasmidHelper质粒编码转座酶TetramprTn7RTetKan,庆大 Blue-Whiteselec

80、tion 庆大Transposition Bacmid（23天）天）LOGOIsolatedrecombinantbacmidDNAthentransfectinsectcellswithlipo-insect4.Viralamplyfication:harvestthesupernatantandinfectinsectcellsfor5times5.recombinantprotein:Expressedbyinsectcellsisinsupernantantwhileviralamplificates.3. Bacmid will be packaged into viral part

81、icle in insect cell. Reconbinant baculoverus particle is released into the supernatant. Infect other cell.RLOGO感染前感染前感染后感染后LOGO三、哺乳动物细胞表达系统三、哺乳动物细胞表达系统系统组成：系统组成：宿主细胞：哺乳动物细胞宿主细胞：哺乳动物细胞*表达最接近天然的重组蛋白质表达最接近天然的重组蛋白质*重组蛋白的产量较低重组蛋白的产量较低*直接利用宿主细胞研究重组蛋白的功能直接利用宿主细胞研究重组蛋白的功能*可用于基因治疗可用于基因治疗表达载体：表达载体：*哺乳动物细胞质粒表达

82、载体哺乳动物细胞质粒表达载体*动物病毒动物病毒LOGO哺乳动物细胞质粒表达载体哺乳动物细胞质粒表达载体eukaryoticMCSPolyAsignalterminatorNLOGO酵母细胞酵母细胞昆虫细胞昆虫细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞质粒质粒昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒质粒或病毒质粒或病毒重组蛋白质产物重组蛋白质产物:产率产率翻译后修饰翻译后修饰活性活性载体载体目的基因目的基因优选优选cDNA 真核细胞表达系统的比较真核细胞表达系统的比较 Yeastsystemlimitedpost-LOGO克隆基因的表达克隆基因的表达获取重组蛋白获取重组蛋白表表达达体体系系载载体体宿主宿主原核生物表达体系原核

83、生物表达体系质粒、噬菌体质粒、噬菌体细菌细菌酵酵母母表表达达体体系系穿穿梭梭质质粒粒酵母酵母昆昆虫虫细细胞胞表表达达体体系系昆昆虫虫病病毒毒昆昆虫虫细胞细胞哺乳动物细胞表达体系哺乳动物细胞表达体系病毒、脂质体病毒、脂质体哺乳动物细胞哺乳动物细胞穿梭质粒穿梭质粒LOGOKeypoints1.限制性核酸内切酶的特点；限制性核酸内切酶的特点；2.PCR的引物设计；的引物设计；3.基因克隆的步骤；基因克隆的步骤；4.克隆载体和表达载体的基本元件；克隆载体和表达载体的基本元件；5.鉴定重组体的方法；鉴定重组体的方法；6.举例说明克隆基因在原核及真核表达体系中表达举例说明克隆基因在原核及真核表达体系中表达

84、的原理？的原理？LOGOLOGOAUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）位于位于SD序列下游。序列下游。起始密码：SDSD序列距离序列距离AUGAUG的距离，最佳的距离，最佳7bp;7bp;SDSD序列与核糖体序列与核糖体16SrRNA316SrRNA3碱基的互补性；碱基的互补性；SDSD序列与序列与AUGAUG之间的碱基组成也很重要，之间的碱基组成也很重要， AAAAAAAA、GGGGGGGG时效率最高时效率最高SD序列影响翻译效率：序列影响翻译效率：LOGO是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。具序列特异性、方向性、位置特异合成的序

85、列。具序列特异性、方向性、位置特异性、种属特异性。性、种属特异性。 大大肠杆杆菌菌的的所所有有启启动子子中中都都有有两两段段一一致致顺序序（consensus sequence）。 三、原核生物基因表达的调控1. 启动子启动子-35 Box 和和 -10 Box（1） 启动子序列启动子序列 LOGO3. 转录终止子内终止子内终止子 intrinsic terminator：E.coli中促使转录终止的中促使转录终止的DNA位置有一段位置有一段反反向回文顺序向回文顺序，其后紧接一串，其后紧接一串U，称为内终止，称为内终止子，或本征终止子，形成终止信号。子，或本征终止子，形成终止信号。不需要其他蛋

86、白辅助因子参与不需要其他蛋白辅助因子参与在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。终止子。启动子启动子操纵子操纵子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子LOGO大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上。一般安置上全部的三个终止全部的三个终止密码密码防止核糖体跳跃（防止核糖体跳跃（skipping）。）。Translation enhancer能够显著增强启动子转录活性的能够显著增强启动子转录活性的DNA序列，序列，由多个元件组成，每一元件可与一种或多种转由多个元件组成，每一元件可与一种或多种转录调控因子结合。具双向性、特异性，其发挥录调控因

87、子结合。具双向性、特异性，其发挥功能与所处位置无关。功能与所处位置无关。4. 翻译终止密码5. 翻译增强子LOGO 必须是一种强启动子必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的白的10%-30%以上。以上。 应呈现低水平的基础转录应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。便于表达毒性蛋白等。 应是可诱导型的应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。用温度或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件 基因工程常用的原核启动子 LOGO来自大肠杆菌的乳来自大肠杆菌的乳糖操纵子。糖操纵子。用乳糖或其类似物用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，充当诱导物，与阻遏蛋白结合，与阻遏蛋白结合，解除抑制。解除抑制。Plac O目的基因目的基因（2） 乳糖启动子LOGO缺乏蛋白质的加缺乏蛋白质的加工。工。 （如糖基化、氨（如糖基化、氨基酸修饰等）。基酸修饰等）。九、原核细胞表达的缺陷