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1、5.2.1 5.2.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征5.2 5.2 酵母基因工程（自学）酵母基因工程（自学）5.2.1.1 5.2.1.1 酵母菌的分类学特征酵母菌的分类学特征 酵母菌（酵母菌（YeastYeast）是一群以）是一群以芽殖芽殖或或裂殖裂殖方式进行方式进行无性繁殖无性繁殖的单细的单细胞胞真核生物真核生物，分属于，分属于子囊菌纲子囊菌纲（子囊酵母菌）、（子囊酵母菌）、担子菌纲担子菌纲（担子酵母（担子酵母菌）、菌）、半知菌类半知菌类（半知酵母菌半知酵母菌），共由），共由5656个属和个属和500500多个种组成。如多个种组成。如果说大肠杆菌是外
2、源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。成熟的真核生物表达系统。骇矗贞妈瞻素缀侈酋妹铺变淀麓纵劣震盅轧熬逆缠疏钞饱勒错鹅迸迎礁瞎Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo惊盯桓胰踌劝捎原今毒呸娠笺阂桨宙跳射缕党知剁深铺奥肘纪广戮酥捉出Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo5.2.1.2 5.2.1.2 酵母菌表达外源基因的优势酵母菌表达外源基因的优势酵母菌表达外源基因的优势
3、酵母菌表达外源基因的优势nn基因表达调控机理清楚，遗传操作简便基因表达调控机理清楚，遗传操作简便基因表达调控机理清楚，遗传操作简便基因表达调控机理清楚，遗传操作简便nn具有真核蛋白翻译后加工系统具有真核蛋白翻译后加工系统具有真核蛋白翻译后加工系统具有真核蛋白翻译后加工系统nn大规模发酵技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵技术成熟、工艺简单、成本低廉nn能将外源基因表达产物分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中nn不含有特异性的病毒、不产内毒
4、素不含有特异性的病毒、不产内毒素不含有特异性的病毒、不产内毒素不含有特异性的病毒、不产内毒素nn酵母菌是最简单的真核模式生物酵母菌是最简单的真核模式生物酵母菌是最简单的真核模式生物酵母菌是最简单的真核模式生物溪劳龄顷啄例瘁菠跌搽镭庭轩碾龚沫途惧抽漳蒙讥迹频眠麓盂覆久氏鸽碰Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo5.2.2 5.2.2 酵母菌的宿主系统酵母菌的宿主系统酵母菌的宿主系统酵母菌的宿主系统nn广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌nn提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿
5、主菌nn抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌nn减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌洋裸硬束铁舅抿赶奠狞富练贴汞讨杠胺澡掘骑刷琢搓纲创帘蝎嗽链柞招汞Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo5.2.2.1 5.2.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属酵母属 如酿酒酵母（如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSacch
6、aromyces cerevisiae）克鲁维酵母属克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactisKluyveromyces lactis）毕赤酵母属毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastorisPichia pastoris）裂殖酵母属裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombeSchizosaccharomyces pombe）汉逊酵母属汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（如多态汉逊酵母（Hansenula polymorphaHansenula polymorpha）
7、童涩甲呜影异开裁徒辐惑拉睡醚臭赘猪废贷咽豁戍致励加溃仇嘴脱涟捶谩Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.2.2 4.2.2.2 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌sscssc1 1 改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的钙离子依赖型的ATPATP酶酶sscssc2 2 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录后加工转录后加工rgrrgr1 1 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录水平转录水平oseose1 1 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录水平转录水平sscssc1111
8、 改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌 羧肽酶羧肽酶YYrhorho- 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录水平转录水平突变类型突变类型生物效应生物效应作用位点作用位点焚炎灾归缅商竿防握氛名帆蚜钨倪渐歼温念扮卉帕秆筛僵涝冰牡厘驼休鬼Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.2.3 4.2.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌能抑制超糖基化的突变类型能抑制超糖基化的突变类型mnn mnn 甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型alg alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型o
9、ch och 外侧糖链添加缺陷型外侧糖链添加缺陷型突变类型突变类型生物效应生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心糖基核心和和外侧糖外侧糖链链两部分组成。两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。基化缺陷株非常重要。控翟填养攀
10、厚里钥萄荷弘澳翟贞惩蛰垮舟鲸叛和百枢献腥鸭宽曝情腊谣姚Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.2.4 4.2.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体蛋白酶体LysLysHOOCUbiquitin 76 aaUbiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3ubiquitin ligase E3 LysLysubiquitin ligase E3ubiquitin ligase E3 LysLys靶蛋
11、白靶蛋白靶蛋白嫩箩踊周宙蛾掀烫兔洲奢褐访必拭纱鳃偿斧擞麓驾砷胁产佬吵榴爵囊姑仲Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI UBI 11 编码编码泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252（CEP52CEP52） 对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 22 编码编码泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252（CEP52CEP52） 对数生长期表达对数生长期表达 稳定期
12、关闭稳定期关闭UBI UBI 33 编码编码泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白7676（CEP76CEP76） 对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 44 编码编码泛素五聚体泛素五聚体 对数生长期关闭对数生长期关闭 稳定期表达稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC UBC 11、UBC UBC 22、UBC UBC 33、UBC UBC 44、UBC UBC 55、UBC UBC 66、UBC UBC 77代额歼很饲啡节云岂配债瓷姆司劝华逛赔三移岁厌啊喷知峙逊墅彦姬佐毖Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh0
13、5基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo泛素降解途径衰减的酿酒酵母泛素降解途径衰减的酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI UBI 4 4基因表达，基因表达，UBI UBI 4 4- -突变株能突变株能UBI UBI 4 4缺陷型：缺陷型：正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此因此UBI UBI 4 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体缺陷突变株是外源基因表达理想的受体UBA UBA 1 1缺陷型：缺陷型：UBAUBA1 1编码编码泛素激活酶泛素激活酶E1E1，UBAUBA1 1突变株
14、是致死性的，但其等位突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解Ubc4 - ubc5 Ubc4 - ubc5 双突变型：双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效穿汾捕现赚悲忌姥眺较个骸沧音熟犁尉砌痒随计棱感汕茧睛怯即驯葡旷圆Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.3 4.2.3 酵母菌的载体系统酵母菌的载体系统酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌
15、中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒袒俐倚岁冠缝闹显帐企谅档懊侈静救枚左崔旗醋旋拘坦俊迄剑吐挡淄粒捆Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.3.1 4.2.3.1 酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒酿酒酵母中的酿酒酵母中的2 2m m环状质粒环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都几乎所有的酿酒酵母中都含有含有2 2m m双链环状质粒，拷双链环状质粒，拷贝数达贝数达5050至至100100个。个。同源重组同源重组REP1REP1RAFRAFSTBSTBorioriREP2REP2FLPFLPIRIRIRIRAABB鸿己球粱娱
16、务虐倚薯郝热惩密霄圣咯惰唾飞艘苹闭呼悬较掩围溜署嚣灿蕊Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo乳酸克鲁维酵母中的线乳酸克鲁维酵母中的线状质粒状质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不同乳酸克鲁维酵母中含有两种不同pGKL1 8.9 kbpGKL1 8.9 kbDNADNA聚合酶聚合酶 毒素蛋白毒素蛋白ab ab 免疫蛋白免疫蛋白 g g 亚基亚基的双链线状质粒的双链线状质粒pGKL1pGKL1和和pGKL1pGKL1反向重复序列反向重复序列苦岁拦级垫狭居肛秧前搁缉仅樟社拢蚀敦发僻汾茫憨颅纱锤炙熔举卵键悄Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高
17、效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.3.2 4.2.3.2 酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建(1) (1) 含有含有ARSARS的的YRpYRp质粒的构建质粒的构建 ARS ARS为酵母菌中的自主复制序列，为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb0.8-1.5kb，染色体上每，染色体上每30-40kb30-40kb就有一个就有一个ARSARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子复制子、标标记基因记基因、提供克隆位点的大肠杆菌、提供克隆位点的大肠杆菌质粒质粒DNADNA。 以以AR
18、SARS为复制子的质粒称为为复制子的质粒称为YRpYRp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200200个，但培养几代个，但培养几代 以以2 2m m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEpYEp后，质粒的丢失率高达后，质粒的丢失率高达50%-70%50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。，主要是由于分配不均匀所致。婚睡沮宽盒字患逊领躺纱渤窃关皮未矮拖澜危屑兹垄渐蔚逞喊通涛祁眷憾Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo(2) (2) 含有含有CE
19、NCEN的的YCpYCp质粒的构建质粒的构建 CEN CEN为酵母菌染色体为酵母菌染色体DNADNA上与染色体均匀分配有关的序列上与染色体均匀分配有关的序列 将将CEN CEN DNADNA插入含插入含ARSARS的质粒中，获得的新载体称为的质粒中，获得的新载体称为YCpYCp YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 - 51 - 5个个坞潜评循侧嚷港椭覆辛址震窟霄网省辩肃怜檬岿伦拍药威炔遵灰宴硝砒垃Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo(3) (3) 含有酵母菌
20、染色体含有酵母菌染色体DNADNA同源序列的同源序列的YIpYIp质粒的构建质粒的构建 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNADNA特定序列和标特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为记基因，构建出来的质粒称为YipYip（酵母整合型质粒）（酵母整合型质粒），目，目的基因表达盒通常插在染色体的基因表达盒通常插在染色体DNADNA特定序列中。特定序列中。 什么目的？什么目的？ 目的基因能高效整合入酵母菌特定的染色体目的基因能高效整合入酵母菌特定的染色体DNADNA区域区域厄必奠黄歼疥极骸詹散锚松膘帧喊肠任迂潍轰叠俏捉刀澡望溶害汾屏鸭诞Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的
21、高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.4 4.2.4 酵母菌的转化系统酵母菌的转化系统酵母菌的转化系统酵母菌的转化系统nn酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序nn转化质粒在酵母细胞中的特点转化质粒在酵母细胞中的特点nn用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因弯粮账椿灌怀姬带洼蚕单恤拍及役硬项汕晋兽朝债研鼓厂附铃搬釉套碟累Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo(1) (1) 酵母菌原生质体转化法酵母菌原生质体转化法nn早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质早期酵母菌的
22、转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法体转化法体转化法体转化法nn 原生质体转化法的一个显著特点是：一个受体细胞可同原生质体转化法的一个显著特点是：一个受体细胞可同原生质体转化法的一个显著特点是：一个受体细胞可同原生质体转化法的一个显著特点是：一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子时接纳多个质粒分子时接纳多个质粒分子时接纳多个质粒分子4.2.4.1 4.2.4.1 酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序雍闺祭致邹键会完炯甲山韩嘲惧此夺悠顶祥赢酞共几葬审傣名回碍睡状褂Ch0
23、5基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo(2) (2) 碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如LiLi+等）、等）、PEGPEG、热休克、热休克处理后，也可高效吸收质粒处理后，也可高效吸收质粒DNADNA，而且具有下列特性：，而且具有下列特性：吸收线型吸收线型DNADNA的能力明显大于环状的能力明显大于环状DNADNA，两者相差，两者相差8080倍倍共转化现象极为罕见共转化现象极为罕见臂继咋郸伺症温肌镶舵继碍冒燕举铀帕器睬夺艺秘展
24、蜗领答芜姓潜卒固泰Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo(3) (3) 酵母菌电击转化法酵母菌电击转化法 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率可高达105 / mg DNA。醚萌夏张磐隅稚返览拐氓蓑毗剪琅屡移成侠甩毅蓟夕潜族紧巩撬汹屿播织Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.4.24.2.4
25、.2 转化质粒在酵母细胞中的特点转化质粒在酵母细胞中的特点转化质粒在酵母细胞中的特点转化质粒在酵母细胞中的特点单双链单双链DNADNA均可转化酵母菌均可转化酵母菌含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体克隆在克隆在YIpYIp整合型质粒上的外源基因，含有受体细胞的染色体整合型质粒上的外源基因，含有受体细胞的染色体DNADNA的同源序列，会发生高频同源整合的同源序列，会发生高频同源整合跋又借哩杀穗颓惩蜡愚敝朵休劝留
26、邦彤杭盯讯焦功蚂糖娜旷稻此奖梧逗设Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.4.34.2.4.3 用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型有营养缺陷型互补基因互补基因和和显性标记基因显性标记基因两大类两大类 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEULEU、TRPTRP、HISHIS、LYSLYS、URAURA、ADEADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺
27、陷型的受体非常困难但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难(1) (1) 营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因呛娥膏诡曾有某龄叔诚阔笼割慨器语咽鱼都胺啮贬顽毗讹诗份掏驯扰华湖Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo 显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白(2) (2) 显性标记基因显性标记基因 aph aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶 抗抗G418G418 cat cat 氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素抗氯霉素 dhfr dhfr 二氢叶酸还原
28、酶二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 cup1 铜离子螯合物铜离子螯合物 耐受铜离子耐受铜离子 suc2 suc2 蔗糖转化酶蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖 ilv2 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂标记基因标记基因编码产物编码产物遗传表型遗传表型拨失兼婆婉孜虫固黄揍洪纱倘引授智嗓舍澄巳换苛实咯寨呆丛突浪襟又太Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.5 4.2.5 酵母菌的表达系统酵母菌的表达系统酵母菌的表达系统酵母菌的表达系统外源基因在酵母菌中表达
29、的限制因素外源基因在酵母菌中表达的限制因素酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择灾窑凑眷陶咙考判伴惭魔华宦狠淀配坪俩韭茁暇氛撮袁燥要拇蕊鸿顽诲属Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.5.1 4.2.5.1 酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性nn 酿酒酵母酿酒酵母PHO5PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开，才能打开， PHO4PHO4基因编码产物是基因编码产物是PHO5PHO5启动子的正
30、调启动子的正调控因子控因子 nn PHO4 PHO4温度敏感型突变基因温度敏感型突变基因pho4pho4TSTS的编码产物在的编码产物在3535时失活时失活 启动子下游的外源基因在启动子下游的外源基因在3535时关闭，时关闭，2 23 3诱导表达诱导表达(1) (1) 温度控制型启动子温度控制型启动子- - pho4pho4TSTS-PHO5-PHO5启动子：启动子：颁廓宜哆相筒渔紫庐图质访寿胸雀肠山排倦禾顺斤虑沼未划茁兆磨凉芍庇Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo酿酒酵母酿酒酵母酿酒酵母酿酒酵母的半乳糖的半乳糖的半乳糖的
31、半乳糖利用酶系利用酶系利用酶系利用酶系由由由由GAL1 GAL1 GAL7GAL7和和和和 GAL10GAL10基因编码基因编码基因编码基因编码(2) (2) 超诱导型启动子超诱导型启动子GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80半乳糖诱导时，半乳糖诱导时，GAL4GAL4高效表达，高效表达，GAL1GAL1、GAL1GAL1、GAL10GAL10超高效表达超高效
32、表达GAL10GAL10PromoterPromoter沁咆汾掇液辱疵庸驶星柱埠钧揖尽鞋峨轨衣蒋避轰伪掳侗嚷蛙寝呛付婉或Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.5.2 4.2.5.2 外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因稳态外源基因稳态mRNAmRNA的浓度的浓度外源基因外源基因mRNAmRNA的翻译活性的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性酵母菌对密码子的偏爱性在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶GAPDHGAPDH、
33、磷酸甘油激酶、磷酸甘油激酶PKGPKG、乙醇脱氢酶、乙醇脱氢酶ADHADH）中）中96%96%以上的氨基酸是由以上的氨基酸是由2525个密码子编码的个密码子编码的挛蔷穿考者究事某拟恫捞恳纲纲氮啦角汉钱抱暇括汗锥危庭双漫揣囱雨讹Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.5.3 4.2.5.3 酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛醛-3-3-磷酸脱氢酶基因磷酸脱氢酶基因GAPDHGAPDH、磷酸甘油激酶基因磷酸
34、甘油激酶基因PKGPKG、乙醇脱氢、乙醇脱氢酶基因酶基因ADHADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化超糖基化能力，往往使得能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。A A 酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统罕赘撤嚷施咯奔蝴塞耀久枚蘸缎币发蹲雪轰堆滥口棠疹挟憎栅卖髓柬倡棘Ch05基
35、因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1pKD1已被广泛用作重组异源已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传能稳定遗传4040代以上。代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。于酿酒酵母表达系统。B B 乳酸克鲁维酵母表达系统乳酸克鲁维酵母表达系统幽酝掳唆欣獭煮闹搅琐珊超殆
36、姥懒两埠塘峦据隆簇教造烘面榔密浑狙伪锰Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo 巴斯德毕赤酵母是一种巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌甲基营养菌，甲醇甲醇可高效诱导甲醇代谢途可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。径中各酶编码基因的表达。 生长迅速、乙醇氧化酶基因生长迅速、乙醇氧化酶基因AOXAOX1 1所属强启动子、表达的可诱导所属强启动子、表达的可诱导性性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。 无合适的自主复制型载体，外源基因的高效表达在很大程度上取无合适的自主复制型载体，外源基因的高效表
37、达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。（决于整合拷贝数的多寡。（2020余种重组蛋白）余种重组蛋白）C C 巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母表达系统云这动瘩抓纶滴限摆哼意舆唯厕达踊胚所哦色熔蚊蒸渺般卯皂谴暮冤刺彤Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo 多型汉逊酵母也是一种多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌甲基营养菌。其自主复制序列。其自主复制序列HARSHARS已被已被克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。
38、所不同的是，体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARSHARS质粒质粒能高频自发地整合在受体的染色体能高频自发地整合在受体的染色体DNADNA上，甚至可以连续整合上，甚至可以连续整合100100多多个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。 目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获得目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获得成功表达。成功表达。D D 多型汉逊酵母表达系统多型汉逊酵母表达系统侗澄橡措之狈昭挑欠汕界句参凉荚鞍于搁稀鞍倾堕温湖疲民欣星心谰礼蒙Ch05基因在大肠杆菌、酵母
39、中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母4.2.6 4.2.6 利用重组利用重组酵母生产乙肝疫苗酵母生产乙肝疫苗掉纠基池刮熊曝珍干毯悲皆享秩氢湾哥婶佐粟睁壤谋训零逮兜傀彭畔粥坝Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwonn病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的表面抗原多肽病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的表面抗原多肽病毒颗粒的主要结
40、构蛋白是病毒的表面抗原多肽病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAgHBsAg）或）或）或）或S S多肽多肽多肽多肽nn颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（ HBcAg HBcAg ）、病毒）、病毒）、病毒）、病毒DNADNA聚合酶、微量病毒蛋白聚合酶、微量病毒蛋白聚合酶、微量病毒蛋白聚合酶、微量病毒蛋白4.2.6.1 4.2.6.1 乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质笨佳茶女掏教酉誊掂恿炯肆澜宗肠噪熊迈贫艳箔治血餐胶空躬义甥磋误策Ch0
41、5基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因ATGATGATGATGATGATGTAATAA108 aa108 aa55 aa55 aa226 aa226 aapreS1preS1preS2preS2SSS S 多肽多肽226 aa226 aaM M 多肽多肽281 aa281 aaL L 多肽多肽399 aa399 aa桐李枝毯酮江拧臂宙罪晴渠据奖来晒莹壬微好纂亥痈掠霄亩谁铸娜戮淘已Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达
42、parttwo 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。 虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材
43、料的限制难以大规模产业化。于原材料的限制难以大规模产业化。于原材料的限制难以大规模产业化。于原材料的限制难以大规模产业化。传统乙肝疫苗的制备传统乙肝疫苗的制备篓故抠饮蜜枣靡船缝肯饲情帝钥弃噬足庆阿挡闭围勾谬剂调堵薛耐奸擞酪Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwonn目前，由酿酒酵母生产的重组目前，由酿酒酵母生产的重组目前，由酿酒酵母生产的重组目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAgHBsAg颗粒已作为乙肝疫颗粒已作为乙肝疫颗粒已作为乙肝疫颗粒已作为乙肝疫苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的苗商品化，重组产物的最终产量可达
44、细胞总蛋白量的苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-1%-2%2%。 4.2.6.2 4.2.6.2 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母圃筛绊蝉迅环即慕挂柬事配捂嘿揣硬尘院马裂赶獭熊廊另姆品壮镑没盘祥Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.6.3 4.2.6.3 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 由于巴斯德毕赤酵母染色体由于巴斯德毕赤酵母染色体DN
45、ADNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因上还拥有第二个乙醇氧化酶基因AOX2AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。 重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲醇诱导醇诱导HBsAgHBsAg表达，最终表达，最终S S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%3%在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L240L的发酵罐的发酵罐中培养，最终可获得中培养，最终可获得9090克克
46、22nm22nm的的HBsAgHBsAg颗粒，足够制成颗粒，足够制成900900万份万份乙肝乙肝疫苗。疫苗。铁灼狸履英纂镁潭稻燃顽佐捏凭蛰综柠胡听钱展蚁阁汪镭衡直弃芝砸巩练Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo4.2.6.3 4.2.6.3 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建PARS2PARS2Bgl IIBgl II5 AOX15 AOX1HBsAgHBsAgPHIS4PHIS43 AOX13 AOX1Bgl IIBgl IIpB
47、SAG151pBSAG15111 kb11 kbBgl IIBgl II5 AOX15 AOX1HBsAgHBsAgPHIS4PHIS43 AOX13 AOX1hishis+的转化子的转化子重组分子重组分子转化转化hishis-的受体细胞的受体细胞染色体染色体DNADNA滞捂站疮蚀颅尚碰跌按墟痕杂加嗣男刀磋络炳过胡葬俐涨社拇潭翻衅爸录Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo琢四阔史沫卷悟崖勃嫉疡攫闷亥勾夹钻芥抄牡忿稀膳弥蝗佑苯循帮英役熬Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoTHANK YOU !THANK YOU !嫩掺培百蜡乙波叙亨扯胶幅粗陛插断意梳发尔已美寸镍金咏耽腹镰销擅培Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo旭轩莫圾仟北猜藩遭晚茧箩壮头瓜驹释冯圃背蝶怔哼草申疮硬注拉志兢拴Ch05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwoCh05基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达parttwo
