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1、第第 六六 章章 分子生物学基本研究法（下）分子生物学基本研究法（下）基因功能研究技术基因功能研究技术6. 1 基因表达研究技术基因表达研究技术6. 2 基因敲除技术基因敲除技术6. 3 蛋白质及蛋白质及DNA相互作用技术相互作用技术6. 4 基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析6. 5 其它分子生物学技术其它分子生物学技术6. 1 基因表达研究技术基因表达研究技术6.1.1 基基因因表表达达系系列列分分析析技技术术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE） 是是以以DNA序序列列测测定定为为基基础础分分析析全全基基因因组组表表达达模模式式的的技技术术。
2、任任何何长长度度超超过过9-10个个碱碱基基的的核核苷苷酸酸片片段段都都可可能能代代表表一一种种特特异异性性的的转转录录产产物物，因因此此，根根据据某某个个序序列列占占总总标标签签数数的的比比例例可可分分析析所所对对应应基基因因的表达频率。的表达频率。图图6-1 常规常规SAGE方方法（法（short SAGE）基本流程基本流程又叫接头，末端有氨基，防止5端相连锚定酶，即限制性内切酶Schematic of SAGE method: 锚锚定定酶酶识识别别4个个碱碱基基。分分离离3端端酶酶解解片片段段并并将将其其分分为为两两份份，分分别别与与连连接接子子1和和连连接接子子2（均均含含有有IIS类
3、类标标签签酶酶的的识识别别位位点点）结结合合，用用标标签签酶酶（一一种种类类限限制制酶酶，它它能能在在距距离离识识别别位位点点数数个个或或十十数数个个碱碱基基的的位位置置切切割割DNA双双链链）如如BsmF1酶酶切切，将将含含有有连连接接子子1和和2的的样样品品混混合合后测序分析。后测序分析。 LongSAGE技术技术Short SAGE技术用技术用14个碱基个碱基的标签代表一个基的标签代表一个基因，不能覆盖大基因组（如人类）内所有的基因因，不能覆盖大基因组（如人类）内所有的基因序列。序列。LongSAGE技术所用标签来自转录物技术所用标签来自转录物3端一段端一段21bp的序列，可以进行快速分
4、析并与基因组序列的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理与数据相匹配。其原理与ShortSAGE方法类似，只方法类似，只是用了不同的是用了不同的IIS类标签酶（类标签酶（MmeI），并将程序），并将程序做了相应修改。做了相应修改。6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术的选择性剪接技术 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个个mRNA前体产生不同的前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。剪接异构体的过程。包括：包括： 平衡剪切、平衡剪切、5选择性剪切、选择性剪切、3选择性剪切、外显选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。子遗漏型剪切
5、及相互排斥性剪切。图图6-2 6-2 选择性剪切的不同类型选择性剪切的不同类型 图图6-4 6-4 果蝇（果蝇（Drosophila melanogasterDrosophila melanogaster）的）的DscamDscam基因可基因可以通过可变剪接产生以通过可变剪接产生3800038000多种可能的多种可能的mRNAmRNA异构体异构体 6. 1. 3 原位杂交技术原位杂交技术原位杂交原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体检测体系，在组织、
6、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的的mRNA分子，两者杂交产生双链分子，两者杂交产生双链RNA，可，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。因的表达产物做出定性定量分析。m
7、RNAmRNA的的互互补补链链，杂杂交交信信号号集集中中于于纤维细胞中。纤维细胞中。负负对对照照，mRNAmRNA的的同同义义链链, , 无无杂杂交交信号。信号。正对照，正对照，UBQ10UBQ10杂杂交交信信号号遍遍布布于于整个胚珠。整个胚珠。Expression pattern of BARD1In Situ hybridizationHan P, Li Q, Zhu YX. (2008) Mutation in the Arabidopsis BARD1 BRCT Domain Releases WUSCHEL Expression from the Organizing Center.
8、 The Plant Cell 20: 1482-1493. 荧光原位杂交荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH).对对寡寡核核苷苷酸酸探探针针做做特特殊殊的的修修饰饰和和标标记记，用用原原位位杂杂交交法法与与靶靶染染色色体体或或DNA上上特特定定的的序序列列结结合合，再再通通过过与与荧荧光光素素分分子子相相耦耦联联的的单单克克隆隆抗抗体来确定该体来确定该DNA序列在染色体上的位置。序列在染色体上的位置。人肌糖原磷酸人肌糖原磷酸酶基因在酶基因在1111号号染色体的定位染色体的定位结果。结果。6. 1. 4 基因定点突变基因定点突变(site
9、-directed mutagenesis).通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。修饰表达载体、引入新的酶切位点等。图图6-6 6-6 寡寡核核苷苷酸酸介介导导的的DNADNA突突变变技技术术 目目前前，主主要要采采用用两两种种PCR方方法法，重重叠叠延延伸伸技技术术和和
10、大大引引物物诱诱变变法法，在在基基因因序序列列中中进进行行定定点点突变。突变。 重重叠叠延延伸伸诱诱变变法法示示意意图图图图6-8 6-8 大引物诱变法示意图大引物诱变法示意图 6. 2 基因敲除技术基因敲除技术6. 2. 1 基本原理基本原理经经典典遗遗传传学学（Forward genetics）是是从从一一个个突突变变体体的的表表型型出出发发，研研究究其其基基因因型型，进进而而找出该基因的编码序列。找出该基因的编码序列。现现代代遗遗传传学学（Reverse genetics，反反向向遗遗传传学学）首首先先从从基基因因序序列列出出发发，推推测测其其表表现现型型，进而推导出该基因的功能。进而推
11、导出该基因的功能。基基因因敲敲除除（gene knock-out）又又称称基基因因打打靶靶，通通过过外外源源DNADNA与与染染色色体体DNADNA之之间间的的同同源源重重组组，进进行行精精确确的的定定点点修修饰饰和和基基因因改改造造，具具有有专专一一性性强强、染染色色体体DNA可可与与目目的的片片段段共共同同稳稳定定遗遗传传等等特特点。点。基基因因敲敲除除分分为为完完全全基基因因敲敲除除和和条条件件型型基基因因敲敲除（又称不完全基因敲除）两种。除（又称不完全基因敲除）两种。完完全全基基因因敲敲除除是是指指通通过过同同源源重重组组法法完完全全消消除除细细胞胞或或者者动动物物个个体体中中的的靶靶
12、基基因因活活性性，条条件件型型基基因因敲敲除除是是指指通通过过定定位位重重组组系系统统实实现现特特定定时时间和空间的基因敲除。间和空间的基因敲除。噬噬菌菌体体的的Cre/Loxp系系统统、Gin/Gix系系统统、酵酵母母细细胞胞的的FLP/FRT系系统统和和R/RS系系统统是是现现阶阶段段常常用用的的四四种种定定位位重重组组系系统统，尤尤以以Cre/Loxp系系统统应用最为广泛。应用最为广泛。图图6-9 用取代型（用取代型（a）或插入型或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验载体进行完全基因敲除实验 图图6-10 正负筛选法（正负筛选法（PNS法）筛选已发生同法）筛选已发生同源重组的细胞源重组的
13、细胞 正正向向选选择择基基因因neo通通常常被被插插入入载载体体靶靶DNA功功能能最最关关键键的的外外显显子子中中，或或通通过过同同源源重重组法置换靶基因的功能区。组法置换靶基因的功能区。 负负向向选选择择基基因因HSV-tk则则被被置置于于目目的的片片段段外外侧侧，含含有有该该基基因因的的重重组组细细胞胞不不能能在在选选择择培培养养基基上上生生长长。如如果果细细胞胞中中发发生生了了随随机机重重组组，负负向向选选择择基基因因就就可可能能被被整整合合到到基基因因组组中中，导导致细胞死亡。致细胞死亡。 6. 2. 2 高等动物基因敲除技术高等动物基因敲除技术真真核核生生物物基基因因敲敲除除的的技技
14、术术路路线线主主要要包包括括构构建建重重组组基基因因载载体体，用用电电穿穿孔孔、显显微微注注射射等等方方法法把把重重组组DNA导导入入胚胚胎胎干干细细胞胞纯纯系系中中，使使外外源源DNA与与胚胚胎胎干干细细胞胞基基因因组组中中相相应应部部分分发发生生同同源源重重组组，将将重重组组载载体体中中的的DNA序序列列整整合到内源基因组中并得以表达。合到内源基因组中并得以表达。图图6-12 模模式式动动物物小小鼠鼠中中完完全全基基因因敲敲除除的的主主要要技技术术策略与应用。策略与应用。显显微微注注射射命命中中率率较较高高，技技术术难难度度相相对对大大些些。电电穿穿孔孔法法命命中中率率比比显显微微注注射射
15、低低，操操作作使使用用方方便。便。胚胚胎胎干干细细胞胞（ES细细胞胞）分分离离和和体体外外培培养养的的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。6. 2. 3 植物基因敲除技术植物基因敲除技术T-DNA插插入入失失活活技技术术是是目目前前在在植植物物中中使使用用最最为广泛的基因敲除手段。为广泛的基因敲除手段。利利用用根根癌癌农农杆杆菌菌T-DNA介介导导转转化化，将将带带有有报报告告基基因因的的DNA序序列列整整合合到到基基因因组组DNA上上，如如果果这这段段DNA插插入入到到目目的的基基因因内内部部或或附附近近，就就会会影影响响该该基基因因的的表表达达，从从
16、而而使使该该基基因因“失失活活”。图图6-14 6-14 植植物物基基因因敲敲除除及突变体筛选及突变体筛选 a.a.引引物物设设计计。LPLP和和RPRP分分别别代代表表插插入入基基因因两两端端的的引引物物，LBLB是是指指载载体体上上的的一一段段引引物物，目目的的基基因因片片段段( (设设为为900bp)900bp)。旁旁邻邻序序列列是是经经测测序序后后获获得得的的DNADNA序序列列。b b，PCRPCR产产物物电电泳泳结结果果。分分别别代代表表野野生生型型、杂杂合合子子和和纯纯合合子子PCRPCR条带。条带。Identifiation of bard1-3 homozygous line
17、s6. 3 蛋白质及蛋白质及DNA相互作用技术相互作用技术6. 3. 1 酵酵母母单单杂杂交交系系统统（Yeast one-hybrid system）是是上上世世纪纪90年年代代中中发发展展起起来来的的研研究究DNA-蛋蛋白白质质之之间间相相互互作作用用的的新新技技术术，在在酵酵母母细细胞胞内内研研究究真真核核生生物物中中DNA-蛋蛋白白质质之之间间的的相相互互作作用用，并并通通过过筛筛选选DNA文文库库直直接接获获得得靶靶序序列列相相互作用蛋白的编码基因。互作用蛋白的编码基因。将将顺顺式式作作用用元元件件与与最最基基本本启启动动子子（minimal promoter，Pmin）相相连连并并
18、将将报报告告基基因因连连到到Pmin下下游游，将将待待测测转转录录因因子子cDNA与与酵酵母母转转录录激激活活结结构构域域（transcription-activating domain, AD）融融合合表表达达载载体体导导入入酵酵母母细细胞胞，该该基基因因产产物物如如果果能能够够与与顺顺式式作作用用元元件件相相结结合合，就激活就激活Pmin启动子，报告基因表达。启动子，报告基因表达。 图图6-15 6-15 酵母单杂交的基本原理示意图酵母单杂交的基本原理示意图 图图6-16 从从拟拟南南芥芥cDNA文文库库中中筛筛选选与与顺顺式式元元件件DRE结结合合的的转转录录因因子子示示意意图。图。将不
19、同基因或基因片段分别克隆到将不同基因或基因片段分别克隆到pYF503pYF503中中(GAL4 AD (GAL4 AD 为为GAL4 GAL4 激活结构域激活结构域, empty vector , empty vector 表示无基因克隆到表示无基因克隆到pYF503pYF503中中), ), 转入酵母中表转入酵母中表达达N N端带有端带有GAL4 DNAGAL4 DNA结合结构域的融合蛋白，结合结构域的融合蛋白，观察报告基因表达与否。观察报告基因表达与否。Identification of trans-activation property of QRAP2 by yeast one-hyb
20、rid assay. Plasmid DNA from various constructs was transformed into yeast cells and the abilities of transcription activation of the recombinant protein was identified via blue/white selection.No blue color was observed in yeast cells transformed with either the empty vector (contains only the GAL4
21、DNA-binding domain)a full-length UBQ10 genethe C-terminus (from amino acid 113-292) of QRAP2 ligated to the GAL4 DNA-binding domain.6. 3. 2 酵酵母母双双杂杂交交系系统统（Yeast two-hybrid system） 真真 核核 生生 物物 转转 录录 调调 控控 因因 子子 具具 有有 组组 件件 式式 结结 构构（modular）特特征征，这这些些蛋蛋白白往往往往由由两两个个或或两两个个以以上上相相互互独独立立的的结结构构域域，其其中中DNA结结合合
22、结结构构域域（binding domain， BD） 和和 转转 录录 激激 活活 结结 构构 域域 （ activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。）是转录激活因子发挥功能所必须的。BD能能与与特特定定基基因因启启动动区区结结合合，但但不不能能激激活活基基因因转转录录，由由不不同同转转录录调调控控因因子子的的BD和和AD所所形形成成的的杂杂合合蛋蛋白白却却能行使激活转录的功能。能行使激活转录的功能。图图6-17 6-17 酵母双杂交技术原理示意图酵母双杂交技术原理示意图 6. 3. 3 体外蛋白质相互作用技术体外蛋白质相互作用技术1、Far Western印迹技
23、术印迹技术用用32P标标记记的的体体外外表表达达蛋蛋白白作作探探针针,直直接接检检测测与与该该蛋蛋白白发发生生相相互互作作用用的的蛋蛋白白或或表表达达该该蛋蛋白白的的cDNA。图图6-18 Far Western印印迹试验迹试验 2、GST融合蛋白沉降技术融合蛋白沉降技术利用利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。用蛋白。图图6-19 GST融合蛋融合蛋白沉降技术流程。白沉降技术流程。 3、蛋白质芯片技术、蛋白质芯片技术蛋蛋白白质质芯芯片片可可以以用用来来大大规规模模筛筛选选蛋蛋白
24、白之之间间的的相相互互作作用用。将将荧荧光光标标记记的的探探针针蛋蛋白白与与蛋蛋白白质质芯芯片片孵孵育育，洗洗脱脱非非特特异异性性结结合合的的蛋蛋白白后后，可可以以通通过过扫扫描描芯芯片片上上的的荧荧光光点点检检测测到到稳稳定定的的相相互作用蛋白点互作用蛋白点 。Gong W. et al. (2008) Molecular Plant1: 27-41.4、等离子表面共振技术等离子表面共振技术将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同如果有蛋白质同“诱饵诱饵”蛋白发生
25、相互作用，蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。升，导致共振角度的改变。图图6-21 6-21 等离子表面共振技术示意图等离子表面共振技术示意图 5、免疫共沉淀技术、免疫共沉淀技术( (Co-IP) )将将靶靶蛋蛋白白的的抗抗体体连连接接到到固固体体基基质质上上，再再将将可可能能与与靶靶蛋蛋白白发发生生相相互互作作用用的的待待筛筛选选蛋蛋白白加加入入反反应应体体系系中中，用用低低离离心心力力沉沉淀淀或或微微膜膜过过滤滤法法在在固固体体基基质质和和抗抗体体的的共共同同作作用用下下将将蛋蛋白白复复合合物沉淀到试管的底部
26、或微膜上。物沉淀到试管的底部或微膜上。免疫共沉淀免疫共沉淀示意图示意图 6. 3. 4 细细胞胞内内蛋蛋白白质质相相互互作作用用研研究究荧荧光光共共振振能量转移法（能量转移法（FRET）FRET荧光能量转移有三个基本条件：荧光能量转移有三个基本条件：（1）给体与受体在合适的距离（）给体与受体在合适的距离（110 nm）；）；（2）给给体体的的发发射射光光谱谱与与受受体体的的吸吸收收光光谱谱有有一一定的重叠（这是能量匹配的条件）；定的重叠（这是能量匹配的条件）；（3）给给体体与与受受体体的的偶偶极极具具有有一一定定的的空空间间取取向向（这是偶极（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。偶极耦合作用的条件
27、）。图图6-23 荧光共振能量转移法荧光共振能量转移法 FRET需需要要有有两两个个探探针针，即即荧荧光光给给体体和和荧荧光光受受体体，要要求求给给体体的的发发射射光光谱谱与与受受体体的的吸吸收收光光谱谱有有一一定定的的重重叠叠，而而与与受受体体的的发发射射光光谱谱尽尽量量没没有有重重叠叠。不不同同蛋蛋白白的的吸吸收收和和发发射射波波长长不不同同，可可根根据据需需要要组组成成不不同同的的探探针针对对。常常用用的的探探针针有：有：荧光蛋白荧光蛋白传统有机染料传统有机染料镧系染料镧系染料荧荧光光蛋蛋白白，一一类类能能发发射射荧荧光光的的天天然然蛋蛋白白及及其其突变体。突变体。传统有机染料，具有特征
28、吸收和发射光谱的传统有机染料，具有特征吸收和发射光谱的有机化合物组成的染料对。包括荧光素、罗有机化合物组成的染料对。包括荧光素、罗丹明类化合物和青色染料丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等。等。镧系染料，金属染料。一般与有机染料联用，镧系染料，金属染料。一般与有机染料联用，分别作为分别作为FRET的给体或受体，以提高检测的的给体或受体，以提高检测的准确性和信噪比。准确性和信噪比。6. 3. 5 RNAi（RNA interference, RNA干干涉涉）技术及其应用技术及其应用RNAi技技术术利利用用双双链链小小RNA高高效效、特特异异性性降降解解细细胞胞内内同同源源mRNA从从而而阻阻断
29、断靶靶基基因因表表达达，使使细细胞胞出出现现靶靶基基因因缺缺失失的的表表型型。RNAi的的命命名名来来源源于于安安德德鲁鲁法法尔尔1998年年在在自自然然杂杂志志上上的论文。的论文。 RNAi作用机作用机制示意图。制示意图。研研究究发发现现，双双链链RNA是是RNAi的的触触发发物物，引引发发与与之之互互补补的的单单链链RNA（ssRNA, single-stranded RNA）的降解。）的降解。经经过过Dicer（一一种种具具有有RNAase III活活性性的的核核酸酸酶酶）的的加加工工，细细胞胞中中较较长长的的双双链链RNA（30个个核核苷苷酸酸以以上上）首首先先被被降降解解形形成成21
30、25个个核核苷苷酸酸的的小小分分子子干干扰扰核核糖糖核核酸酸（siRNA，short interfering RNA），并并有有效效地地定定位位目目标标mRNA。由由siRNA中中的的反反义义链链参参与与指指导导合合成成被被称称为为RNA诱诱导导的的沉沉默默复复合合体体（RISC）的的核核蛋蛋白白体体，再再由由RISC介介导导切切割割目目的的mRNA分分子子中中与与siRNA反反义义链链互互补补的的区区域域，从从而而实实现现干干扰扰靶靶基因表达的功能。基因表达的功能。 Phenotypic characterization of bard1-36. 4 基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析基基
31、因因芯芯片片（DNA chip），又又称称DNA微微阵阵列列（DNA microarray）技技术术是是能能同同时时监监测测大大量量靶靶基基因因表表达达的的实实验验手手段段，从从而而迅迅速速准准确确地地在在基基因因组组水水平平上上阐阐述述不不同同生生物物组组织织或或细细胞胞中中各各种种转转录录本本（一一条条基基因因通通过过转转录录形形成成的的一一种种或或多多种种可可供供编码蛋白质的成熟的编码蛋白质的成熟的mRNA ）的变化规律。的变化规律。基因芯片技术流程图基因芯片技术流程图 简易基因芯片简易基因芯片使使用用机机械械臂臂把把DNA片片段段点点在在玻玻璃璃片片或或尼尼龙龙膜膜上上，经经过过物物理
32、理吸吸附附作作用用达达到到固固定定化化。也也可可以以直直接接在在玻玻璃璃板板表表面面进进行行化化学学合合成成，从从而而得得到到寡寡聚聚核核苷苷酸酸芯芯片片。将将芯芯片片与与待待研研究究的的cDNA或或其其它它样样品品杂杂交交，经经过过计计算算机机扫扫描描和和数数据据处处理理，便便可可以以观观察察到到大大规规模模的的基基因因群群在在不不同同组组织织或或同同一一组组织织不不同同发发育育时时期期或或不不同同生生理理条条件件下的表达模式。下的表达模式。包含包含280个棉花个棉花cDNA的简易芯的简易芯片的杂交图谱。片的杂交图谱。 Ji SJ et al. (2003) Nucleic Acid Res
33、earch, 31: 2534-2543. 纤维细胞组织RNA杂交结果胚珠细胞组织RNA杂交结果大规模基因芯片（大于大规模基因芯片（大于10000个基因）的应用个基因）的应用基基因因芯芯片片可可用用于于进进行行基基因因诊诊断断。先先建建立立正正常常人人特特定定组组织织、器器官官的的基基因因芯芯片片，给给出出标标准准杂杂交交信信号号图图，用用可可疑疑病病人人的的cDNAcDNA做做探探针针与与之之杂杂交交，确确定哪些基因的表达受抑制或激活。定哪些基因的表达受抑制或激活。6. 5 其它分子生物学技术其它分子生物学技术1、 凝胶滞缓实验凝胶滞缓实验凝凝胶胶滞滞缓缓试试验验（gel retardati
34、on assay），又又叫叫作作DNA迁迁移移率率变变动动试试验验（DNA mobility shift assay），是是用用于于体体外外研研究究DNA与与蛋蛋白白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。原理：原理：在在凝凝胶胶电电泳泳中中，由由于于电电场场的的作作用用，裸裸露露的的DNADNA朝朝正正电电极极移移动动的的距距离离与与其其分分子子量量的的对对数数成成反反比比。如如果果此此时时DNADNA分分子子与与某某种种蛋蛋白白质质相相结结合合，那那么么，由由于于分分子子量量增增大大，它它在在凝凝胶胶中中的的迁迁移移作作用用便便会会受受到到阻阻滞滞，在在特特
35、定定电电压压和和时时间间内内朝朝正正电电极极移移动的距离也就相应缩短了动的距离也就相应缩短了。2、 噬菌体展示技术噬菌体展示技术噬菌体是细菌病毒的总称，英文为噬菌体是细菌病毒的总称，英文为Bacteriophage，来源于希腊文，来源于希腊文“phagos”，有有“吞噬吞噬”之意。之意。噬菌体可被分为噬菌体可被分为溶菌周期溶菌周期和和溶源周期溶源周期两种不同的类型。在两种不同的类型。在溶菌周期溶菌周期，噬菌，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的“制造厂制造厂”，产生出大量的子代，产生出大量的子代噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作噬菌体颗
36、粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体烈性噬菌体。溶源周期溶源周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体 DNA是整是整合到寄主细胞染色体合到寄主细胞染色体 DNA上，成为它的一个组成部分。具有这种溶源周期上，成为它的一个组成部分。具有这种溶源周期的噬菌体，叫做的噬菌体，叫做温和噬菌体温和噬菌体。 噬菌体展示技术的基本原理噬菌体展示技术的基本原理是将编码是将编码“诱饵诱饵”蛋白的蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重
37、组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中捕获靶蛋白库中与与“诱饵诱饵”相互作用的蛋白质。相互作用的蛋白质。噬菌体展噬菌体展示技术研示技术研究蛋白质究蛋白质相互作用相互作用 3. 蛋白质磷酸化分析技术蛋白质磷酸化分析技术由由于于细细胞胞内内可可能能有有多多达达上上千千个个蛋蛋白白激激酶酶（催催化化体体内内蛋蛋白白质质的的磷磷酸酸化化），体体内内检检测测某某个个蛋蛋白白激激酶酶活活性性非非常常困困难难，科科学学家家常常用用体体外外激激酶酶活活性性分分析析法法来来检检测测蛋蛋白白激激酶酶
38、活活性性。该该方方法法能能十十分分可可靠靠地地鉴鉴定定某某个个蛋蛋白白激激酶酶对对底底物物的的磷磷酸酸化化作作用用，筛筛查激酶的特异性底物。查激酶的特异性底物。 蛋白激酶体外磷酸化活性分析蛋白激酶体外磷酸化活性分析泳道1、4、5中的蛋白质具有使蛋白质磷酸化的激酶活性，泳道2、3、6中的蛋白质不能使底物蛋白磷酸化 思考题：思考题： 1 1、列举两种研究基因表达模式的方法并简述其原理。、列举两种研究基因表达模式的方法并简述其原理。 2 2、RNARNA原位杂交的主要实验过程及应用。原位杂交的主要实验过程及应用。 3 3、果蝇、果蝇DscamDscam基因通过可变剪接产生基因通过可变剪接产生3800
39、038000多种可能的多种可能的mRNAmRNA异构异构 体，说说其生物学意义。体，说说其生物学意义。 4 4、基因定点突变的原理与实验过程。、基因定点突变的原理与实验过程。 5 5、什么是完全基因敲除和条件型基因敲除。、什么是完全基因敲除和条件型基因敲除。 6 6、比较酵母双杂交系统与免疫共沉淀、比较酵母双杂交系统与免疫共沉淀(Co-IP)(Co-IP)技术在研究蛋白质技术在研究蛋白质 相互作用方面的优缺点。相互作用方面的优缺点。 7 7、等离子表面共振技术的原理与实验过程。、等离子表面共振技术的原理与实验过程。 8 8、RNAiRNAi技术原理。技术原理。 9 9、基因芯片技术及应用。、基因芯片技术及应用。1010、凝胶滞缓实验的原理与应用。、凝胶滞缓实验的原理与应用。
