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1、血常规检查与镜检温州医学院附属第二医院李向阳Page 2今日议题n血常规检查的内容n血球分析仪的发展历程n镜检的意义n血球分析仪存在的问题及解决方案Page 3血常规检查的内容n血红蛋白测定n各种细胞计数及比例n各种细胞的形态学变化n血液中其它物质和生物体Page 4各种细胞的形态学Page 5各种细胞的形态学Page 6Page 7各种细胞的形态学Page 8 Page 9Page 10Page 11Page 12Page 13Page 14Page 15血球计数仪的发展史n590 年荷兰人米德尔堡和詹森设计制造了最原始的显微镜n1610年伽利略使用望远镜观察小的物体并将其放大，后来被列文霍
2、克改进成为原始的显微镜。n1658 年意大利人马尔皮基应用最原始的显微镜首先观察到了红细胞，他是第一个见到红细胞的人n开始进行红细胞计数则是200 年后的事情了n而设计并生产出第一台血细胞计数仪则又过了近100 年。Page 16 n1852 年就有人开始设计对红细胞的计数办法n1855 年发明了用于计数血细胞的计数板n 目前仍然使用的改良Neubauer 计数板就是应用最为广泛和持续时间最为长久的经典一种，仍然是最为可靠和最为经典的计数技术n它不仅适用于血细胞计数，还可用于其他细胞、动物血细胞、微小粒子及需要在显微镜下计数的各种样品。Page 17 n直到Paul Ehrlich通过用苯胺染
3、料(aniline dyes)对血细胞进行染色，可以区分细胞核、细胞浆以及一些完好的细胞结构n把各种不同的白色的细胞（white cells）划分为五种类型，也就是今天仍然沿用的分类标准。 Page 18n1912年出生在美国阿肯色州一个小城的人Wallance H. Coulter发现了微小粒子通过特殊的小孔时可产生电阻变化这一现象，并根据这种电阻变化特点将其应用于微小粒子的粒度测量和计数上。科技界为表彰他的发明，将其称为库尔特原理（Coulterprinciple ）。 nCoulter 先生将其引入到血液细胞计数上，在1953年获得美国发明专利 Page 19细胞分类仪 器 将 体 积
4、为 3535 450fL450fL的 血 细 胞 ， 分 为 256256个 通 道（channelchannel）。每个通道：1.64fl1.64fl。根据细胞大小，分别置于不同的通道中，显示血细胞体积分布直方图(Histogram)(Histogram)。 经溶血素处理脱水后，血细胞体积大小发生了变化！第一群（353590fl90fl）小细胞区：淋巴细胞（体积最小）。第二群（9090160fl160fl）单个核细胞区，（中间细胞）：单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原始、幼稚细胞、异常细胞等。第三群（160fl160fl以上）大细胞区：嗜中性粒细胞（体积最大）。Page 20n经过半个
5、多世纪的发展，这种仪器已经有了非常明显的进步。以前因为只能进行细胞计数，因此我们一般将这类仪器叫做血细胞计数仪（Blood Cell Counter）,由于技术的进步目前这类仪器可以提供除了血细胞计数以外的更多参数的联合测定和分析，因此我们一般将这类仪器统称为血液细胞分析仪(Hematology Analyzer) 。 n光散射法血液分析仪检测原理 组合应用 电学 光学 细胞化学等Page 21血细胞分类方法n采用VCS技术进行五分类的仪器n采用采用阻抗、激光散射和荧光染色技术 n激光散射和细胞化学染色技术 n多角度偏振光散射法应用于白细胞五分类（MAPSS技术） n采用图像分析的单纯细胞分类
6、仪 Page 22VCS技术nV代表体积测量法，可有效区分体积大小差异显著的淋巴细胞和单核细胞。nC代表高频电导性。细胞核的化学组份可使电流的传导性产生变化，其变化量可以反映出细胞内含物的信息。可区分体积相近而内部性质不同的细胞群体，如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞nS代表激光散射测量技术，激光束可穿透细胞，探测细胞内核分叶状况和胞浆中的颗粒情况，以区分出颗粒特性不同的细胞群体。例如细胞内颗粒粗的要比颗粒细的散射光更强，因此可以用于区分粒细胞中的嗜中性、嗜酸性和嗜碱性三种细胞。Page 23阻抗、激光散射和荧光染色技术n白细胞分析nDIFF通道： STROMATOLYSER-4DL试剂中的表面活性剂可
7、以溶解掉标本中的红细胞和血小板，并在白细胞膜上打出小孔；然后第二种试剂 TROMATOLYSER-4DS中的聚次甲基染料通过这个小孔进入白细胞中，与细胞核的核酸和细胞器结合，在经过波长633nm的激光照射，产生的荧光强度与细胞的核酸含量成正比。STROMATOLYSER -4DL试剂还具有与嗜酸性颗粒特异性结合的能力，可根据侧向散射光信号强度，将嗜酸性粒细胞从中性粒细胞中分离出来。n前向散射光（FSC）信号可反应细胞体积大小；侧向散射光（SSC）信号可反应细胞的颗粒和细胞核等内含物的信息n在DIFF散射图当中可以得到中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等四个分群Page 24nWBC/
8、BASO通道是专用作检测嗜碱性粒细胞的通道nSTROMATOLYSER FB是一种酸性试剂，可将红细胞和血小板形成淡影化，将除嗜碱性粒细胞以外的白细胞处理成裸核形态，然后采用前向散射光（FSC）信号和侧向散射光（SSC）信号使嗜碱性粒细胞从其它细胞中分离出来。Page 25核酸荧光染色法n幼稚粒细胞分析上有特殊的IMI通道，在IMI检测通道中主要应用射频（RF）技术和直流电阻抗法（DC）。这个测定通道根据幼稚细胞膜表面比成熟细胞膜表面含有脂质少的现象，在稀释液中加入硫化氨基酸（IM试剂），由于占位不同，结合在幼稚细胞表面的氨基酸较多，对溶血剂有抵抗作用，对幼稚细胞具有保护作用。当加入溶血剂后成
9、熟细胞易被溶解掉，而幼稚细胞不易被溶解破坏，n用通道-NRBC通道，在处理标本时加入STROMATOLYSERNR专用试剂，它能使成熟红细胞溶解又可保持有核红细胞的核结构，通过检测荧光强度得到：白细胞核大荧光强度高，有核红细胞核小，荧光强度低，正常红细胞无细胞核和破碎，荧光强度极低。Page 26激光散射和细胞化学染色技术 n在白细胞分类上采用了白细胞过氧化酶测定通道和嗜碱粒细胞测定通道。n嗜酸性粒细胞具有最强的过氧化物酶，中性粒细胞含有较强的过氧化物酶，嗜碱粒细胞不含此酶。单核细胞除早期原始阶段外，均含有较弱的过氧化物酶。淋巴细胞不含过氧化物酶。n根据激光法散射光强度进行的细胞体积的测量同时
10、也获得了细胞大小的信息n在白细胞过氧化物酶散点图上，X 轴表现过氧化物酶强度，过氧化物酶强阳性细胞位于右端；Y轴表现散射光强度信号。n嗜碱细胞则是通过嗜碱细胞和分叶核通道测定的，因淋巴细胞与嗜碱粒细胞都无过氧化物酶Page 27多角度偏振光散射法应用于白细胞五分类（MAPSS技术） n标本在水动力聚焦系统的作用下进入检测部，在激光束的照射下，细胞在多个角度都产生散射光。仪器特别设置了四个角度来收集散射光的信号。n0度为前角光散射， 用于粗略判断细胞体积大小；n10 度为狭角散射， 用于检测细胞结构及其内部复杂性的指标；n90度为垂直光散射，用于对细胞内部颗粒及细胞核分叶情况的分析；n90 度偏
11、振光散射，基于颗粒可以将垂直角度的激光消偏振的特性，将嗜酸性细胞从中性粒细胞和其他细胞中分离出来。Page 28血球分析仪的盲点n红细胞形态nRBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDWn球形？大or小，哪个多？中心淡染区情况？细胞内有无异常？碎片？n有核细胞n除了正常大小，细胞内限定的内含物之外概不知道！n各类细胞间有干扰Page 29环境温度的干扰n计数时稀释液的温度应为(22土4)n有些溶血剂在低温时可出现结晶n白细胞计数增高n易激活血小板，引起血小板凝集，造成血小板计数假性降低n刘忠伦等报告n1O时血小板计数结果仪器法显著低于手工法，且血小板直方图异常；25 时仪器法计数结
12、果与手工法一致，显示正常的血小板直方图Page 30抗凝剂的影响nICSH推荐采用EDTA-K2抗凝的静脉血进行血液细胞分析n血量过多抗凝不充分，会出现凝块；血量过少，会导致抗凝剂过浓，延长血细胞内外K+的平衡时间Page 31标本放置时间的影响n静脉全血标本，大部分参数在8 h内没有显著改变n平均血小板体积、血小板分布宽度、大血小板比率和血小板压积在2 h内已明显增高n标本放置时间过长会导致细胞分层，分层的细胞会产生不同的代谢物，形成微环境Page 32生理和病理因素的干扰n对新生儿血液进行分析时，使用正常量溶血剂计数白细胞，各项结果与实际有差异n常规溶血剂用量不能将红细胞完全破坏n当平均红
13、细胞体积小于70 fL70 fL时，血小板计数假性升高，这时需用显微镜人工计数才能得到准确的结果n黄疸n导致血小板计数降低，与胆红素浓度呈负相关，相关系数为-0.9925-0.9925；当胆红素浓度大于或等于47.247.2mol/Lmol/L时，血红蛋白测定受干扰n乳糜标本，血红蛋白浓度假性增高，相关系数为0.99910.9991；Page 33生理和病理因素的干扰n脂血标本n脂血是最常见的干扰因素，干扰所有型号的血液分析仪的HGBHGB、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)(MCHC)、WBCWBC、PLTPLT等参数的检测。n脂肪乳液成为临床常用
14、肠外营养和高脂血症患者的增加Page 34生理和病理因素的干扰n冷凝集标本n某些疾病的患者( (如支原体肺炎等) )血液里存在冷凝集素，使血液RBCRBC在离开机体后几分钟内发生聚集。干扰所有型号的血液分析仪的RBCRBC、MCVMCV和MCHCMCHC等参数。n在报告单的备注栏注明该标本有冷凝集现象，并提示医生注意Page 35生理和病理因素的干扰nRBCRBC缗钱状标本n某些疾病( (如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症等) )的血液标本RBCRBC呈缗钱状排列。干扰所有型号的血液分析仪的RBCRBC、MCVMCV和MCHCMCHC等参数。n在报告单备注栏注明该标本的RBCRBC呈缗钱状排列，提示
15、医生注意( (该现象对诊断浆细胞系统疾病很有帮助) )。Page 36生理和病理因素的干扰n难溶血或溶血不良( (细胞碎片) )标本n某些疾病，如严重肝病、球形RBCRBC增多症等。n全博等对3O3O例肝病患者的全血标本用血液分析仪进行了分析，对WBCWBC异常增高的样本进行手工复检，同时用洗涤法与水浴法排除了高球蛋白、纤维蛋白原与冷凝集素的干扰以及用溶血剂破坏RBCRBC后重新进行试验。结果显示其测定值同手工测定结果一致n说明WBCWBC的异常增高与RBCRBC的存在有关n由于疾病因素的影响而使红细胞膜抗溶性增强，最终影响WBCWBC的准确计数Page 37生理和病理因素的干扰n马晓明等报道
16、3 3例病例，临床体征均有严重的感染，嗜碱性粒细胞计数均增高 用瑞氏染色法进行人工复片发现中性粒细胞呈中毒性改变，粒细胞中出现了大量的中毒颗粒、形似嗜碱性颗粒，同时细胞核分叶减少固缩，染色质呈块状，核浆比例改变，影响了血细胞分析仪的判读，最终造成了嗜碱性粒细胞假性升高的结果。Page 38生理和病理因素的干扰n溶血标本n某些伤害(如毒蛇咬伤后)诱发的弥散性血管内溶血(DIC)，或采血不顺利等因素可引起标本溶血。干扰所有型号的血液分析仪RBC、MCV和MCHC等参数。Page 39生理和病理因素的干扰n小RBCRBCn由于方法学的问题，某些贫血( (如缺铁性贫血、地中海贫血等) )患者的小RBC
17、RBC对KX-21KX-21、K4500K4500和XS-1000iXS-1000i等仪器测定PLTPLT数量时有明显干扰，使PLTPLT假性增高。Page 40生理和病理因素的干扰n巨大PLTPLTn如PLTPLT增多症、慢性粒细胞白血病等血液系统疾病患者血液中可能出现与WBCWBC大小样的巨大PLTPLT，其干扰所有型号的血液分析仪的WBCWBC参数。Page 41生理和病理因素的干扰nPLTPLT聚集n采血不顺利或部分患者高凝状态。干扰所有型号血液分析仪的PLTPLT参数。nPLTPLT卫星现象nPLTPLT聚集在中性粒细胞周围的现象，称为卫星现象，出现这种现象公认的原因，是在当血液与E
18、DTAEDTA抗凝剂接触的15min15min内可能出现。但有少数患者的标本，采集2h2h后仍存在此现象，干扰所有型号的血液分析仪的PLTPLT参数。Page 42生理和病理因素的干扰n有核红细胞(NRBC)(NRBC)n在某些病理情况下外周血出现NRBCNRBC，干扰所有型号血液分析仪的WBCWBC参数。n高WBCWBCn某些疾病( (如白血病) )引起WBCWBC异常增高。干扰所有型号血液分析仪的RBCRBC参数。Page 43生理和病理因素的干扰n豪- -周(Howell-Jollys(Howell-Jollys，HJ)HJ)小体n见于巨幼RBCRBC贫血和溶血性贫血、脾切除等，为RBC
19、RBC内存在的染色质小体，干扰XE-2100XE-2100血液分析仪的RETRET参数。n疟原虫n寄生在RBCRBC内的疟原虫使RETRET计数假性增高 。干扰XE-2100XE-2100血液分析仪的RETRET参数。Page 44生理和病理因素的干扰n敖凌云等报道，血细胞仪分析标本结果显示，白细胞直方图在5O fL5O fL以下出现异常峰，红细胞提示怀疑有核红细胞存在，血小板提示怀疑血小板聚集。n在排除其他干扰因素后，经涂片染色，油镜下检查发现间日疟原虫。Page 45生理和病理因素的干扰n念珠菌孢子n念珠菌菌血症患者血液里的真菌孢子可对所有型号的仪器的WBCWBC、PLTPLT干扰n院内真
20、菌感染的发病率不断递增Page 46小结n自动化血液分析仪是以正常细胞为模板，建立起来的分析系统，对异常形态的细胞识别能力有限n血液中的各种细胞间有相互干扰n仪器的重复性可能很好，但有可能是“假”的n各种生理和病理情况均会对仪器的分析产生干扰作用Page 47镜检的意义n是血常规检查中不可或缺的内容n是目前任何仪器均无法替代的操作n某些形态学的改变和发现是临床诊断的有力证据n是对仪器分析结果的校正，是最后的确认手段血分析仪结果真的可以直接报告吗？这些能分辨吗？医疗机构临床实验室管理办法认为以下情况均需镜检：血液分析仪检测结果出现异常计数、警示标志、异常散点图等情况这些颗粒能分辨48Page 4
21、9镜检的意义n以患者为中心n降低医疗风险n全局观念n尽快使患者得到有效治疗，解除病痛n缩短平均住院日，加快病床周转，接纳更多的患者n增加收入Page 50镜检的范围国际41条的内容：15条规则关于血细胞计数7条规则关于5种白细胞的分类参数7条规则关于仪器可疑图象或者代码（包括红细胞和血小板）10条规则关于白细胞可疑图象或者代码2条规则关于网织红细胞需要各实验室自己制定和调整面对不同的病人群体可能有不同的标准国际41条？国内23条？27条？有什么差别？哪个适合我们科室？筛选规则的选择与运用v国际血液学联合小组复检筛查41条规则v国内血液协作组Sysmex初检规则27条初检规则（复检23）v贝克曼库尔特血分析仪的规则23条分片规则v浙江省临检中心的分片规则v 06年4月征求意见19条规则 51对速度的要求3.血、尿、便常规检验、心电图、影像常规检查项目自检查开始到出具结果时间30分钟 仪器速度、人力技器速度、人力技术与与报告速度的矛盾告速度的矛盾临床实验室管理办法血液分析检测中的两大关注点QC速度质量Page 54解决方案：全自动推片机导入n具有无比的优越性n推片质量n染色效果n速度Page 55
