临床基因组学临床基因组学第七章第七章 Sanger测序及高通测序及高通量测序技术量测序技术 主要内容主要内容•第一节第一节 核酸测序技术的发展核酸测序技术的发展•第第二节二节 Sanger测序测序技术技术•第三节第三节 高通量测序技术及其应用高通量测序技术及其应用 第三节 高通量测序技术及其应用重点高通量测序的发展二代测序的基本原理及操作流程三代测序的基本原理高通量测序的临床应用 高通量测序的发展高通量测序的发展•人类基因组约含4万到10万个基因，由约3030亿个碱基亿个碱基对组成，分布在细胞核的23对染色体中•1990年，被誉为生命“登月计划”的国际人类基因组计划启动• 1999年9月，中国加入这一研究计划，负责测定人类基因组全部序列的1％•2003年完成，比预计提前2年•六国六国（美、日、英、法、德、中）科学家历经了1313年花费了年花费了2727亿美元亿美元才完成的草图 •尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法 •优势：能同时对无数条DNA分子进行序列测定，效率极高•技术特点：每次测很短的片段（读长较短），但是可以通过超大量的平行测序，获得大量的序列。
下一代”测序技术Next-generationsequencing,NGS 高通量测序的常用名词•高通量测序技术高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)•基因组重测序基因组重测序（Genome Re-sequencing） 是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法 •de novo测序测序 也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱•外显子测序外显子测序（whole exon sequencing） 指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。
•Reads 又称读长，高通量测序中一个反应获得的测序序列或测序出来的一条条序列 •测序深度测序深度 是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值假设一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M•覆盖度覆盖度 是指测序获得的序列占整个基因组的比例 •Contig 拼接软件基于reads之间的overlap区，拼接获得的序列称为Contig（重叠群） •Scaffold 基因组de novo测序，通过reads拼接获得Contigs后，往往还需要构建454 Paired-end库或Illumina Mate-pair库，以获得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列基于这些序列，可以确定一些Contig之间的顺序关系，这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold 高通量测序平台高通量测序平台LifeIon PGM; Ion protonIllumina MiSeqNextSeq 500Roche 454Genome Sequencer FLX Roche 454 Genome Sequencer •GS FLX•GS Junior System GS FLX的基本原理的基本原理 文库构建文库构建扩增测序模板焦磷酸测序数据分析样本样本 文库构建文库构建扩增测序模板扩增测序模板焦磷酸测序焦磷酸测序数据分析数据分析样本样本 (DNA)n + dNTPpolymerase(DNA)n +1 +PPiSulfurylase ATP APS+PPi ATP + luciferin oxyluciferin LucifetasedNTPApyrasedNDP + dNMP + phosphateATPApyraseADP + AMP + phosphate文库构建文库构建扩增测序模板扩增测序模板焦磷酸测序焦磷酸测序数据分析数据分析样本样本 序列是什么呢？CGTAAGGTGATGTATAGGGG.... Life Technology Ion平台平台 Ion PGM™ 系统系统 Ion Proton™系统系统Ion S5™ 系统系统Ion Chef™ 系统系统 Ion torrent PGM的基本原理的基本原理Prepare LibraryClonal AmplificationDNA / RNAData AnalysisLibrary PreparationDNA Sequencing* Isolate Positive Ion Sphere™ ParticlesData AnalysisLoad Chip and SequenceTemplate Preparation* Sensor PlateSilicon SubstrateDrainSourceBulkdNTPTo column receiver∆ pH∆ Q∆ VSensing LayerH+ Sequencing: FlowsIon Sphere -----Primer------ A G T C A A G C G T C C C A T G Sequence of InterestKey SequenceTACGTACGTFlows 1-4…9-12Flows 5-8… etc.TACGFlows 1-4...---Ion Sphere™ Particle • A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step•The flow order repeats with pattern: •‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’CGACGTACGTAA “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle T• A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step•The flow order repeats with pattern:•‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’Sequencing: FlowsIon Sphere -----Primer------ A G T C A A G C G T C C C A T G Sequence of InterestKey SequenceCTACGTACGTFlows 1-4…9-12Flows 5-8… etc.TACGFlows 5-8...---Ion Sphere™ ParticleCGACGTACGTAA “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle TIon Sphere -----Primer------ A G T C A A G C G T C C C A T G Sequence of InterestKey SequenceCTACGTACGTCGACGTACGFlows 1-4…9-12Flows 5-8… etc.TCGTFlows 9+A G...---Ion Sphere™ Particle• A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step•The flow order repeats with pattern:•‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’TTAA “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycleSequencing: Flows TIon Sphere -----Primer------ A G T C A A G C G T C C C A T G Sequence of InterestKey SequenceACGTACGTACGTFlows 1-4…9-12Flows 5-8… etc.TACGTT T C G C A G G G T A CAnd so on…...---Ion Sphere™ Particle• A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step•The flow order repeats with pattern:•‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’CGACGTACGTAA “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycleSequencing: Flows 大家知道接下来的序列是什么吗大家知道接下来的序列是什么吗?AATCTTCTGAATTTCTGCAACTGTG 例一：例一：阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）•是老年痴呆中最常见的一种•渐进性的神经功能退化•整体认知能力的下降•早发性AD主要是由β-淀粉样前体蛋白(APP)基因和早老素基因突变引起，•与晚发性AD发病明显相关的只有载脂蛋白E-ε4(APOE-ε4)等位基因•对与AD关联的4个基因(APOE+ APP+ PSEN1+PSEN2)进行全基因测序，有助于发现更多的AD患者的遗传变异。
•阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)•通过Ion-Torrent-PGM技术，对PSEN1、PSEN2、APP、APOE基因的外显子区（编码区）序列进行直接测序，与参考序列进行比较，从而发现可能存在的基因突变基因定位作用APOE19q13-13.2与老年性痴呆相关APP21q11.2-21q21与老年性痴呆相关PSEN1基因（早老素-1基因）14q24.3其中PSEN1基因可能是EOFAD的主要责任基因，并且也有报道PSEN1基因的某些突变和多态性也与散发性AD有关PSEN2基因（早老素-2基因）1q31-42与老年性痴呆相关 早发性AD的家系 举例:AD相关基因NGS测序•PSEN1基因突变•早发型AD•常显遗传 Illumina Illumina 平台平台 Illumina Miseq的基本原理的基本原理 测序的时候，测序引物匹配于模板，反应体系里加入4种不同荧光基团标记的Fl-NTPs，整合到新合成链的Fl-NTPs会发出相应的荧光，并被相机拍下，终止反应，将荧光基团切除即可进入下一轮合成过程如此往复直到测完设定的循环数 MiSeq Control Software图片处理Base calling质量评分MiSeq Reporter数据格式转化比对序列到参考序列得到变异信息质量>Q30的数据达到95%以上 测序照片 二、数据分析 •NextSeq 500特色——Two Channel SBS GGT, ATT, CAA, GCATCA, ATG, CGT, GGC（A/T;A/C） 帕金森病（Parkinson’s disease，PD）•是一种常见的神经系统变性疾病，•老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。
•最主要的病理改变:中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病•症状体征不对称、静止性震颤、对左旋多巴制剂治疗敏感多提示原发性帕金森病 各测序技术的比较数据来源：Liu JT, et al. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:871272. 第三代测序第三代测序•基于单个分子信号检测的DNA测序被称为单分子测序单分子测序 (single molecule sequencing, SMS)，或第三代测序 (third generation sequencing, TGS) •主要包括Helicos的的tSMS，，PacBio的的SMRT，，Oxford的的Nanopore tSMS（ture single molecule sequencingture single molecule sequencing ）•该技术的关键是采用高分辨率的相机直接读取单分子荧光信号，不需要依赖PCR扩增以放大信号•首先将待测核酸样本随机打断成小片段，在每个小片段的末端加上poly-dA；•再将小片段DNA模板与固定在检测芯片上的poly-dT引物进行杂交并精确定位，并逐一加入经过荧光物质修饰的dNTP。
•tSMS技术使用的dNTP也是仅能掺入新合成链而不能直接作为下一个dNTP分子掺入新链的3ˊ端，必须将其荧光基团切除之后才可允许下一个dNTP分子的掺入•在dNTP掺入新链成像之后，切除荧光基团，加帽，允许下一个核苷酸的掺入 tSMS（ture single molecule sequencingture single molecule sequencing ） SMRTSMRT（（single molecule Real-Timesingle molecule Real-Time））sequencingsequencing •该方法采用四色荧光标记的dNTP和被称为零级波导 (zero-mode waveguides, ZMW) 的纳米结构对单个DNA分子进行测序当DNA合成进行时，连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长 (约200ms)，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度 NanoporeNanopore •当单链DNA或RNA分子通过纳米级的小孔时，由于碱基形状大小不同，引起孔内电阻变化，在小孔两端保持一个恒定的电压，则能够检测到通过小孔的电流变化情况，通过测到这些特征电流，就能够识别出通过小孔的DNA分子上的碱基排列。
•外切酶测序 (Exonuclease sequencing)和链测序 (Strand sequencing) •外切酶测序是将α-溶血素和环化糊精组成的纳米孔固定在脂质双分子膜上，两侧为浓度不同的KCl溶液，并加以160mV的电压DNA单链在E. coli核酸外切酶I的作用下被依次剪切为单核苷酸，通过记录单核苷酸分子通过纳米孔时引起的电流变化进行DNA测序 •链测序则是利用DNA解旋酶将DNA双链解旋为单链，并通过纳米孔，进行连续测序 总结•二代测序几个主要平台：二代测序几个主要平台：•罗氏罗氏454 GS FLX 、 Illumina MiSeq、、ABI Ion torrent•各个平台的测序原理及操作流程：各个平台的测序原理及操作流程：•罗氏罗氏454 GS FLX ：焦磷酸测序；：焦磷酸测序；•DNA提取提取→文库构建文库构建→油包水油包水PCR →PCR富集富集→焦磷酸测序焦磷酸测序•illumina Miseq：边合成边测序；：边合成边测序；•DNA提取提取→文库构建文库构建→桥式桥式PCR →合成测序合成测序•ABI Ion Torrent：半导体芯片测序：半导体芯片测序•DNA提取提取→文库构建文库构建→油包水油包水PCR →PCR富集富集→芯片测序芯片测序•各二代各二代测序原理测序原理的最大区别：的最大区别：•信号收集与检测信号收集与检测•一代测序、二代测序及三代测序的主要区别：一代测序、二代测序及三代测序的主要区别：•一代测序与二代测序之间的主要差别是它们的一代测序与二代测序之间的主要差别是它们的测序通量测序通量：前者每个：前者每个run仅测一个仅测一个DNA片段，后者的通量可达到每个片段，后者的通量可达到每个run测几百万个测几百万个DNA片段；片段；•二代测序与三代测序之间最主要的区别则是二代测序与三代测序之间最主要的区别则是测序模板测序模板：前者使用的模板：前者使用的模板是是PCR产物，后者直接对单个产物，后者直接对单个DNA片段进行测序。
片段进行测序 •谢谢！谢谢！ 。