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1、小麦胚芽中酸性磷酸酶的分离纯化小麦胚芽中酸性磷酸酶的分离纯化小麦胚芽ACP的提取与纯化课件酶分离纯化的过程酶分离纯化的过程o选择原料选择原料o组织及细胞破碎组织及细胞破碎o酶的抽提酶的抽提o酶的纯化酶的纯化小麦胚芽ACP的提取与纯化课件常用的酶分离纯化方法常用的酶分离纯化方法o盐析法盐析法o有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法o离心法离心法o电泳法电泳法o层析法层析法o吸附法吸附法o透析法透析法小麦胚芽ACP的提取与纯化课件一、实验目的一、实验目的o掌握小麦胚芽中分离纯化掌握小麦胚芽中分离纯化ACP的原理的原理o熟悉小麦胚芽中分离纯化熟悉小麦胚芽中分离纯化ACP的操作过程的操作过程o了解常用的酶分离纯
2、化技术了解常用的酶分离纯化技术小麦胚芽ACP的提取与纯化课件二、实验原理二、实验原理o酸性磷酸酶酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP) 广泛分广泛分布于自然界中，存在植物种子、霉菌、以及动物肝布于自然界中，存在植物种子、霉菌、以及动物肝脏和前列腺中。脏和前列腺中。o植物种子中的植物种子中的ACP在发芽时含量会猛增，随芽胚的在发芽时含量会猛增，随芽胚的生长生长ACP含量会下降。选用新鲜小麦胚芽作为原料含量会下降。选用新鲜小麦胚芽作为原料来分离和纯化来分离和纯化ACP，具有来源方便、酶含量高等优，具有来源方便、酶含量高等优点。点。小麦胚芽ACP的提取与纯化课件二、实验原理二、实验原
3、理oACP能溶解于水和稀缓冲液中；能溶解于水和稀缓冲液中；o溶于溶于35%饱和度的硫酸铵溶液中，在饱和度的硫酸铵溶液中，在57%饱和度饱和度的硫酸铵溶液中可沉淀析出；的硫酸铵溶液中可沉淀析出；opH小于小于6.5时稳定性增加，乙酸和枸橼酸可增加时稳定性增加，乙酸和枸橼酸可增加ACP溶液的稳定性；溶液的稳定性；o在在中性及高温中性及高温条件下不稳定，在条件下不稳定，在70时相对稳定；时相对稳定；oMn2+、Mg2+为为ACP激活剂激活剂，而，而Cu2+、Pi、Hg2+、Zn2+、Ag+、Pb2+、NaF、草酸盐、酒石酸盐和、草酸盐、酒石酸盐和甲醛等是甲醛等是ACP的的抑制剂抑制剂。小麦胚芽ACP
4、的提取与纯化课件三、实验试剂三、实验试剂o1mol/L MnCl2溶液溶液o饱和饱和(NH4)2SO4 溶液溶液(pH 5.5，4) 按按76.7g (NH4)2SO4，加蒸馏水溶解至，加蒸馏水溶解至100mlo0.25 mol/L EDTA钠盐溶液钠盐溶液(pH 5.7)o甲醇甲醇-30预冷预冷o新鲜麦芽新鲜麦芽50 g小麦胚芽ACP的提取与纯化课件四、操作步骤四、操作步骤1.小麦胚芽的准备小麦胚芽的准备 选取饱满、新鲜的小麦粒，冷水洗涤，除去干选取饱满、新鲜的小麦粒，冷水洗涤，除去干瘪的麦粒及泥沙，再用冷水浸泡瘪的麦粒及泥沙，再用冷水浸泡24d (天热时天热时4h左右左右)使使麦粒发胀麦粒
5、发胀。将发胀的麦粒。将发胀的麦粒平摊平摊于沥水的于沥水的覆盖有覆盖有2层纱布的塑料筐中，上面层纱布的塑料筐中，上面覆盖双层湿的纱覆盖双层湿的纱布布，置于，置于通风通风处，每天浇水处，每天浇水23次，保持麦粒的次，保持麦粒的湿度。一般情况下，发胀的麦粒在室温湿度。一般情况下，发胀的麦粒在室温20情况情况下，经下，经34d就可以发出胚芽。在此过程中应注意就可以发出胚芽。在此过程中应注意通风透气，否则麦粒会发霉。通风透气，否则麦粒会发霉。 小麦胚芽ACP的提取与纯化课件四、操作步骤四、操作步骤2.小麦胚芽中小麦胚芽中ACP的初步提取的初步提取 称取新鲜小麦胚芽称取新鲜小麦胚芽50g，加冷蒸馏水，加冷
6、蒸馏水100ml，用捣碎器在，用捣碎器在高速高速、间断间断条件下条件下冰浴冰浴捣碎捣碎35min，得到麦芽匀浆，将麦芽匀浆，得到麦芽匀浆，将麦芽匀浆用用24层纱布过滤，尽量将液体挤出，弃去层纱布过滤，尽量将液体挤出，弃去纱布上固体物。纱布上固体物。 小麦胚芽ACP的提取与纯化课件四、操作步骤四、操作步骤3.ACP的纯化的纯化 本实验采用分级离心本实验采用分级离心+分段盐析法分段盐析法+热变性热变性+有机溶剂有机溶剂沉淀法：沉淀法：oACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度密度不同，以此不同，以此逐步离心分离；逐步离心分离；oACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在能
7、溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在70C仍仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性沉淀和分段盐析。保持稳定，以此进行杂蛋白的变性沉淀和分段盐析。小麦胚芽ACP的提取与纯化课件ACP分离纯化的步骤流程分离纯化的步骤流程 小麦胚芽小麦胚芽50g+100ml冷蒸馏水冷蒸馏水 滤滤 液液（固体物弃去）（固体物弃去）研碎，研碎，4层纱布过滤层纱布过滤7000 rpm，离心，离心5min 记录体积记录体积上清液上清液 I 留留3ml置于冰箱置于冰箱9000 rpm，离心，离心5min1mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液上清液 I记录体积记录体积上清液上清液 II 留留3ml置于冰箱置于冰箱（激活并稳
8、定（激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白）沉淀杂蛋白）缓慢搅拌缓慢搅拌弃去沉淀弃去沉淀弃去沉淀弃去沉淀小麦胚芽ACP的提取与纯化课件7000rpm，离心，离心5min 上清液上清液7000rpm，离心，离心5min饱和硫酸铵饱和硫酸铵 54ml/100ml上清液上清液 II，达达35%饱和度饱和度 上清液上清液 II（溶解（溶解ACP， 沉淀杂蛋白）沉淀杂蛋白）7000rpm，离心，离心5min记录体积记录体积上清液上清液 III 留留3ml置于冰箱置于冰箱62C水浴水浴2min，迅速冷却至迅速冷却至68冷水浴冷水浴3min饱和硫酸铵饱和硫酸铵 51ml/100ml上清液，上清液，达达57%饱和度饱
9、和度 沉淀沉淀（酶粗提物）（酶粗提物）（ 沉淀沉淀ACP）缓慢搅拌缓慢搅拌缓慢搅拌缓慢搅拌ACP分离纯化的步骤流程分离纯化的步骤流程弃去沉淀弃去沉淀弃去上清液弃去上清液弃去沉淀弃去沉淀小麦胚芽ACP的提取与纯化课件9000rpm，离心，离心5min约约1/3上清液上清液 III蒸馏水蒸馏水溶解、洗涤溶解、洗涤（溶解（溶解ACP， 沉淀杂蛋白）沉淀杂蛋白）7000rpm，离心，离心5min记录体积记录体积上清液上清液 IV 留留3ml置于冰箱置于冰箱 沉淀沉淀（酶粗提物）（酶粗提物）（ 沉淀沉淀ACP）EDTA0.09ml/1ml、饱和硫、饱和硫酸铵酸铵0.1ml /1ml、-30预冷预冷甲醇甲
10、醇2ml/1ml上清液上清液 IV 沉沉 淀淀（酶纯化物）（酶纯化物）7000rpm，离心，离心5min10ml蒸馏水蒸馏水溶解洗涤溶解洗涤 （酶液）（酶液）记录体积记录体积上清液上清液 V 全部保留置于冰箱全部保留置于冰箱ACP分离纯化的步骤流程分离纯化的步骤流程弃去上清液弃去上清液弃去沉淀弃去沉淀弃去沉淀弃去沉淀（ 溶解溶解ACP）小麦胚芽ACP的提取与纯化课件五、注意事项五、注意事项o制备小麦胚芽时不宜让麦苗长出，尽量取小麦胚芽制备小麦胚芽时不宜让麦苗长出，尽量取小麦胚芽部分，因麦粒和麦苗部分部分，因麦粒和麦苗部分ACP活性较低。同时要弃活性较低。同时要弃去发霉变质的麦胚。去发霉变质的麦
11、胚。o1 mol/L MnCl2起稳定酶蛋白和除去杂蛋白的作起稳定酶蛋白和除去杂蛋白的作用。用。o(NH4)2SO4的最终饱和度要严格控制，的最终饱和度要严格控制，ACP溶于溶于35%饱和度的饱和度的(NH4)2SO4溶液中，一些杂蛋白沉溶液中，一些杂蛋白沉淀析出。当淀析出。当(NH4)2SO4饱和度增加至饱和度增加至57%时，时，ACP则不溶解，从溶液中析出，某些杂蛋白仍溶于则不溶解，从溶液中析出，某些杂蛋白仍溶于上清液中。上清液中。小麦胚芽ACP的提取与纯化课件o操作中要控制好要求的温度，操作中要控制好要求的温度，ACP在在70时稳时稳定，加热至定，加热至62为了除去一些不耐热的杂蛋白。为了除去一些不耐热的杂蛋白。o甲醇的作用是降低溶液的介电常数，使酶蛋白脱甲醇的作用是降低溶液的介电常数，使酶蛋白脱水而从溶液中析出，从而除去杂蛋白。由于有机水而从溶液中析出，从而除去杂蛋白。由于有机溶剂沉淀蛋白质常引起蛋白质的变性，因此，低溶剂沉淀蛋白质常引起蛋白质的变性，因此，低温条件非常重要，甲醇要保持低温。温条件非常重要，甲醇要保持低温。五、注意事项五、注意事项小麦胚芽ACP的提取与纯化课件
