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1、第十三章 核酸的酶促降解和核苷酸代谢 本本本本章章章章讨讨讨讨论论论论核核核核酸酸酸酸酶酶酶酶的的的的类类类类别别别别和和和和特特特特点点点点，对对对对核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸的生物合成和分解代谢作一般介绍。的生物合成和分解代谢作一般介绍。的生物合成和分解代谢作一般介绍。的生物合成和分解代谢作一般介绍。第一节第一节第一节第一节 核酸的酶促降解核酸的酶促降解核酸的酶促降解核酸的酶促降解第三节第三节第三节第三节 核苷酸的合成代谢核苷酸的合成代谢核苷酸的合成代谢核苷酸的合成代谢第二节第二节第二节第二节 核苷酸的分解代谢核苷酸的分解代谢核苷酸的分解代谢核苷酸的分解代谢第一节 核酸的酶促降解 核苷酸酶核
2、苷酸酶 核苷磷酸解酶核苷磷酸解酶 核核酸酸 核核苷苷酸酸 核核苷苷 碱碱基基+核核糖糖-1-P磷酸磷酸核酸酶核苷水解酶核苷水解酶碱基碱基+核糖核糖脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶( (DNaseDNase) )核糖核酸酶核糖核酸酶( (RNaseRNase) )非特异性核酸酶非特异性核酸酶核核 酸酸 酶酶1、核酸酶的分类（1 1）根据对底物的根据对底物的 专一性分为专一性分为（2 2）根据）根据切割位点切割位点分为分为核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶2、核酸酶的特异性3、限制性内切酶外切核酸酶对核酸的水解位点外切核酸酶对核酸的水解位点5 p p p pOHB p p p p3BBBBBBB
3、牛脾牛脾磷酸二酯酶磷酸二酯酶（ 55端外切端外切5 5得得3 3）蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶（ 33端外切端外切3 3得得5 5）内切核酸酶对内切核酸酶对RNARNA的水解位点示意图的水解位点示意图5 p p p pOHPyPuPyPy1 p p pGACU p p pGA3RNAase IRNAase IRNAase T1RNAase T1Pu ：嘌呤嘌呤 Py：嘧啶嘧啶 限制性内切酶限制性内切酶 类型类型 命名和意义命名和意义限制片段的长度限制片段的长度限制图限制图 原核生物中存在着一类能识别外源原核生物中存在着一类能识别外源原核生物中存在着一类能识别外源原核生物中存在着一类能识别外源D
4、NADNADNADNA双螺旋中双螺旋中双螺旋中双螺旋中4-84-84-84-8个碱基个碱基个碱基个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的对所组成的特异的具有二重旋转对称性的对所组成的特异的具有二重旋转对称性的对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列回文序列回文序列回文序列，并在此序，并在此序，并在此序，并在此序列的某位点水解列的某位点水解列的某位点水解列的某位点水解DNADNADNADNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类酶称为限制性内切酶（酶称为限制性内切酶（酶称为限制性内切酶
5、（酶称为限制性内切酶（ristrictionristriction endonucleaseendonuclease）。常用的常用的DNADNA限制性内切酶的专一性限制性内切酶的专一性酶酶辨认的序列和切口辨认的序列和切口说明说明 A G C T T C G A G G A T C C C C T A G G A G A T C T T C T A G A G A A T T C C T T A A G A A G C T T T T C G A A G T C G A C C A G C T G C C C G G G G G G C C C Bam H IAlu IBgl IEco R IH
6、ind Sal ISma I四四核苷酸，平端切口核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口限制性内切酶类型限制性内切酶类型 I I型：分子量大于型：分子量大于型：分子量大于型：分子量大于10105 5，多亚基，需，多亚基，需，多亚基，需，多亚基，需S-S-线苷蛋氨酸、线苷蛋氨酸、线苷蛋氨酸、线苷蛋氨酸、ATPATP和和和和MgMg2+ 2+ ，识别位点与切割位点相差甚远，产物为异质，是限识别位点与切割位点相
7、差甚远，产物为异质，是限识别位点与切割位点相差甚远，产物为异质，是限识别位点与切割位点相差甚远，产物为异质，是限制与修饰相排斥的多功能酶制与修饰相排斥的多功能酶制与修饰相排斥的多功能酶制与修饰相排斥的多功能酶. . 型：分子量小于型：分子量小于型：分子量小于型：分子量小于10105 5，需，需，需，需MgMg2+ 2+ ，切割位点位于识别切割位点位于识别切割位点位于识别切割位点位于识别 位位位位点上，产物为专一性片段，不具修饰酶功能。现在分子生物点上，产物为专一性片段，不具修饰酶功能。现在分子生物点上，产物为专一性片段，不具修饰酶功能。现在分子生物点上，产物为专一性片段，不具修饰酶功能。现在分
8、子生物学研究所用的限制性内切酶均为此类。学研究所用的限制性内切酶均为此类。学研究所用的限制性内切酶均为此类。学研究所用的限制性内切酶均为此类。 IIII型：识别位点为型：识别位点为型：识别位点为型：识别位点为5-7bp5-7bp的非对称序列的非对称序列的非对称序列的非对称序列 ，切割位点在切割位点在切割位点在切割位点在顺序之外离识别顺序之外离识别顺序之外离识别顺序之外离识别 序列序列序列序列5-10bp5-10bp，切割双链，个别也切割单链。切割双链，个别也切割单链。切割双链，个别也切割单链。切割双链，个别也切割单链。是限制与修饰相多功能酶是限制与修饰相多功能酶是限制与修饰相多功能酶是限制与修
9、饰相多功能酶. .限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名Eco R I序号序号序号序号属名属名属名属名种名种名种名种名株名株名株名株名例：例：例：例：Eco R IEco R I，这是从大肠杆菌（这是从大肠杆菌（这是从大肠杆菌（这是从大肠杆菌（EcoliEcoli）R R菌珠中分离出的一种限制性内切酶菌珠中分离出的一种限制性内切酶菌珠中分离出的一种限制性内切酶菌珠中分离出的一种限制性内切酶Hind例：流感例：流感Haemophilus influengae d（属名）属名）（种名）种名）（株系）株系）I 特异性甲基化酶特异性甲基化酶IIGTPyPuACIII AAGCTT限制性内切酶的意义限制性
10、内切酶的意义 限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNA分子。限制片段的长度限制片段的长度 根据估算，识别六核苷酸顺序的的限制酶大约在4096（46）个硷基对长的DNA分子中有一个切点，而通常大多数肽链的不超过1000氨基酸残基。因此，由识别六核苷酸顺序的的限制酶产生的DNA片段接近一个原核生物基因的大小，这个性质使得这些限制酶可以用于建造和克隆有用的重组DNA分子。 为了获取更大的DNA片段，可以采用限制酶部分降解的方法，也可以选用识别810个核苷酸顺序的限制酶。限制图的定义和构建
11、限制图的定义和构建 限制图限制图（亦称（亦称物理图谱物理图谱）是）是DNADNA的限制性内切酶酶解的限制性内切酶酶解片断沿片断沿DNADNA分子的物理位置的排列顺序以及各片断的相对长分子的物理位置的排列顺序以及各片断的相对长度和绝对长度。度和绝对长度。 由于限制性内切酶能在独特顺序切割双链由于限制性内切酶能在独特顺序切割双链DNADNA产生大的产生大的DNADNA片段，它们提供了一种以碱基对为单位距离给片段，它们提供了一种以碱基对为单位距离给DNADNA分子分子作图的方法，在确定作图的方法，在确定DNADNA分子一级结构的过程中，限制图的分子一级结构的过程中，限制图的构建是一项必不可少的工作构
12、建是一项必不可少的工作。 限制图制作方法示例：限制图制作方法示例：末端标记单酶切法末端标记单酶切法SV-40基因组限制性酶谱SV-40SV-40病毒基因组限制性物理图谱病毒基因组限制性物理图谱末端标记法绘制物理图谱末端标记法绘制物理图谱 将待测将待测DNADNA分子的一端用放射性同位素标记，部分酶解；分子的一端用放射性同位素标记，部分酶解； 电泳分离，只有带同位素的片段出现在放射自显影图上；电泳分离，只有带同位素的片段出现在放射自显影图上；. . 分析：放射自显影图上谱线的数目相当于完全酶解片段的数目；分析：放射自显影图上谱线的数目相当于完全酶解片段的数目；相邻谱线碱基对数目之差就是两个相邻点
13、之间这段相邻谱线碱基对数目之差就是两个相邻点之间这段DNADNA片段的大小。片段的大小。 例：某组蛋白基因片段共例：某组蛋白基因片段共5900bp5900bp，末端标记后用末端标记后用HpaII部部分酶解得到五个片段，分子量分别为：分酶解得到五个片段，分子量分别为：5900bp5900bp；4210bp4210bp；3260bp3260bp；2950bp2950bp；1020bp1020bp。画出该画出该DNADNA分子的物理图谱。分子的物理图谱。193010201020bp2950bp3260bp5900bp4210bp3101690950 +- Mark限制性内切酶限制性内切酶解法解法部分
14、酶解法部分酶解法 将待测将待测DNADNA用限制性内切酶完全水解，电泳后得完全酶解图谱用限制性内切酶完全水解，电泳后得完全酶解图谱. . 再将待测再将待测DNADNA进行部分酶解进行部分酶解( (限制酶量、降低温度、缩短反应时限制酶量、降低温度、缩短反应时间间),),电泳后获得部分酶解图谱电泳后获得部分酶解图谱. . 对完全酶解和部分酶解片段长度进行比较分析，根据片段重叠原对完全酶解和部分酶解片段长度进行比较分析，根据片段重叠原理组建物理图谱理组建物理图谱. . 例：有一例：有一 174174经经Hind II酶解所得片段，分子大小酶解所得片段，分子大小为为1030bp1030bp，其用其用A
15、lu I完全水解得四个片段：完全水解得四个片段：A 750bpA 750bp，B B 150bp150bp，C 80bpC 80bp，D 50bpD 50bp；用；用Alu I部分水解得三个片段：部分水解得三个片段：800bp800bp，230bp230bp，130bp130bp。请推断请推断A A、B B、C C、D D的排列顺序。的排列顺序。CABD1501508050750230130800+Alu I 酶解图谱酶解图谱BACDMarkMark-完全完全部分部分第二节第二节 核苷酸的降解核苷酸的降解二、二、嘧啶的降解嘧啶的降解一、一、嘌呤的降解嘌呤的降解 核苷酸酶核苷酸酶 核苷磷酸化酶核
16、苷磷酸化酶核苷酸核苷酸 核苷核苷 碱基碱基+（脱氧）戊糖（脱氧）戊糖-1-P磷酸磷酸嘌呤的分解嘌呤的分解及及“痛风症痛风症”产生和治产生和治疗疗尿囊酸尿囊酸尿素尿素CO2+NH3腺嘌呤脱氨酶腺嘌呤脱氨酶黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶尿酸氧化酶尿酸氧化酶黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶鸟嘌呤脱氨酶鸟嘌呤脱氨酶腺嘌呤腺嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤黄嘌呤黄嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤尿囊素尿囊素尿酸尿酸NCHHHONCH次黄嘌呤类似物次黄嘌呤类似物别嘌呤醇别嘌呤醇黄嘌呤类似物黄嘌呤类似物别黄嘌呤别黄嘌呤嘧嘧啶啶的的分分解解胞嘧啶胞嘧啶尿嘧尿嘧啶啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶二氢尿嘧啶二氢尿嘧啶二氢胸腺嘧啶二氢胸腺嘧啶 -脲基丙酸脲基丙酸 -脲基
17、异丁酸脲基异丁酸 - -氨基异丁酸氨基异丁酸 -丙氨酸丙氨酸第三节 核苷酸的合成代谢一、核糖核苷酸的生物合成二、脱氧核糖核苷酸的生物合成三、各种核苷酸的相互转变核糖核苷酸的生物合成核糖核苷酸的生物合成1 1、嘌呤核苷酸的生物合成、嘌呤核苷酸的生物合成(1) 从头合成途径(2) 补救合成途径(自学)2 2、嘧啶核苷酸的生物合成、嘧啶核苷酸的生物合成(1) 从头合成途径(2) 补救合成途径补救合成途径(自学自学)嘌呤环上各原子的来源嘌呤环上各原子的来源来自谷氨酰胺的酰胺氮来自谷氨酰胺的酰胺氮来自来自“甲酸盐甲酸盐”来自天冬氨酸来自天冬氨酸来自甘氨酸来自甘氨酸来自来自CO2来自来自“甲酸盐甲酸盐”I
18、MP的的 生物合成生物合成5-5-磷酸核糖焦磷酸磷酸核糖焦磷酸5-5-磷酸磷酸核糖胺核糖胺甘氨酸甘氨酸甘氨酰胺核苷酸甘氨酰胺核苷酸甲酰甘氨酰胺核苷酸甲酰甘氨酰胺核苷酸甲酰甘氨咪核苷酸甲酰甘氨咪核苷酸5-5-氨基咪唑核苷酸氨基咪唑核苷酸5-5-氨基咪唑氨基咪唑-4-4-羧核苷酸羧核苷酸5-5-氨基咪唑氨基咪唑-4-4-琥珀基琥珀基- -甲酰胺核苷酸甲酰胺核苷酸5-5-氨基咪唑氨基咪唑-4-4-氨甲酰核苷酸氨甲酰核苷酸5-5-甲酰氨基咪唑甲酰氨基咪唑- -4-4-氨甲酰核苷酸氨甲酰核苷酸次黄嘌呤核苷酸次黄嘌呤核苷酸（IMPIMP）甲酰甲酰THFATHFAIMP转变为转变为GMP和和AMP嘌呤核苷酸
19、合成补救途径（自学）嘌呤核苷酸合成补救途径（自学） 磷酸核糖转移酶磷酸核糖转移酶嘌呤嘌呤+PRPPA(G)MP+PPi嘌呤嘌呤+1-P-核糖核糖嘌呤核苷嘌呤核苷 A(G)MPATP ADP嘧啶核苷酸从头合成途径c、UMP转变为CTPCTPCTP合成酶合成酶 ATP GlnH2OUMPUDPUTP a、嘧啶环上原子的来源嘧啶环上原子的来源b、UMP的从头合成的从头合成嘧啶环上各原子的来源嘧啶环上各原子的来源 天冬氨酸天冬氨酸CO2NH3NNCCCC654321H2N-CO-P氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸尿嘧啶核苷酸合成途径尿嘧啶核苷酸合成途径天冬氨酸天冬氨酸氨甲酰氨甲酰天冬氨酸天冬氨酸二氢乳清酸二氢乳清
20、酸乳清酸乳清酸乳清苷酸乳清苷酸尿嘧啶核苷酸尿嘧啶核苷酸氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸嘧啶核苷酸补救合成途径（自学）嘧啶核苷酸补救合成途径（自学）尿嘧啶尿嘧啶+PRPP尿嘧啶尿嘧啶+1-P-核糖核糖尿嘧啶核苷尿嘧啶核苷+ATPUMP+PPi尿嘧啶核苷尿嘧啶核苷+PiUMP+ADP脱氧核苷酸的合成脱氧核苷酸的合成2、脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成1、脱氧核苷酸的合成脱氧核苷酸的合成硫氧还蛋白参与的核糖核苷酸的还原反应硫氧还蛋白参与的核糖核苷酸的还原反应核糖核苷酸还原酶核糖核苷酸还原酶NADP+NADPH+H+硫氧还蛋白硫氧还蛋白还原酶还原酶FADATP 、Mg2+硫氧还蛋白硫氧还蛋白（还原
21、型）（还原型）SHSH硫氧还蛋白硫氧还蛋白（氧化型（氧化型）SSOP-P-CH2NOHOH核糖核苷二磷酸核糖核苷二磷酸OP-P-CH2NOHH+ H2O脱氧核糖核苷二磷酸脱氧核糖核苷二磷酸核糖核苷酸的还原反应核糖核苷酸的还原反应FAD核糖核苷酸还原酶核糖核苷酸还原酶ATP 、Mg2+硫氧还蛋白硫氧还蛋白SHSH硫氧还蛋白硫氧还蛋白SS硫氧还蛋硫氧还蛋白还原酶白还原酶核糖核苷二磷酸核糖核苷二磷酸+ H2O脱氧核糖核苷二磷酸脱氧核糖核苷二磷酸FADH2谷氧还蛋白谷氧还蛋白SS谷氧还蛋白谷氧还蛋白SHSHNADP+NADPH+H+谷氧还蛋谷氧还蛋白还原酶白还原酶OP-P-CH2NOH OHOP-P-
22、CH2NOH HGSSG2GSH谷胱甘肽谷胱甘肽还原酶还原酶硫氧还蛋白参与的核硫氧还蛋白参与的核糖核苷酸的还原反应糖核苷酸的还原反应核糖核苷酸还原酶示意图核糖核苷酸还原酶示意图底物特异性底物特异性调节位点调节位点酶活性酶活性调节位点调节位点催化部位催化部位B1亚基亚基B2亚基亚基脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成 胸腺嘧啶核苷酸合成酶胸腺嘧啶核苷酸合成酶NADPH+H+SerNADP+Gly N5、N10CH2 FH4 FH2二氢二氢叶酸叶酸还原酶还原酶Ser羟甲基羟甲基转移酶转移酶ONHNOdR-PCH3ONHNOdR-P核苷酸合成前体类似物与抗癌、抗菌药物核苷酸合成前体类似物
23、与抗癌、抗菌药物 根根据据酶酶的的抑抑制制原原理理，在在癌癌症症的的化化学学治治疗疗或或抗抗菌菌治治疗疗中中，往往往往选选用用一一些些底底物物类类似似物物（抗抗代代谢谢物物）抑抑制制胸胸苷苷酸酸合合成成酶酶或或二二氢氢叶酸合成酶的合成，使胸苷酸不能合成，例如：叶酸合成酶的合成，使胸苷酸不能合成，例如： 1、氨氨基基蝶蝶呤呤、氨氨甲甲蝶蝶呤呤、三三甲甲氧氧苄苄氨氨嘧嘧啶啶为为叶叶酸酸类类似似物物，是二氢叶酸还原酶抑制剂，可抑制癌细胞和细菌生长；是二氢叶酸还原酶抑制剂，可抑制癌细胞和细菌生长； 2、5-氟氟脲脲嘧嘧啶啶、 5 -氟氟脱脱氧氧脲脲嘧嘧啶啶在在体体内内可可转转化化为为5-氟氟脱脱氧氧脲
24、脲嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸为为脱脱氧氧胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸类类似似物物，是是脱脱氧氧胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸合合成成酶酶的的自自杀杀性性抑抑制制剂剂（suicide inhibitor） ，可可作作为为抗癌药物。抗癌药物。 5-氟脱氧脲嘧啶核苷酸作为胸苷酸合成酶氟脱氧脲嘧啶核苷酸作为胸苷酸合成酶自杀性底物的机理自杀性底物的机理F ONHNOdR-PS-酶酶F ONHNOdR-PHS-酶酶F ONHNOdR-PHCH2-FH4胸苷酸合成酶、胸苷酸合成酶、5-5-氟脱氧脲嘧啶核苷酸和亚甲基氟脱氧脲嘧啶核苷酸和亚甲基四氢叶酸三元复合物的形成四氢叶酸三元复合物的形成叶酸叶酸和和 四氢叶酸（四氢
25、叶酸（FH4）叶叶酸酸四四氢氢叶叶酸酸HH105N N5 5，N N1010-CH-CH2 2-FH-FH4 4N N5 5-CHO-FH-CHO-FH4 4CHCH2 2CHOCHO一碳基团的一碳基团的来源与转变来源与转变S-S-腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸N N5 5-CH-CH2 2- -FHFH4 4N N5 5 N N10 10 - - CHCH2 2-FH-FH4 4N N5 5， N N10 10 = CH-FH= CH-FH4 4 N N10 10 -CHO-FH-CHO-FH4 4N N5 5 ， N N10 10 -CH-CH2 2-FH-FH4 4还原酶还原酶
26、还原酶还原酶N N5 5 ， N N10 10 -CH-CH2 2-FH-FH4 4脱氢酶脱氢酶脱氢酶脱氢酶环水化酶环水化酶环水化酶环水化酶 丝丝丝丝氨酸氨酸氨酸氨酸 组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸苷氨酸苷氨酸苷氨酸苷氨酸参与参与参与参与 甲基化甲基化甲基化甲基化反应反应反应反应为为为为胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶合合合合成提供成提供成提供成提供甲基甲基甲基甲基参与参与参与参与嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤合成合成合成合成FHFH4 4FHFH4 4FHFH4 4 HCOOHHCOOHHH2 2OONADNAD+ +NDAH+HNDAH+H+ +NADNAD+ +NDAH+HNDAH+H+ +HH+ +参与参与参与参与嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤合成合成合成合成核核苷苷酸酸的的合合成成及及相相互互关关系系
