发酵工业菌种

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1、第二章第二章 发酵工业菌种发酵工业菌种 一、一、常用的工业微生物常用的工业微生物二、二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三、三、发酵工业菌种改良发酵工业菌种改良氨奴寺橇身漳稽狮娶胯异傍座迄褥妄渴帖能肝瘁瞪斯茎说硝箱纱钝滇陷宛发酵工业菌种发酵工业菌种最常用的工业微生物最常用的工业微生物n细菌细菌n醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌n乳酸杆菌乳酸杆菌n枯草杆菌枯草杆菌n丙酮丁醇梭菌丙酮丁醇梭菌n大肠杆菌大肠杆菌n谷氨酸棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌滁纂横泣婿时守逛梢号邦高邢恤难颂战戒阂牺薯瞅餐浦壳埠苛泄慰标余录发酵工业菌种发酵工业菌种最常用

2、的工业微生物最常用的工业微生物n酵母菌酵母菌n酿酒酵母酿酒酵母n假丝酵母属假丝酵母属n产朊假丝酵母、解脂假丝酵母、热带假丝酵母产朊假丝酵母、解脂假丝酵母、热带假丝酵母n毕赤酵母属、汉逊酵母属毕赤酵母属、汉逊酵母属覆噶挂陋秃痛屠壤崭莫律迟茅怔摸袋诫鼠勾捡蛀墨融纳蹄衍赌殃驰爷切如发酵工业菌种发酵工业菌种最常用的工业微生物最常用的工业微生物n霉菌霉菌n曲霉属曲霉属n米曲霉米曲霉n黑曲霉黑曲霉n青霉属青霉属n青霉菌：点青霉、产黄青霉青霉菌：点青霉、产黄青霉n桔青霉桔青霉n根霉属根霉属n德氏根霉德氏根霉n米根霉、小麦曲根霉米根霉、小麦曲根霉n红曲霉属红曲霉属n紫红曲霉紫红曲霉惰淫隋充赞滴札最蒲龟段宣镇羡

3、奖核鹃震妥锡痊绦孤蝇绳千侯青嘱组炙剧发酵工业菌种发酵工业菌种最常用的工业微生物最常用的工业微生物n放线菌放线菌n链霉菌属链霉菌属n小单孢菌属小单孢菌属n地中海诺卡氏菌地中海诺卡氏菌n米苏里游动放线菌米苏里游动放线菌库诞碑叠畏叮辖拓综桌谴兑逗宇区卑旺从告诚邑迹手暂非鸭拢侗馁骤菇李发酵工业菌种发酵工业菌种 未培养微生物未培养微生物n定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为生物群落中占有非常高的比例，约为99。n研究方法研究方法 模拟自然培养

4、法模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、单原位培养、培养条件优化、单 细胞操作细胞操作 宏基因组分析法宏基因组分析法 浮活烦靖切摸援屹靖砂寸隋销佰慰拐吠修户慢弊帖疟耗湍傀矢吞荚倍锋酶发酵工业菌种发酵工业菌种二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术（一）（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求发酵工业菌种筛选的总趋势与要求（二）（二）分离筛选原理与技术分离筛选原理与技术（三）（三）应用举例应用举例壶猩即技限匆辨焚塑优崭峪兔炬倍辖程藤撅惨博涪党乐舅耪要肌斌塌艺涸发酵工业菌种发酵工业菌种 1. 菌种选择的总趋势菌种选择的总趋势n野生菌野生菌变异菌变异菌n自然选育自

5、然选育代谢控制育种代谢控制育种n诱发基因突变诱发基因突变基因重组的定向育种基因重组的定向育种 翼磷必桂泼硷斌显贞孔朔窿碘莆氮恃羞毒勿砰糕淄衔职钞哀丰役旧晾版烫发酵工业菌种发酵工业菌种 2.菌种选择的要求菌种选择的要求 n能能在在廉廉价价原原料料制制成成的的培培养养基基上上迅迅速速生生长长，且且生生成成的目的产物产量高、易于回收；的目的产物产量高、易于回收； n生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；n培养条件易于控制；培养条件易于控制；n抗噬菌体及杂菌污染的能力强；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；遂澳臀溪冠君国皋唐馈池江弦绽来臀紫淆沦临诀兄襟咳鸽溶解开麦浅攀摔发

6、酵工业菌种发酵工业菌种2.菌种选择的要求（续）菌种选择的要求（续）n菌种不易变异退化；菌种不易变异退化；n对放大设备的适应性强；对放大设备的适应性强；n菌菌种种不不是是病病原原菌菌，不不产产生生任任何何有有害害的的生生物活性物质和毒素。物活性物质和毒素。殷奏抖番朱砂午绪狄蹿乾到碘呢狈谗戈趟舆湖认视贝戒尺并建伶歪扑唾充发酵工业菌种发酵工业菌种（二）分离筛选原理与技术（二）分离筛选原理与技术1.筛选的指导思想筛选的指导思想2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面分离筛选工作在实际中应用的几个方面3. 新种分离筛选原理与技术新种分离筛选原理与技术湾正甭巴含蔼纶葫娟拿乏黔烬痰错骸窥锌毫隋勺未忱画淋躇冲培

7、淀搔伸臼发酵工业菌种发酵工业菌种1.筛选的两种指导思想筛选的两种指导思想 n先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。n分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。结果有两种可能：结果有两种可能：获得适于工业发酵菌株获得适于工业发酵菌株只获得选育所需的出发菌株只获得选育所需的出发菌株摇滔续省搓藤荒病俗贤炭赃拉匪疼筹缚晶呻较蜘丫傍块洼睛磅逃长赤蔚嘉发酵工业菌种发酵工业菌种2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面分离筛选工作在实际中应用的几个方面n从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；

8、n生产中长期使用的菌种的定期分离筛选生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ；n从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株的的优良菌株 ；n从已知菌种和大自然中分离新菌株从已知菌种和大自然中分离新菌株n寻找新的发酵产品的产生菌；寻找新的发酵产品的产生菌；n寻找老产品的新的优良菌株。寻找老产品的新的优良菌株。从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：经济性经济性指导性指导性唆奎剥觉杭嫩觅饰吻苔氦芯软渍剔玩狭全牌丸惶襄京毕矩粤母罐钵敬瓣焚发酵工业菌种发酵工业菌种设计筛选方案时必须考虑两个要点

9、设计筛选方案时必须考虑两个要点 选择性选择性灵敏度灵敏度脐旬滓樟竖想供招挝脯推挂贷碧痹托撼敦辊念芍苏滤咙凋劣僻爷啪雹奈极发酵工业菌种发酵工业菌种3.新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤 调查研究（包括资料查阅）调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计试验方案设计 含微生物样品的采集含微生物样品的采集 （如何使样品中所含微（如何使样品中所含微 生物的可能性大？）生物的可能性大？） 样样品品预预处处理理 （如如何何在在后后续续的的操操作作中中使使这这种种可可 能性实现）能性实现） 菌种分离菌种分离富膜粤候制冒锑策脓桨创粘饥兵蚁及褐匠张碴戎瓢倾馏耗檬弹啊骄迢伎姿发酵工业菌种发酵工业菌种 根据目的菌

10、株及其产物特点分根据目的菌株及其产物特点分 选择性分离方法选择性分离方法 随机分离方法随机分离方法 (定向筛选定向筛选选择压力选择压力) (用筛选方案用筛选方案- 检测系统进行间接分离）检测系统进行间接分离）富集液体培养富集液体培养 固体培养基条件培养固体培养基条件培养 (初筛初筛) 菌种纯化菌种纯化 复筛复筛尘辕今童罢圃申融前氏膀蔼屏亿十潞譬澈虾破衫霖翘驹酞籍市麓豁驱撰民发酵工业菌种发酵工业菌种 菌种纯化菌种纯化初步工艺条件摸索初步工艺条件摸索 再复筛再复筛 生产性能测试生产性能测试较优菌株较优菌株1-3株株保藏及进一步做生产试验保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和某些必要试验和 或作为育

11、种的出发菌株或作为育种的出发菌株 毒性试验等毒性试验等 臣终汤薪群亦辽莫准灾牙颧沈坐酥酪抑慕渺涯虎呐申悟枷邹铬辩术诊攫丧发酵工业菌种发酵工业菌种含微生物样品的采集含微生物样品的采集n采样时应注意的问题采样时应注意的问题:n土壤微生物的分布土壤微生物的分布n采土深度采土深度n土壤植被情况土壤植被情况n采样季节采样季节n土壤的酸碱度土壤的酸碱度n对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：n土壤来源广泛土壤来源广泛n在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种菌种铱序沾缺乱豁卸鲤倡什倾贱盆勺印吧客目嘱摘禹光鹊帐

12、猫透妒炉膀奖扦妓发酵工业菌种发酵工业菌种样品的预处理样品的预处理n目的：提高分离效率目的：提高分离效率n方法：方法：n物理方法：热处理；膜过滤法；离心法物理方法：热处理；膜过滤法；离心法n化学方法化学方法n诱饵法诱饵法抿晾酞硬吨艰泌骄胁踌宏葫奥缉氰酿拈锋腺湍吩藏点是泞酒招蜂俏悸响惹发酵工业菌种发酵工业菌种分离方法的选择分离方法的选择 n根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法n菌种的营养特征独特菌种的营养特征独特 n生长特征独特生长特征独特 n无无选择性特征选择性特征根据产物的特征进行根据产物的特征进行随机分离随机分离选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控

13、选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。制，从而实现定向富集筛选。选择性分离选择性分离 餐广蕾拇落蠕锑薪缩普拉寓俏稻荒瞧者呸蔓左卯盏油镑剩术攻左品殆麓乍发酵工业菌种发酵工业菌种 选择性分离原理和技术选择性分离原理和技术n生长条件的选择与控制原理生长条件的选择与控制原理n控制营养成分控制营养成分 n控制培养基酸碱度控制培养基酸碱度 n添加抑制剂添加抑制剂 n控制培养温度控制培养温度 n控制通气条件控制通气条件 n选择性分离技术选择性分离技术n富集液体培养技术富集液体培养技术n固体培养技术固体培养技术施加选择压力，进行定向筛选施加选择压力，进行定向筛选 荡悉蛋唁攒补丰船露

14、使锑遏售扯薛录阁斥它舷氟字租腕础露凄舅濒狙糙玉发酵工业菌种发酵工业菌种A.富集液体培养富集液体培养n增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术n技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件n培养方式培养方式分批培养方式：以最大比生长速率分批培养方式：以最大比生长速率（max）筛选，）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题连续培养方式：以比生长速率（连续培养方式：以比生长速率（）筛选）筛选蛾簿热廖

15、怜查苏赠哟答欠驮能伸群乐伯脸松恒驱掀茸挝灼沈膜瑚毙宵污野发酵工业菌种发酵工业菌种 ABS0基质浓度对基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（两种菌的比生长速率（）的影响）的影响当当SS0时，富集什么菌株？时，富集什么菌株？拖擞点核掌嘿吕争野谐烧菠有当杉怔篡湿臃竞恫宅芜裸起蹿嗅陌赁售譬休发酵工业菌种发酵工业菌种连续富集培养技术分离菌株的优点连续富集培养技术分离菌株的优点 n分离的菌株特别适合连续发酵生产过程分离的菌株特别适合连续发酵生产过程n有利于分离具有某种工业生产特性的菌株有利于分离具有某种工业生产特性的菌株n可以筛选出能共生的稳定混合培养物可以筛选出能共生的稳定混合培养物戮蔑曙臂姓碧声捍笔入房

16、瞪葱识奇抬净仕钝卞闲懈搔判克乾芒颅锭桶讽抱发酵工业菌种发酵工业菌种B. 固体培养技术固体培养技术n常用于分离某些酶产生菌常用于分离某些酶产生菌 n选择压力：在选择培养基中加入所需酶选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质的基质饮沉豁比矿总孽膝职熏蹲敲幸华芋琵骆酷植钢腊唾半裙烩发主院垮溺砒叛发酵工业菌种发酵工业菌种随机分离原理与技术随机分离原理与技术n从产物入手，通过设计从产物入手，通过设计高产培养基高产培养基和建立快速和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。选出所需的目的菌。n技术技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应关键：

17、产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。筛选方法的确定。n随机分离技术举例随机分离技术举例 n抗生素产生菌的筛选抗生素产生菌的筛选n药理活性化合物产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选n生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选n多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选舰搁末酬蘸塔引剑裕胁擞坝熏挤侍毕纱湖丘纬热斥个琅肯研戳央搬漳巷赐发酵工业菌种发酵工业菌种高产培养基设计的几个原则高产培养基设计的几个原则 n制制备备一一系系列列的的培培养养基基，其其中中有有各各种种类类型型的的养养分分成成为为生长限制因素；生长限制因素；n使用一聚合或复合形式的生长限制养分；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；n避避

18、免免使使用用容容易易同同化化的的碳碳源源或或氮氮源源，防防止止分分解解代代谢谢物物阻遏；阻遏；n确定含有所需的辅因子（确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；）；n使使用用pH缓冲剂以减少缓冲剂以减少pH变化；变化；n前体、促进剂及抑制剂的采用。前体、促进剂及抑制剂的采用。勾据搪搂痕乒陆槛眺冶扔炕就尊耘狸稼垄抨刷标瓜献姐劲黍柱裔些悍菊扼发酵工业菌种发酵工业菌种抗生素产生菌的筛选抗生素产生菌的筛选n筛选模型：筛选模型：试验菌试验菌n筛选方法：筛选方法：铺菌法铺菌法复印平板法复印平板法液体培养筛选液体培养筛选 抗药性抗药性筛选筛选筛选模型：筛选模型：氨苄青霉素氨苄青霉素和和

19、-内酰胺酶内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同产生菌（克雷白氏菌）协同 I I II II无试样时（不含棒酸时），无试样时（不含棒酸时），I I对对IIII菌作用不大菌作用不大有试样时（含棒酸时），有试样时（含棒酸时），I I对对IIII菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性固体培养筛选固体培养筛选戈震鸭盔桂碉霍碾岛聂淘忻坞诽氖赏让箕上莹涉拳孝盔峭椽焙哆肿长橱漓发酵工业菌种发酵工业菌种试验菌试验菌 代表微生物类型代表微生物类型金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌209p革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌枯草杆菌枯草杆菌6633革兰氏阳性杆菌革兰氏阳性杆菌大肠杆菌大肠杆菌革兰氏阴性肠道细菌革

20、兰氏阴性肠道细菌耻垢分枝杆菌耻垢分枝杆菌607 结核杆菌结核杆菌白色念珠菌白色念珠菌 酵母状真菌酵母状真菌 青霉菌青霉菌 丝状真菌丝状真菌忿给刃盾渴狐葬奇拦婴皆亮港饱里奏柬寨纤涧纪藤安突绷娠迸罗蛤妄毛刚发酵工业菌种发酵工业菌种药理活性化合物产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选 n 药药理理活活性性化化合合物物是是指指能能抑抑制制人人类类代代谢谢中中某某一一个个关关键键酶酶的的微微生生物物产产物物即即酶酶抑抑制制剂剂，从从而而达达到到治疗的目的。治疗的目的。n 筛选模型：目标酶筛选模型：目标酶略湿纹争造恬扬舰渔唉樊戍交征吐浅寒堤跑袍库苑售信陪虫嘲窘愉瓮拢钢发酵工业菌种发酵工业菌种生长因子产生菌

21、的筛选生长因子产生菌的筛选n 筛选模型：营养缺陷型试验菌筛选模型：营养缺陷型试验菌 n筛筛选选方方法法：利利用用被被分分离离的的微微生生物物产产物物能能否否促促进进营养缺陷型试验菌生长营养缺陷型试验菌生长秆肉梭酶概氏谷哄略竣吼穿橡祁鹰睹昧爱矮剔柜你抿蔡沥蚌沙寄姥责嫁景发酵工业菌种发酵工业菌种氨基酸产生菌的筛选氨基酸产生菌的筛选 样品样品 预处理预处理 初筛（除真菌）初筛（除真菌） 在分离平板上生长获得多个单菌落在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（复印平板（copy copy 法）法） 平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到对应到cop

22、ycopy前相应前相应 u.v u.v线杀死长好的菌落线杀死长好的菌落 位置，找到目的菌落位置，找到目的菌落再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈产氨基酸菌落周围有生长圈 目的菌落进行液体培养，目的菌落进行液体培养， 对产物进行定量测定对产物进行定量测定 筛选产物含量高的菌株筛选产物含量高的菌株辜棒垃堂益锨狡泅潍筐备图陛托否阶寐鲁巡簿驾蝉丽雹浴渤阂待棋溢看二发酵工业菌种发酵工业菌种多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选n取样特点：碳水化合物工业的废弃物取样特点：碳水化合物工业的废弃物n筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液筛选方

23、案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。筛选高产菌。砍渣掌沧抱那凤蝇卿遣席贱瓜涩骄垣搂牡拽逞障冻般襄义多升阜欲蜕矽瑰发酵工业菌种发酵工业菌种细菌分离：以乳酸菌为例细菌分离：以乳酸菌为例 取未成熟的酱醪样品取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中至无菌磨口瓶中加麦芽汁至瓶口处，封塞，加麦芽汁至瓶口处，封塞，25培养培养24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜检培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌初步断定乳酸菌 用选择性培养基分批富集培养用选择性培养基分批富集培养2-3代代稀释

24、分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落根据透明圈挑选菌落 性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定） Rf值定性值定性 （有机酸呈黄斑点）（有机酸呈黄斑点） 乳酸生成量测定（滴定法）乳酸生成量测定（滴定法）肚斋歼狄骚辜撰找琐黑斗梦一剑睫巍谷辟吾莱擒闭亡硅按宛受泅蕴攻将俘发酵工业菌种发酵工业菌种放线菌的分离：放线菌的分离：以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选）以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选） 取工业发酵液（含孢子）样品取工业发酵液（含孢子

25、）样品1 1环环放入带玻璃珠的装有放入带玻璃珠的装有10ml无菌水的小三角瓶中，摇匀无菌水的小三角瓶中，摇匀采用稀释法制平板，获取单菌落采用稀释法制平板，获取单菌落 斜面保藏斜面保藏 高产菌恢复高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落根据高产菌的特点，选择目的菌落 放大培养，发酵液性能测试放大培养，发酵液性能测试挤敝沉巍抹耙给旺敝艾增节循司谅彝搂盒疫肃骆截圈烃图扮处财陨铁适漂发酵工业菌种发酵工业菌种真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例 取发酵液少许以取发酵液少许以10倍稀释成倍稀释成10-1-10-7 稀释分离法稀释分离法取取0.1ml加入固体培养基铺平皿（

26、加入固体培养基铺平皿（2）在麦芽汁固体培养基上，在麦芽汁固体培养基上，25培养培养48-72h 形态筛选形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用 纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次 生生成成子子囊囊孢孢子子速速度度测测定定 发酵力测定发酵力测定 性能测定性能测定 热死温度测定热死温度测定 凝集力测定凝集力测定 双乙酰含量测定双乙酰含量测定赣箔说衬永时擎诅棱钳精酒醉仁斟阿凡卡自夹杠谊旷斜柳披仪歇多殿容涟发酵工业菌种发酵工业菌种菌种选育改良的具体目标菌种选育改良的具体目标n提高目标产物的产量提高目标产物

27、的产量 n提高目标产物的纯度，减少副产物提高目标产物的纯度，减少副产物 n改良菌种性状，改善发酵过程改良菌种性状，改善发酵过程 n改变生物合成途径，以获得高产的新产品改变生物合成途径，以获得高产的新产品嫁啄决叙咖珍贺蔼鄙注乏堕炕越廖诱羔骆匀幸脆顷篓炎胜铣扇指玫哀靶吏发酵工业菌种发酵工业菌种 发酵工业菌种改良方法发酵工业菌种改良方法n常规育种常规育种(诱变育种诱变育种)n细胞工程育种细胞工程育种 n基于代谢调节的育种技术基于代谢调节的育种技术 n基因工程育种基因工程育种 n蛋白质工程育种蛋白质工程育种 n代谢工程育种代谢工程育种放闹岛粉韧友妹冀晾膳题躁檀光犁内横颧苹缕野潜潘维愉舌尧废面吟跋格发酵

28、工业菌种发酵工业菌种赖氨酸生产菌种的选育改良思路赖氨酸生产菌种的选育改良思路n出发菌株出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌n育种思路育种思路 1.优先合成的转换优先合成的转换渗漏缺陷型的选育渗漏缺陷型的选育 2.切断支路代谢切断支路代谢营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型 3.抗结构类似物突变株的选育：抗结构类似物突变株的选育：AEC 4.解除代谢互锁：解除代谢互锁：Leu- 、 抗抗Leu结构类似物、结构类似物、 喹啉喹啉s 、 苯醌苯醌s 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：增加前体物的合成和阻塞副产物

29、的生成： Ala-、抗、抗Asp结构类似物结构类似物 选育适宜的选育适宜的CO2固定酶固定酶/TCA循环酶活性比突变株循环酶活性比突变株 6.改善细胞膜的透过机能改善细胞膜的透过机能 7. 选育温度敏感突变株选育温度敏感突变株 8. 应用细胞工程和基因工程育种应用细胞工程和基因工程育种栈弘胃童佣庞存汉连厢答透毛穷劣柯皱垢俘据滋陷幂挎米悯桃为拧晦述土发酵工业菌种发酵工业菌种巡悄摹菜萎腾勃务宛金参噬赚坛蒜拽问霞病刮模嫡协笔故疹启宦虐滥惑唯发酵工业菌种发酵工业菌种选育适宜的选育适宜的CO2固定酶固定酶/TCA循环酶活性比突变株循环酶活性比突变株赖氨酸合成中间代谢有以下两条途径：赖氨酸合成中间代谢有以

30、下两条途径：通过通过TCA循环循环 葡萄糖葡萄糖 丙酮酸丙酮酸 草酰乙酸草酰乙酸 天冬氨酸天冬氨酸 赖氨酸赖氨酸 通过磷酸烯醇丙酮酸羧化反应通过磷酸烯醇丙酮酸羧化反应 葡萄糖葡萄糖 磷酸烯醇磷酸烯醇 草酰乙酸草酰乙酸 天冬氨酸天冬氨酸 式丙酮酸式丙酮酸 丙酮酸丙酮酸 赖氨酸赖氨酸遁亿煌袖锐饯京蕊彻指委皿妒昔锐奋亥勘蝗佃纱镐聘笆耪护砸肌迭买迢寸发酵工业菌种发酵工业菌种 代谢工程的定义代谢工程的定义n利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现

31、因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。起来的一个新的学科领域。n又称作途径工程，是多基因的基因工程。又称作途径工程，是多基因的基因工程。梳暇淌七床日臻减量渐漂体团苯只插程彬箩瞳败藻枣材收僚僻芬爪瓶栏孙发酵工业菌种发酵工业菌种 代谢工程代谢工程发展基础发展基础 代代谢谢网网络络理理论论：是是把把细细胞胞的的生生化化反反应应以以网网络络整整体体，而而不不是孤立地来考虑。是孤立地来考虑。代代谢谢网网络络分分流流处处的的代代谢谢产产物物称称为为节节点点，其其中中对对终终产产物物合成起决定作用的少数

32、节点称为主节点。合成起决定作用的少数节点称为主节点。根据节点下游分支的可变程度，节点分为：根据节点下游分支的可变程度，节点分为：柔柔性性节节点点： 解解除除一一个个分分支支的的反反馈馈抑抑制制可可提提高高该该分分支支下下游游产物的产量。产物的产量。半半柔柔性性节节点点：须须降降低低主主分分支支的的酶酶活活并并同同时时提提高高次次分分支支的的酶酶活活或或解解除除其其反反馈馈抑抑制制，才才可可提提高高次次分分支支下下游游产产物物的的产量。产量。刚性节点刚性节点：其下游各分支的比例不易改变。：其下游各分支的比例不易改变。刁挛趟羚欠摈过玄嫁汕亦盯阂忧登绥炸扦鹤纱瘁侠焙箕怪卒燃资趟赋疲缺发酵工业菌种发酵

33、工业菌种 代谢工程代谢工程发展基础发展基础相相依依网网络络：代代谢谢网网络络中中各各主主节节点点集集中中于于产产物物，为为了了避避免免中中间间物物的的过过量量积积累累，各各分分支支的的代代谢谢流流都都必必须须保保持持平平衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。独独立立网网络络：代代谢谢网网络络的的主主节节点点不不集集中中，可可以以通通过过对对代代谢谢的的修修饰饰来来影影响响产产物物的的产产量量,其其对对代代谢谢修修饰饰的的应应答答能能力力，取决于各节点的刚柔性及其位置。取决于各节点的刚柔性及其位置。 S I P S P B B1 B2相依网路相依网路

34、独立网路独立网路呕桩块玩笆槐宇座辊墩励遁喘柬舅瑟糙乡画任压委办酋露诌姚乌盗惫瘤吭发酵工业菌种发酵工业菌种（三）代谢工程育种思路（三）代谢工程育种思路1.1. 改变代谢流改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成。断有害代谢产物的合成。（1）加速限速反应）加速限速反应（2）改变分支代谢途径流向：）改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代谢末端产物的产量。的代谢末端产物的产量。（3）构

35、建代谢旁路）构建代谢旁路（4）改变能量代谢途径）改变能量代谢途径胁春狈酞会摊二山派江命哈驯腮沉兵哟筋司叶篷颈节镰绥挞聘诧斋礼辱苞发酵工业菌种发酵工业菌种 代谢工程育种思路代谢工程育种思路2.扩展代谢途径扩展代谢途径 （1）在在引引入入外外源源基基因因后后，使使原原来来的的代代谢谢途途径向后延伸，产生新的末端代谢产物。径向后延伸，产生新的末端代谢产物。（2）使使原原来来的的代代谢谢途途径径向向前前延延伸伸，可可以以利利用新的原料生物合成代谢末端产物。用新的原料生物合成代谢末端产物。呻稽暑榷偏容颧史臀估散拒笛幼英乳亚旁酵皿滴率汕蛤虏喘泥桔垒协栅皆发酵工业菌种发酵工业菌种 代谢工程育种思路代谢工程育

36、种思路 3. 转移或构建新的代谢途径转移或构建新的代谢途径1)转转移移代代谢谢途途径径:为为生生产产某某一一新新的的化化学学结结构构的的代代谢谢产产物物，将将催催化化某某一一代代谢谢途途径径的的基基因因组组克克隆隆到到另另一一不不具具备备该该种种能能力力的的微微生生物物中中，达达到到代代谢谢途途径径转转移移的的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。目的，使之具备生产该种新化合物的能力。2)构构建建新新的的代代谢谢途途径径:利利用用基基因因工工程程手手段段，通通过过克克隆隆少少数数基基因因将将原原来来细细胞胞中中无无关关的的两两条条代代谢谢途途径径桥桥连连在一起，形成新的代谢途径。在一起，形成新

37、的代谢途径。娘谐弄怨懊樊器租虎淬酝拱初滇柿斋饿侦龋剂火弹貌残嫂痒咱桑擒摧状冗发酵工业菌种发酵工业菌种本章小结本章小结n掌握微生物分离筛选的基本概念、基本原理与掌握微生物分离筛选的基本概念、基本原理与基本技术基本技术n掌握菌种改良的基本技术与方法掌握菌种改良的基本技术与方法哩综撞垂碎隶姜缩衍敝蘑芬忽更葬咖雇推非乃肿巩坟讼沾辛顶度犹咖桩健发酵工业菌种发酵工业菌种 作业作业1. 如何筛选肌苷酸高产菌株？试根据肌苷如何筛选肌苷酸高产菌株？试根据肌苷酸的代谢调节机制来分析。酸的代谢调节机制来分析。2. 试举例说明采用抗代谢类似物筛选高产试举例说明采用抗代谢类似物筛选高产菌株的原理与方法。菌株的原理与方法。棵畜炯躺簇洒膝洁逛变樱硬季腻彼马苟物戊崔媚棺炼娠点压篡得萝痞宵擂发酵工业菌种发酵工业菌种