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1、实验三微生物显微技术实验三 微生物显微技术必做：四大类微生物的镜下特征革兰氏染色酵母菌的计数选做：芽孢染色微生物大小的测量（1）简单染色涂片干燥固定染色水洗干燥镜检。 涂片：取两块洁净无油的载玻片，各滴一小滴生理盐水(或蒸溜水)于玻片中央，用接种环挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。干燥、固定：将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。染色：滴加染液12滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色12min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min 。 水洗：倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。干燥：甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水
2、纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。 镜检：涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。 注意：滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。干燥、固定时切勿离火焰太近，以防高温破坏菌体形态。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。（2）革兰氏染色 “三区”涂片法 ：在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的
3、大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两种菌的混合区，干燥、固定。 要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 革兰氏染色荚膜（3）其他染色芽孢染色鞭毛染色（4）微生物的计数血球计数板其他培养法OD值重量法代谢水平比例计数（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定1、显微镜直接计数法1）常规方法：采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；原理：将的薄层空间划分为原理：将的薄层空间划分为40
4、0小格，从中均匀分布小格，从中均匀分布地选取地选取80或或100小格，计数其中的细胞数目，换算成小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细）细菌细胞太小，不易沉降；（胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区
5、分死活细胞。在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。培养法采用培养平板计数法要求操作熟练采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果：、准确，否则难以得到正确的结果：样品充分混匀；同一稀释度三个以上重复,取平均值；每个平板上的菌落数目合适（每个平板上的菌落数目合适（30-30030-300），便于），便于准确计数；准确计数；一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。膜过滤培养法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养
6、基上进行培养，对形成的菌落进行统计。The most probable number method（液体稀释法）对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度平行对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算出样品中的微的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。生物数目。如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；如某一细菌在稀释法中的生长情况如下； 稀释度稀释度 l0-3 10-4 10-5 l
7、0-6 10-7 10-8 重复数重复数 5 5 5 5 5 5出现生长的管数出现生长的管数 5 5 5 4 1 0 根据以上结果，在接种根据以上结果，在接种l0-310-5稀释液的试管中稀释液的试管中5个重个重复都有生长，在接种复都有生长，在接种l0-6稀释液的试管中有稀释液的试管中有4个重复生长，个重复生长，在接种在接种10-7稀释液的试管中只有稀释液的试管中只有1个生长，而接种个生长，而接种10-8稀释稀释液的试管全无生长。由此可得出其数量指标为液的试管全无生长。由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释，然后乘以第一位数的
8、稀释倍数（倍数（10-5的稀释倍数为的稀释倍数为100 000）。那么，）。那么，1ml原菌液中原菌液中的活菌数的活菌数17100 000 = 17105。即每毫升原菌液含活。即每毫升原菌液含活菌数为菌数为l700000个。个。OD法法在一定波长下，测定菌悬液的光密在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度度，以光密度(optical density, 即即O.D.)表示菌量。表示菌量。实验测量时应控制在菌浓度与光密度实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。成正比的线性范围内，否则不准确。通常根据经验和目测推断细菌的生长密度通常根据经验和目测推断细菌的生长密度要求较高的
9、实验采用分光光度计要求较高的实验采用分光光度计一般一般OD600OD600需标准曲线需标准曲线实验中偶尔会出现菌液的实验中偶尔会出现菌液的ODOD值出现负值，原因值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。不能离心，后，与培养基反应，发生变色反应。不能离心，保持悬浮。保持悬浮。二 微生物生长的测定生理指标法生理指标法微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。生物热等与其群体的规模成正相关。样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。热计等设备来测定相应的指标。常用于对微生物的快速鉴定与检测常用于对微生物的快速鉴定与检测
