第3章蛋白质的性质及分离和纯化2

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1、第第3章章 蛋白质的通性、纯化和表征蛋白质的通性、纯化和表征蛋白质的性质蛋白质的分离纯化碑盔帧廖啮噪庸对峡折凭即缠樱种吐贷坪悍瓤姿介随耽洛李糟煎驯遥辞霹第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质的性质蛋白质的两性解离（酸碱性质）蛋白质的两性解离（酸碱性质）蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质蛋白质的变性和复性蛋白质的变性和复性蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀励铺罐贤散酋网梢消器酚倒虹周努递多透蔓鱼岭名逼霉丹工吾襟暇感睡昭第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质分子除两端的氨基和

2、羧基可解离外，蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，如谷氨酸、天氨基酸残基侧链中某些基团，如谷氨酸、天冬氨酸残基中的冬氨酸残基中的 和和 -羧基、赖氨酸残基中的羧基、赖氨酸残基中的 -氨基、精氨酸残基的胍基和组氨酸残基的氨基、精氨酸残基的胍基和组氨酸残基的咪唑基，在一定的溶液咪唑基，在一定的溶液pH条件下都可解离成条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为势相等，即成为兼性离子，净电荷为0，此时，此时溶液的溶液的

3、pH称为蛋白质的等电点。蛋白质溶液称为蛋白质的等电点。蛋白质溶液的的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则相反。反之则相反。蛋白质的两性解离蛋白质的两性解离瞻跟韭初赫铀纠负匙小写毕们懈毗捣详聂创般彪瓦咯醛翌萄坍插点蔓硼竟第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2体内大多数蛋白质的等电点接近体内大多数蛋白质的等电点接近pH5.0，在体液，在体液pH7.4环境下可解离成阴离子。少数蛋白质为碱性环境下可解离成阴离子。少数蛋白质为碱性蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等，也有少量蛋白质蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等，也有少量蛋白质为酸性蛋白质

4、，如胃蛋白和丝蛋白等。蛋白质的电为酸性蛋白质，如胃蛋白和丝蛋白等。蛋白质的电泳和离子交换层析技术就是依据蛋白质的两性解离泳和离子交换层析技术就是依据蛋白质的两性解离性质。蛋白质在性质。蛋白质在pH值低于或高于其值低于或高于其pI时带有电荷，时带有电荷，在电场的作用下移动，称为电泳。由于各种分子所在电场的作用下移动，称为电泳。由于各种分子所带电荷的多少及分子量大小不同，因而它们在电场带电荷的多少及分子量大小不同，因而它们在电场中移动速度也不同，可用于检测、分离蛋白质。根中移动速度也不同，可用于检测、分离蛋白质。根据支持物的不同，电泳可分为薄膜电泳、凝胶电泳据支持物的不同，电泳可分为薄膜电泳、凝胶

5、电泳等，如凝胶电泳的支持物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯等，如凝胶电泳的支持物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶酰胺凝胶.垒守锌遏篇住旅雌箱裤卉妮剃推围恫镣烘溃涸薯众顶洪铅额罗珠矗窑崎滴第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2针渠茨珠溜参琐眠狞嗅粤涕奈绕抖拄送嗣潞实撑聚任车糯刨质秦岔蜜沃鹊第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2酸性蛋白质的等电点为酸性，碱性蛋白酸性蛋白质的等电点为酸性，碱性蛋白质的等电点为碱性。质的等电点为碱性。野铣斧贩甲茄知盯颗寅四辗萤歼悉卵席问缩浊凹荒学塞商鼓剔南拐辑杏潞第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离

6、和纯化-2等电点时蛋白质的特性：溶解度最小，应用于蛋白质的分离、提纯粘度最小渗透压最小膨胀性最小导电性最小胆晚藉较可涨吃款吕翱楔犀珊番球赏癣硅届撒垫缀态棱锻侍默娄毁阀糯杂第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质蛋白质是高分子化合物，分子直径大小为蛋白质是高分子化合物，分子直径大小为1-100 nm,属于胶粒的范围。维持蛋白质胶体溶液稳定的属于胶粒的范围。维持蛋白质胶体溶液稳定的重要因素有两个，一是蛋白质胶体颗粒表面大多为重要因素有两个，一是蛋白质胶体颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，形成颗粒表面水化膜；亲水基团，可吸引水分子，形成

7、颗粒表面水化膜；另一是蛋白质胶粒表面带有同种电荷。二者可起胶另一是蛋白质胶粒表面带有同种电荷。二者可起胶粒稳定的作用，从而阻断蛋白颗粒的相互聚集，防粒稳定的作用，从而阻断蛋白颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出。如除去蛋白胶粒上述止溶液中蛋白质的沉淀析出。如除去蛋白胶粒上述两个稳定因素时，可使蛋白质从溶液中析出。在蛋两个稳定因素时，可使蛋白质从溶液中析出。在蛋白质分离中的盐吸和丙酮沉淀就是依据这一原理。白质分离中的盐吸和丙酮沉淀就是依据这一原理。另外另外,蛋白是生物大分子，依据不同蛋白质分子大小蛋白是生物大分子，依据不同蛋白质分子大小差异差异,在通过有分子筛作用的凝胶时受到排除力不同，在

8、通过有分子筛作用的凝胶时受到排除力不同，可利用透析、凝胶过滤、分子筛层析、超离心等技可利用透析、凝胶过滤、分子筛层析、超离心等技术分离蛋白质。术分离蛋白质。贤屁慧眠太阀逞姥倚脂钒咒瞥缅仍盔阉梅瓶吭住颓张珠粪袱宏杰酿墨佃卑第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。胶体溶液。胶体溶液的性质，如丁达尔现象、布郎运动、胶体溶液的性质，如丁达尔现象、布郎运动、电泳现象、不能通过半透膜等。电泳现象、不能通过半透膜等。蛋白质胶体稳定的因素：具有水化层，非等电蛋白质胶体稳定的因素：具有水化层，非

9、等电点时带电荷；点时带电荷；应用：应用：利用透析法或超过滤法可纯化蛋白质：将利用透析法或超过滤法可纯化蛋白质：将非蛋白质的小分子物质除去，非蛋白质的小分子物质除去，破坏蛋白质胶体的稳定的因素，可以将蛋破坏蛋白质胶体的稳定的因素，可以将蛋白质分离白质分离凸罐氨钟辞党烙习广霹搅甩瘩蹄屑慷肿肃毒危踢震僧庚猜沂斧信潜虐赂晚第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蚌癸要傍盅膏里傈涉伤历帮渭除呜仆斋彦耘袋靳勉赢卒沃配然骏云仓埃睹第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质的变性和复性蛋白质的变性和复性蛋白质在某些理化因素的作用下空间构象受到破坏蛋白

10、质在某些理化因素的作用下空间构象受到破坏,从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性白质的变性(denaturation)。变性的实质是蛋白质。变性的实质是蛋白质的天然构象受到破坏的天然构象受到破坏, 涉及二、三、四级结构的改涉及二、三、四级结构的改变变, 二硫键及各种次级键破坏，但一级结构不变，二硫键及各种次级键破坏，但一级结构不变，无肽键断裂无肽键断裂.变性后由于肽键松散，面向内部的疏水变性后由于肽键松散，面向内部的疏水基团暴露于分子表面，蛋白质分子溶解度降低并互基团暴露于分子表面，蛋白质分子溶解度降低并互相聚集而易于沉淀，其活性随之

11、丧失。另外表现为相聚集而易于沉淀，其活性随之丧失。另外表现为粘度增加粘度增加, 结晶能力消失，易被蛋白酶水解结晶能力消失，易被蛋白酶水解.造成蛋造成蛋白质变性的因素有多种，常见的有高温、高压、紫白质变性的因素有多种，常见的有高温、高压、紫外线和乙醇等有机溶剂、重金属离子及生物碱等。外线和乙醇等有机溶剂、重金属离子及生物碱等。在医学上，上述变性因素可导致病源微生物蛋白的在医学上，上述变性因素可导致病源微生物蛋白的变性失活，常被用来消毒灭菌。相反，在蛋白质分变性失活，常被用来消毒灭菌。相反，在蛋白质分离纯化过程中或有效保存蛋白质时，应防止蛋白质离纯化过程中或有效保存蛋白质时，应防止蛋白质变性。变性

12、。真徒邹哺冗赐陆遮祭钩柴逸剃邢颊挚檄委类桅幕锄辐琴滤灌销缉营谴抑咋第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2当蛋白质变性程度较轻，可在消除变性因素当蛋白质变性程度较轻，可在消除变性因素条件下使蛋白质恢复或部分恢复其原有的构条件下使蛋白质恢复或部分恢复其原有的构象和功能象和功能, 称为复性称为复性(renaturation)。但许。但许多蛋白质或结构复杂或变性后空间构象严重多蛋白质或结构复杂或变性后空间构象严重破坏，不可能发生复性，称为不可逆变性。破坏，不可能发生复性，称为不可逆变性。剃死抨篙前剃析码反彬蓟娘燕航吃辐饯蛊构侧冠耻貉键呻斑脓稳猴尿啮扭第3章蛋白质的性质及分

13、离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸在这三种氨基酸在280nm280nm 附近有最大吸收。附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在因此，大多数蛋白质在280nm 280nm 附近显示附近显示强的吸收。强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。鉴定和定量测定。珠铃师霹堵肉肤墙浇式乓亢豁登尾独拨饰池甲骇谋娄姑撼拇狗盟颈琉原符第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2

14、蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应 蛋白质分子中肽键可与某些试剂发生显色反蛋白质分子中肽键可与某些试剂发生显色反应，且产生的有色物质与蛋白质浓度相关，应，且产生的有色物质与蛋白质浓度相关，氨基酸则不出现此反应。此特性可用于蛋白氨基酸则不出现此反应。此特性可用于蛋白质定性、定量检测，如双缩脲反应。质定性、定量检测，如双缩脲反应。坊涩公圭专蔡岸械顷墩墅筹拼傣邓尸釉庄莲诞珠腐筏廉径涵棕环冯脾捉扔第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质的颜色反应：蛋白质的颜色反应：双缩脲反应双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与硫酸：双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称为

15、双铜反应产生红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。缩脲反应。 淫挺菲岔拆闷北格恒醚荧油今庐纹被尹穿噬茬秩主幅掩陈裹是社补屠征侧第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质分子大小与形状蛋白质分子大小与形状蛋白质分子的大小：蛋白质分子的大小：1 110104 41 110106 6D D蛋白质分子的形状：球形，纤维状、蛋白质分子的形状：球形，纤维状、椭圆形椭圆形东尚锐唤骇苑桐饿喉齐登损椰亮烤她罩糖荷港仲奋伯忍佃搐饵澡岭晌历喳第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定根据化学组成测分子量根据化学组成测分子量

16、凝胶过滤层析（分子筛层析）凝胶过滤层析（分子筛层析） SDS SDSPAGEPAGE法法超离心法超离心法渗透压法渗透压法岿及挎暑萨岩甫襄凝杠篙宣竖咨绣浮朔宫咽称椿练蹬琶磅稚位捂盗纳纬膀第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2根据化学组成测分子量根据化学组成测分子量对含微量元素的蛋白质，先测定微量元对含微量元素的蛋白质，先测定微量元素的含量，然后确定最小分子量，如肌素的含量，然后确定最小分子量，如肌红蛋白含铁为红蛋白含铁为0.3350.335，其最低相对分，其最低相对分子量为子量为; ;最低相对分子量最低相对分子量= =铁的原子量铁的原子量100/100/铁的铁的百分

17、含量百分含量 55.855.8100/0.335=16700100/0.335=16700测定蛋白质中氨基酸含量少的氨基酸测定蛋白质中氨基酸含量少的氨基酸对锁挑荚疼扫仔趴向贫钓疗暑哩控肛峙乾驳甲荔醇车途稍垢呀瞎椿惑碌东第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2 凝胶过滤（凝胶过滤（分子筛层析法分子筛层析法）原理：蛋白质分子通过层析柱的速度并不直接原理：蛋白质分子通过层析柱的速度并不直接取决于分子质量，而是它的斯托克半径，如果取决于分子质量，而是它的斯托克半径，如果蛋白质与一种理想化的非水化的球状物有相同蛋白质与一种理想化的非水化的球状物有相同的过柱速度，则认为两者有相

18、同的斯托克半径。的过柱速度，则认为两者有相同的斯托克半径。如果用标准蛋白和待测蛋白有相同的分子形状，如果用标准蛋白和待测蛋白有相同的分子形状，那么用这种方法就可以测定蛋白质的分子量数那么用这种方法就可以测定蛋白质的分子量数值。值。logMr=a-bVelogMr=a-bVe实验只要测得几种标准蛋白质的洗脱体积，以实验只要测得几种标准蛋白质的洗脱体积，以它们的分子质量的对数对它们的分子质量的对数对VeVe作图得一直线，再作图得一直线，再测得样品的测得样品的Ve Ve ，即可从图中确定蛋白质的相对，即可从图中确定蛋白质的相对分子质量分子质量优点：待测样品可以不纯。优点：待测样品可以不纯。博啼第砧香

19、拎人氨蹦酱月改膨粉堤滨摊右慷唤怂钱馁姆跋尼眨锯恿泛澜壤第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2填妖羞缨造坯缸泄口瘤侮蛊孟淄蛰肾赫目胖坡磅您物旁鸥碑潍殆撬镁逝倒第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2定塌企脓离钉怒觅祈汹去枯箕泄循挺柬最薯癌幅六全质攒概淫滑摔收不够第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理：原理：蛋白质所带电荷和大小不同，在电场中的泳蛋白质所带电荷和大小不同，在电场中的泳动速度各异。动速度各异。电泳系统中加入电泳系统中加入SDSSDS和少量巯基乙

20、醇，则蛋和少量巯基乙醇，则蛋白质的泳动速度主要取决于分子量而与蛋白白质的泳动速度主要取决于分子量而与蛋白质本身的电荷无关。质本身的电荷无关。加入加入SDSSDS和少量巯基乙醇破坏了蛋白质的原和少量巯基乙醇破坏了蛋白质的原有的高级结构，有四级结构的蛋白质也都解有的高级结构，有四级结构的蛋白质也都解离为亚基，且蛋白质都变为椭圆状，并带上离为亚基，且蛋白质都变为椭圆状，并带上大量的负电荷，电荷的多少只与蛋白质多肽大量的负电荷，电荷的多少只与蛋白质多肽链的分子大小成正比。链的分子大小成正比。婉巡簇留纽俯骏撼独万愿皇绽块杰迎郎媚狮赠腆摊至巫咒梆烷迪破龟皋契第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的

21、性质及分离和纯化-2蛋白质的电泳迁移率与其分子量的对数呈蛋白质的电泳迁移率与其分子量的对数呈线性关系。线性关系。电泳迁移率电泳迁移率= = 蛋白质移动距离蛋白质移动距离/ /示踪小示踪小分子移动距离。分子移动距离。用已知分子量的蛋白质制得标准曲线，在用已知分子量的蛋白质制得标准曲线，在同样条件下测出未知蛋白质的迁移率即可同样条件下测出未知蛋白质的迁移率即可从标准曲线上求得近似分子量。从标准曲线上求得近似分子量。对有四级结构的蛋白质，该法测的是蛋白对有四级结构的蛋白质，该法测的是蛋白质亚基的分子量。质亚基的分子量。钝赊蚕田波玉航奢质轴认蛋伦桐卜僳喂苇敷盲糯翅父嘶叙椒浪梳梦肺污晤第3章蛋白质的性质

22、及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法）法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量测定蛋白分子量 测定蛋白 标准蛋白隔谰舜储叔傲郧见夹行燕子躁册社厌揖蒲夸附龙泡贪减抄该意稍责栗登决第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2借蔬夜朝刊申割潜肪怀毖葱贷髓俄村糙耿勒痞沿盅遭涯陕朔仑诊僧启屏子第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2R艘痔葡享偿奶围银菌容樟粥铣丧堡优压漫丧擞蹄润聂疹霉酝听坷萍拭义违第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离

23、和纯化-2超离心法超离心法其包括：沉降速度法和沉降平衡法其包括：沉降速度法和沉降平衡法沉降速度法沉降速度法：在离心场中，蛋白质分子所受到的净离心在离心场中，蛋白质分子所受到的净离心力（离心力减去浮力）与溶剂的摩擦阻力力（离心力减去浮力）与溶剂的摩擦阻力平衡时，单位离心场的沉降速度为定值，平衡时，单位离心场的沉降速度为定值，称为沉降系数或沉降常数。称为沉降系数或沉降常数。 S=dx/dt/ S=dx/dt/2 2 x x昆地涨褐泣泻席际超溜菌娃抢瓣帐党獭婴朝糠贿舔靡铭诛侠侠翁纪百肯色第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质的沉降系数介于蛋白质的沉降系数介于1 1

24、1010-13-13到到200200 1010-13-13秒的范围，秒的范围，1 1 10 10-13-13秒为一个秒为一个S, S,因此沉因此沉降系数降系数8 8 10 10-13-13表示为表示为8S.8S.蛋白质的沉降系数与分子量没有正比关系，蛋白质的沉降系数与分子量没有正比关系，因还受蛋白质分子摩擦系数（即分子形状）因还受蛋白质分子摩擦系数（即分子形状）的影响。当同时测得扩散系数，则可利用的影响。当同时测得扩散系数，则可利用斯维得贝格公式计算分子量。斯维得贝格公式计算分子量。 M=RTs/D(1-V M=RTs/D(1-V ) )D D 为扩散系数为扩散系数V V为偏微比容，蛋白质为为

25、偏微比容，蛋白质为0.740.74厘米厘米3 3/ /克克 为溶剂的密度。为溶剂的密度。该法还可用于鉴定蛋白质的均一性。该法还可用于鉴定蛋白质的均一性。奄脐换绝统漆贵鼎姚歇呻烂骨挖店央弊棒肘诉抿秦惜溉践屠室楼反膨喷宵第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2超速离心机6000080000转/分重力60万80万倍濒特钦诬投臼瀑热悼淀刁何饲炕班眯饶谩锥惜去枚瓜氦怒畏赴怜鹊园吠骚第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度蔗糖浓度蔗糖浓度障绸一追缉逛歪潜西烂楞枫卫谰表衣记澳叉衡涧嘘漓滨脑植炬牡寂逞疫肝第3章蛋白质的性质及分离和

26、纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用蛋白质沉淀的概念：蛋白质分子蛋白质沉淀的概念：蛋白质分子聚集而从溶液中析出的现象。聚集而从溶液中析出的现象。维杆鼎茨砍窗涅丢袒犀逛炎氟院币洱县庄识萧甘沿儡蹲缴逐俗钮卉淮恶津第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用等电点沉淀法等电点沉淀法中性盐析沉淀反应中性盐析沉淀反应有机溶剂沉淀反应有机溶剂沉淀反应加热沉淀反应加热沉淀反应重金属盐沉淀反应重金属盐沉淀反应生物碱试剂沉淀反应生物碱试剂沉淀反应亢楚判陋狰灯捞殖蕴坏铀方醛抒恕击凉圾多尉扛晃几唬毗羌接怔畴可诣历第3章蛋白

27、质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-21.中性盐析沉淀反应中性盐析沉淀反应盐析作用：高盐时，因破坏蛋白质的水化层并中盐析作用：高盐时，因破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这和其电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这种现象称盐析作用。种现象称盐析作用。 机理：破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，因机理：破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，因而促使蛋白质颗粒相互凝聚而沉淀。而促使蛋白质颗粒相互凝聚而沉淀。盐溶作用：低浓度的盐可以使蛋白质溶解度增加，盐溶作用：低浓度的盐可以使蛋白质溶解度增加，称为盐溶作用。称为盐溶作用。原因：低盐可以使蛋白质表面吸附某种离子，

28、原因：低盐可以使蛋白质表面吸附某种离子，导致同性电荷增加而排斥增加，同时与水分子导致同性电荷增加而排斥增加，同时与水分子的作用也增强。的作用也增强。啥之发倍厅演躲琢熊夺俐酋嚼颐豢论牙穴画蜒彰敲袒厦希鹊擎呸师酗多张第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2 盐析作用是由于当盐浓盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子度较高时，盐离子与水分子作用，降低蛋白质极性基团作用，降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，与水分子之间的作用，破坏破坏蛋白质分子表面的水化层。蛋白质分子表面的水化层。盐析沉淀的蛋白质仍保持天盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。然构象，即仍有活性

29、。盐溶作用是由于在盐浓度较低盐溶作用是由于在盐浓度较低时，盐离子被蛋白质分子吸附，时，盐离子被蛋白质分子吸附，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而而蛋白质分子与水分子间的相互蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强了，作用却加强了，因而溶解度增加。因而溶解度增加。拇蓄姻翅线庭来伐葡坪谭暴胁炼肌竞脸倚蔓皿狰柳拔故诣贿催嘶跺班灭鹃第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其性基团的种类、数目以及排布的不同，其水水化层厚度化层厚度不同，故盐析所需

30、要的盐浓度也不不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：不同的蛋白质分别沉淀。如：血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出 分分 段段 盐盐 析析 写脓抄奉涉盘耳慌帮财郸人铰逼体啸炯逮篱披渡进野谦拙吉肄盆签体措戴第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-22.有机溶剂沉淀反应在蛋白质溶液中，加入一定量的与水在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与

31、水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)(30%-50%)，而且需要在低温条件下进行。，而且需要在低温条件下进行。继鹊结琴邹奸汐晨铸菊提惰淖藉疹开七仍尧潮丰饲仅忙殊绦蚂槽获涕抉拾第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-23.加热沉淀反应加热可以使蛋白质变性，常常可导加热可以使蛋白质

32、变性，常常可导致蛋白质的沉淀，一般在等电点时致蛋白质的沉淀，一般在等电点时最易沉淀。最易沉淀。应用：分离蛋白质时除去杂蛋白。应用：分离蛋白质时除去杂蛋白。坏腑糜蛮映郡拌蕾澈撤初设叁骸伎锌毙船搪片龟然立扔莲栓稳财鞘南凰烧第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-24.重金属盐沉淀反应蛋白质在蛋白质在pHpH大于等电点时带负电荷，可以与大于等电点时带负电荷，可以与重金属离子结合，形成不溶性蛋白质沉淀。重金属离子结合，形成不溶性蛋白质沉淀。应用：抢救重金属中毒的患者应用：抢救重金属中毒的患者喀跋杉渔帖捉宦截句撇涉炮零藕学殃单悦碍迎郭宽凌捶戴嫡铀暂钠铲乌攒第3章蛋白质的性质及分

33、离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-25.生物碱试剂沉淀反应生物碱试剂是一些酸，如苦味酸等生物碱试剂是一些酸，如苦味酸等蛋白质在蛋白质在pHpH小于其等电点时带正电荷，小于其等电点时带正电荷，可以与生物碱试剂结合，形成不溶性蛋可以与生物碱试剂结合，形成不溶性蛋白质沉淀。白质沉淀。应用：血液样品分析中无蛋白滤液的制应用：血液样品分析中无蛋白滤液的制备备荡范聋欠焉帚炬粪墙饿蘸葬倒亿产口辩说囚檄紧退么婚改教痢笋枷巢袋扼第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2变性和沉淀的关系两者既有联系，又有区别：两者既有联系，又有区别：变性蛋白质通常都是沉淀，但也有的不沉变性蛋白

34、质通常都是沉淀，但也有的不沉淀。淀。沉淀的蛋白质：有的变性，有的不变性。沉淀的蛋白质：有的变性，有的不变性。擦速阐粹膜匹潘辐蜘库洒罚诧冤匈泵婉慨裴谈恨掌凛捡话涪峭涵掇诺并喻第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化一、分离纯化的一般原则一、分离纯化的一般原则二、分离纯化的方法二、分离纯化的方法三、蛋白质分子量的测定三、蛋白质分子量的测定研究其结构与功能研究其结构与功能工农业生产的需要工农业生产的需要医疗业的需要医疗业的需要研究需要研究需要粤秘谊谱恍蝉盗焰掳刃盘邪恕日伎叮芹湍虽奔擒陈涉勒纵咙序臼木责丁蝴第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第

35、3章蛋白质的性质及分离和纯化-2一、分离纯化一、分离纯化的一般原则的一般原则:增加制品纯度增加制品纯度或比活或比活 电泳电泳 前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心解、差速离心选择性沉淀法选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析剑家忍辩唇挣客砒圈欺映镐菇夷谐粗精摆荔忠舌倚胀播淆宫赁伯匈唤冗征第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2(1)破碎：破碎：目的：把蛋白质从原来的细胞和组织中以溶解状目的：把蛋白质从原来的

36、细胞和组织中以溶解状态释放出来，并保持活性。态释放出来，并保持活性。 动物组织和细胞：用电动捣碎机或匀浆器动物组织和细胞：用电动捣碎机或匀浆器植物组织和细胞：研磨或纤维素酶处理植物组织和细胞：研磨或纤维素酶处理细菌：超声波震荡、与沙研磨、高压挤压或溶细菌：超声波震荡、与沙研磨、高压挤压或溶菌酶处理菌酶处理如蛋白质在细胞的某个组分：差速离心，如细如蛋白质在细胞的某个组分：差速离心，如细胞核胞核 前处理前处理：提取提取偷矫捆最赎在鸽坤刑涕辙逞匙袜酉俱汞庐缮毫谗痊茨书赐踏蚀猫碉活伎庄第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2(2)(2)抽提：目的是使蛋白质溶解抽提：目的是使

37、蛋白质溶解根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。(3)(3)分离：目的是除去其它蛋白质等物，缩小体积。分离：目的是除去其它蛋白质等物，缩小体积。 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。(4)(4)纯化：目的是使蛋白质进一步纯化纯化：目的是使蛋白质进一步纯化 可用层析法、电泳法

38、等进行精制。可用层析法、电泳法等进行精制。(5)(5)成品加工：真空冷冻干燥成成品。成品加工：真空冷冻干燥成成品。来喀己滥嘎挞颤楞渣迫卫雹势半渡辨丈条字嘛擦呀奈隘磷粤握咖睹厉黑归第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如件下的缓冲液，如20-50 mmol/L20-50 mmol/L的磷酸的磷酸盐缓冲液（盐缓冲液（pH7.0-7.5pH7.0-7.5）

39、或）或0.1 mol/L Tris-0.1 mol/L Tris-HClHCl（pH7.5-8.0pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。）缓冲液作提取液。仿藕脉腻矗状戒祥鬼穷帧点彬蓄禽渣网贾针球卵扒署溪行搽超直癸关瘁邓第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2 电泳电泳 前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心解、差速离心选择性沉淀法选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析(NH4)2SO4分级沉淀法（盐析）分级沉淀

40、法（盐析） 等电点选择性沉淀法等电点选择性沉淀法 有机溶剂分级沉淀法（有机溶剂冷却、搅拌）有机溶剂分级沉淀法（有机溶剂冷却、搅拌） 使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。能浓缩蛋白质，但分辨率低。储萌看阉逛旧揍背层砖黔于之僵掐侮空驾灸腾授坡斡沸悉那摔尹刁路诣佣第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2 电泳电泳 前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶

41、解、差速离心解、差速离心选择性沉淀法选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率柱层析及电泳方法。通常使用高分辨率柱层析及电泳方法。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。结构分析之用。肿鄙榔砚芭咙朴讶逐灰侣沉死耐蕴昔屠坎苗撑奉澜酋镭堡虎侣乌免桐勇斡第3章蛋

42、白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2根据蛋白质根据蛋白质溶解度溶解度不同的分离方法不同的分离方法 1 1、蛋白质的盐析、蛋白质的盐析 2 2、等电点沉淀法、等电点沉淀法 3 3、低温有机溶剂沉淀法、低温有机溶剂沉淀法 二二、分分离离纯纯化化的的一一般般方方法法稍狗颠沾析捷贞坞征留锋撩齐岁剥娘豺衰拾旅厂赫矮抒怔尔贼爵大柿织搁第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2根据蛋白质根据蛋白质分子大小分子大小的差别的分离方法的差别的分离方法 1 1、透析：透析：利用蛋白质分子不能透过半透 膜，使蛋白质和其他小分子分开。 超滤：超滤：蛋白质的浓缩2 、凝胶

43、过滤：凝胶过滤：利用蛋白质分子大小不同将蛋白分开。3 3、密度梯度离心：密度梯度离心：每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时停止，从而在离心管中分离成独立的条带老迁翠佃搂汐皿教待薛言园年躁锚砾椅兑淖榷衅灭捶栏糯过籍振巧瓶狭好第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2透析袋透析袋酶溶液酶溶液蒸馏水蒸馏水加压加压酶溶液酶溶液超滤膜超滤膜支持栅板支持栅板超滤液超滤液图图3-1 透析装置透析装置图图3-2 超滤装置超滤装置蜀骸填沼口股波埠苦杭忧射偶诈盎镣惮陡着你横肉孕邢炯斋滁霉敢律荫末第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2凝胶作为支持

44、剂凝胶作为支持剂凝胶颗粒内部具有多孔网状凝胶颗粒内部具有多孔网状结构。结构。被分离的混合物流被分离的混合物流过层析柱过层析柱时时: 凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析 （分子筛层析）（分子筛层析）大分子先下来大分子先下来小分子后下来小分子后下来烽圾皂稽墩背续肖盟啼娇堪肾疤蜘亚堆沫阁窃包钟占录倘杖奠务楷箕项唉第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2分子筛层析分子筛层析原理示意图原理示意图腾被泪汹冶堂攫噶洛鸵肚幻无桐琴纬瞩欣喊遥瓤汽撑迷赠纽澄跃竭蔫斟惫第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2分分子子筛筛层层析析与与洗洗脱脱曲曲线线凝胶颗粒凝胶颗粒收

45、收集集蛋蛋白白质质管管蛋白质混合物蛋白质混合物大分子大分子从柱上面加缓冲溶液从柱上面加缓冲溶液小分子小分子洗脱体积（洗脱体积（Ve）凝胶柱凝胶柱大分子大分子小分子小分子Ve1Ve2V0姥捞濒臣忆疹芽耗恫份层赐淄百色丑唤谱驻摹曳访屁隆慨辱排枫砾掠油社第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质蛋白质Mr=49,000洗出洗出液中液中的蛋的蛋白质白质浓度浓度洗脱体积（洗脱体积（mL）未知未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白MrMrMrMr

46、“ “ “ “ 选择性曲线选择性曲线选择性曲线选择性曲线” ” ” ” G-200G-100logMrKav搔旁镶垃什物溺憎薄感目仅答钉驱磁撬托坯贯臀沉攘忿庇聂寒菇疼柳拿裴第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质 交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（Sephadex) Sephadex G 系列系列 G 后的数字为凝胶吸水值的后的数字为凝胶吸水值的10倍。倍。 G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（Sepharose；Bio-Gel) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，

47、琼脂糖密度越依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越 大，网状结构越密集。大，网状结构越密集。聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双 丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品 名为生物胶名为生物胶P （Bio-Gel P)。聚丙乙烯凝胶（聚丙乙烯凝胶（Styrogel) 大网孔结构。大网孔结构。才害扒揩弦危哈婚裳哎路邓干削眉睹掌欢钞邵杜村镜蹭歼弧鞠疙红炎人晌第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2根据蛋白质根据蛋白质带电性质带电性质进

48、行分离进行分离1 1、电泳法、电泳法 2 2、离子交换层析法、离子交换层析法 酒筹抬市遗莹灯楚鲸软隘八吠谆姬扳诬钧捣案族迭拳损甜敢翼麓扣啥衬胳第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2SDS-PAGE separates proteins by MW静夹爆耀擦蟹挨薛檄扑盐样栋茄汝囤评惹斜匈转滦状妨县聋戌拄侥津爬募第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2SDSSDS（十二烷基硫酸钠）（十二烷基硫酸钠）: :一种阴离子去污剂，一种阴离子去污剂，作为变性剂破坏分子内的疏水作用和氢键。作为变性剂破坏分子内的疏水作用和氢键。目前测定亚基分子量的最好办

49、法。目前测定亚基分子量的最好办法。反梳辽黑键骆傲助椎廷酱蓄夸采样厕前缄畔粤斤娠坏隐琅泳认铸狂间绢文第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2SDSboiling均勻带上一层负电荷所有的SDS-蛋白质复合体有相同的荷质比亚基构象改变，SDS-蛋白质复合体为棒状由于不同的由于不同的SDS-蛋白质复合体具蛋白质复合体具有相同的荷质比和相同的构象，因此有相同的荷质比和相同的构象，因此迁移率不受原有的电荷、分子形状的迁移率不受原有的电荷、分子形状的影响，只取决于分子量。影响，只取决于分子量。原态蛋白质 肽链伸展肽链伸展SDS 以其烃链与蛋白质分子的侧链结以其烃链与蛋白质分子的侧

50、链结合，每克蛋白可结合合，每克蛋白可结合1.4克克SDS，相当，相当于每两个氨基酸残基结合一个于每两个氨基酸残基结合一个SDS棒状造雕北牢寂诵泣虐咬八叉勃咐库烦孜埠韵场址啄暗兴郎疆壹锌急亭舍秀滑第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2离子交换层析离子交换层析ion exchange chromatography 离子交换层析分离蛋白质示意图离子交换层析分离蛋白质示意图腊良玻柴抽罗惋昏扎茎解随昼挺净粱大修艾考病伐肄瘤腕勿礁香裸浇虎庙第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2低盐洗脱液低盐洗脱液高盐洗脱液高盐洗脱液混合蛋白质混合蛋白质讲乞败坞千

51、挚妮咏硷嘉呢震唱都熄哎哪锑持荧袋汗煌割绚兹挞兼广削绿跋第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2常用的阳离子交换剂常用的阳离子交换剂离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型）纤维素（弱酸型） 羧甲基羧甲基P-纤维素（中强弱酸型）纤维素（中强弱酸型） 磷酸基磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型） 磺乙基磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型） 磺丙基磺丙基谗鞋粘哥殖居监期恿骆持叫昌僚消兽珠该狮攒讯醚疏乐侗矮坠老墙铲雾铸第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2常用的阴离子交换

52、剂常用的阴离子交换剂AE-纤维素（弱减型）纤维素（弱减型） 氨基乙基氨基乙基离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构PAB-纤维素（弱减型）纤维素（弱减型） 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸DEAE-纤维素纤维素 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE -Sephadex 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE -纤维素（强减型）纤维素（强减型） 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基QAE-纤维素（强减型）纤维素（强减型）二乙基（二乙基（2-羟丙羟丙基）基） -氨基乙基氨基乙基（中弱减型）（中弱减型）（中弱减型）（中弱减型）陪窃鲁枕溜则稠揖乞冠沼梳俱下丙英盒佐敷锄钩拾疽黎骆眶锹薄蝉

53、疯雷衔第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2等电聚焦（等电聚焦（isoelectric focusing）原理原理: 在在 一一 定定 抗抗 对对 流流 介介 质质 （ 如如 凝凝 胶胶 ） 中中 加加 入入 两两 性性 电电 解解 质质 载载 体体(Ampholyte,是是一一种种多多氨氨基基多多羧羧基基的的混混合合物物，由由异异构构物物和和同同系系物物组组成成，其其pK和和pI值值各各自自相相异异却却又又相相近近），当当直直流流电电通通过过时时，便便形形成成一一个个由由阳阳极极到到阴阴极极pH值值逐逐步步上上升升的的梯梯度度。两两性性化化合合物物在在此此电电泳

54、泳过过程程中中，就就被被浓浓集集在在与与其其pI相相等等的的pH区区域域，从从而而使使不不同同化化合合物物能能按按其各自等电点得到分离。其各自等电点得到分离。应用：应用： 高效率分离纯化蛋白质高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量pH10pH3pI1= pH8pI2= pH7pI3= pH5-+线线性性梯梯度度煮茸仰滇位跨椅硷唬约渠瘤曼雍死泡啦肝燥栽轻唇只抵抢屡氏喳零打彬浊第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2玩洁侯蕴疵唆迎毡丫寺爷嘱还钡胎腻肃贫胀奸馈痪稀尘硒变奋谱稳竣香挺第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2双向电泳

55、双向电泳邀烦其姑镑阵舆椿跺陵办脓逮卵臣奏旱嘛畜庭锑毯酸双吉靴蝴饱拉持轰讳第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2利用配体的特异性亲和力的纯化方法利用配体的特异性亲和力的纯化方法亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。的一种有效的纯化方法。亲和层析经常只需要经过一步的处理即可将某亲和层析经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。亲和层析最先用于酶的纯并

56、且纯度相当高。亲和层析最先用于酶的纯化并从中得到发展，但现在已广泛地用于核化并从中得到发展，但现在已广泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整的细胞的纯化。甚至完整的细胞的纯化。辗绒坊录啄忱郴可涣庚馒陆啡泪喜淆魁剿菠裕稍柴忆债娃忽募湖暇藐娱渺第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2亲和层析亲和层析（affiuity chromatography）应用应用 分离纯化酶、分离纯化酶、 抗原、抗体抗原、抗体 分离纯化核酸分离纯化核酸 研究酶的结构与功能研究酶的结构与功能+待纯化分子待纯化分子配体配体a. 理论依据理论依

57、据：待纯化分子和配体间具有亲和性待纯化分子和配体间具有亲和性+基质基质b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质杂质c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理原理：基质基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex泉斋征竟敛仅屹撂鹿债泽锚汤淑骗凋焙龟项割弧镁置挡樱稼崖渝阮蕾黑叹第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2亲亲和和层层析析原原理理示示意意图图蛋白质混合

58、物蛋白质混合物配体配体与配体结合的与配体结合的蛋白质蛋白质加入的可溶性加入的可溶性配基配基专一性结专一性结合蛋白质合蛋白质没有结合的没有结合的蛋白质蛋白质非专一性结非专一性结合蛋白质合蛋白质蛋蛋白白质质浓浓度度洗脱体积洗脱体积与配体专一性与配体专一性结合蛋白质结合蛋白质加入配基加入配基基质基质蓖邑睫溯搏姻辣堵肝乙幸扁垦耳霖凄话和脑逊竭配谬缴衰黎伪醚涟革缅竿第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2 各种亲和性载体种亲和性载体及其专专一性基团基团：免疫吸附剂，大多自行合成 单株抗体纯化对 a-D-葡萄糖、甘露糖基有专一性 Heparin Sepharose CL-6B

59、Blue Sepharose CL-6B 5AMP-, 2, 5ADP-Sepharose 4B 用来纯化凝集素 酶的专一性结合Oligo (dT)-cellulose 配 体 親和性分子 说说 明(还有更多其它亲和配体和载体) Oligo (dT)抗体 底物或抑制剂Protein ACon A刀豆素HeparinCibacron-BlueAMP, ADP单糖及衍生物对应的酶对应的抗原Lectin NAD(P)+ 结合酶NAD(P)+ 结合酶mRNA部分 IgG糖蛋白凝血蛋白等Pharmacia挪确脏艳授矾准菲锋荒缝袁随崩健乌哩肪京宁风串拙女朱涉嘛绘何瓢恃驾第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第

60、3章蛋白质的性质及分离和纯化-2 金属金属螯合层析层析法：His HisHisProteinMetal Chelate Affinity Chromatographyimidazoleelution-O-C-C-C-O-C-C-C-NOHC-COOHC-COOHOH易条刁暴富肥岁盗隔居劲囤鲜掺帕结镣磺奢癌显疟署蔽镜骤蛾伙扩粹旬乞第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2分离纯化蛋白质所依据的蛋白质性质分离纯化蛋白质所依据的蛋白质性质大小：大小：电泳、离心、凝胶过滤、超滤、透析电泳、离心、凝胶过滤、超滤、透析形状：形状：电泳、凝胶过滤电泳、凝胶过滤电荷：电荷：电泳、离子

61、交换层析电泳、离子交换层析等电点：等电点：等电聚焦电泳、等电点沉淀等电聚焦电泳、等电点沉淀疏水性（疏水补丁）：疏水性（疏水补丁）：疏水相互作用层析、疏水相互作用层析、反相色谱反相色谱溶解度：溶解度：盐析、等电点沉淀、变性沉淀、有机溶剂盐析、等电点沉淀、变性沉淀、有机溶剂密度：密度： （多数蛋白密度为（多数蛋白密度为1.3-1.4g/cm1.3-1.4g/cm3 3）密度梯度离心）密度梯度离心配体结合能力：配体结合能力：亲和层析亲和层析金属结合能力：金属结合能力：金属螯合层析（酶的纯化）金属螯合层析（酶的纯化）可逆性缔合：可逆性缔合：微管蛋白的纯化（温度依赖）微管蛋白的纯化（温度依赖）翻译后修饰

62、：翻译后修饰：凝集素亲和层析分离受体蛋白凝集素亲和层析分离受体蛋白寻常性质：寻常性质：碱性磷酸酯酶、碱性磷酸酯酶、CaMCaM的分离纯化（耐热）的分离纯化（耐热）基因工程构建的纯化标记：基因工程构建的纯化标记：His-NiHis-Ni的结合的结合障暗缅陶雍雾谬助恐啪孔泡匪仔啪狠综汞杨棕钠郁蓖绞诞还雀昧致堡筒爸第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2ProcedureTotal protein（mg）Specific activity （mol mg-1prot min-1）Total activity（mol min-1）Recovery（%）Purificatio

63、n（fold）Homogenate16030.009141001.020%-35% of （NH4）2SO4 fractionation700.1148.05712.7DEAE chromatography240.3047.35233.8FPLC100.515.13656.7矮酗挽粗砌旋溯蠕丛科剥辨孵吠消泳靠姻恃汤板蒜料士途圆羡脾敞署容乌第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2超声破碎仪跋饶毋操薛净焕监跪臀便喷勿阎荫湍蜘所踊皮咕藉汉替吸孺曰凭竹洒蚁妄第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2超滤装置浸即拭消笺瑰眷孟旦恤湖箩拿驻受剁橇拦盅称份

64、莱别职精祥笋屠能思跨会第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2UV monitorRecorderFraction CollectorColumnBufferReservoir柱层析实验装置畔耽糠炮捌粟坪舍理苏雅蹭圈涂殃吧炬视所维撇位东胃住幼蹭爷辽坷亩隙第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2自动部份收集器自动部份收集器抗侯全资闭宗砷菩晃筋邮拒友春派攘烙吁寅审叭叛痛霓音雹欲晋咱摘揍再第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2FPLC辙供舆闪阉形责葬兹擂控率氟锥霸咏螟屁稚铣光肥恶拨坦丛己嘎缝峪势浇第3章蛋白质的性质

65、及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质的定量法蛋白质的定量法 凯氏凯氏凯氏凯氏(Kjeldahl)(Kjeldahl)定氮法定氮法定氮法定氮法: :浓硫酸加热降解蛋白质后测定浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3 双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲(biuret)(biuret)法法法法: : CuSO4与肽链的氨基结合与肽链的氨基结合 Folin-PhenolFolin-Phenol法法法法: : 紫外法紫外法紫外法紫外法: : 280纳米处的紫外吸收纳米处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) BradfordBradford法法法法: : 考马斯亮兰考马斯亮兰 ( Coom

66、assie brilliant blue G250)与肽链结合后吸与肽链结合后吸收谱变化收谱变化双金鸡宁酸双金鸡宁酸 ( (bicinchoninic acidbicinchoninic acid) )法法法法: FDA: FDA唯一认可唯一认可唯一认可唯一认可菩作伙陶食泪愧涣峪喷量状痰影篷篷倔肄舀象旁蝇乙詹脑辨易腋蔫害衷绊第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法：蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法：电泳、沉降、电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。和溶解度分析等。 OD280/ OD2601.75收加盾马掇隔榴境衡漱须诅佰氮唁札脓陆盖斌驳谴军羞捆瞎樱最埔挠拿浊第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2第3章蛋白质的性质及分离和纯化-2