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1、实验一生物信息数据库及生物信息分析软件应用现代分子生物学大实验现代分子生物学大实验现代分子生物学大实验现代分子生物学大实验实验目的掌握生物信息学基本概念、原理及方掌握生物信息学基本概念、原理及方法法应用生物信息学的一些工具进行初步应用生物信息学的一些工具进行初步的生物信息分析的生物信息分析运用运用Primer Primier 5Primer Primier 5进行引物设计进行引物设计实验主要内容分子生物学数据库：掌握数据库的种类、分子生物学数据库：掌握数据库的种类、功能，文献查找方法功能，文献查找方法相似序列的数据库搜索：掌握相似序列的数据库搜索：掌握NCBINCBI中几种中几种基本局部序列比
2、对方法及几种单机软件的基本局部序列比对方法及几种单机软件的使用方法（使用方法（BlastnBlastn；BlastpBlastp；BlastxBlastx；tBlastntBlastn）。）。生物信息学单机软件介绍：生物信息学单机软件介绍：Primer Primier 5Primer Primier 5欧洲分子生物学实验室欧洲分子生物学实验室EMBL( European Molecular Biology Laboratory ) EMBL( European Molecular Biology Laboratory ) 美国生物技术信息中心美国生物技术信息中心NCBI (National C
3、enter for Biotechnology Information NCBI (National Center for Biotechnology Information ) )日本遗传研究所日本遗传研究所DDBJ (DNA Data Bank of Japan ) DDBJ (DNA Data Bank of Japan ) 国际权威数据库国际权威数据库蛋白质数据库蛋白质数据库 SWISS-PROT TrEMBL (translation of EMBL) PIR (Promoter information resource) PRF （Promoter research foundat
4、ion） PDBSTR （Re-organized Protein data Bank）Prosite 结构数据库结构数据库 PDB (Protein Data Bank) NDB (Nucleic Acid Database) DNA-bind Protein databaseswiss-3D IMAGE酶和代谢数据库酶和代谢数据库KEGG （Kyoto Eneyclopedin of genes & genemes） PKR (Protein Kinase Resource) 文献数据库文献数据库PubMed OMIM Agricola常用数据库孟德尔人类遗传（OMIM），三维蛋白质结构的
5、分子模型数据库（MMDB），唯一人类基因序列集合（UniGene），人类基因组基因图谱，分类学浏览器，同国立癌症研究所合作的癌症基因组剖析计划（CGAP）。Entrez是NCBI的为用户提供整合的访问序列，定位，分类和结构数据的搜索和检索系统。Entrez同时也提供序列和染色体图谱的图形视图。Entrez是一个用以整合NCBI数据库中信息的搜寻和检索工具。这些数据库包括核酸序列，蛋白序列，大分子结构，全基因组，和通过PubMed检索的MEDLINE。Entrez的一个强大和独特的特点是检索相关的序列，结构和参考文献的能力。杂志文献通过PubMed获得，PubMed是一个网络搜索界面，可以提供对
6、在MEDLINE上的九百万杂志引用的访问，包含了链接到参与的出版商网络站点的全文文章。 BLAST是一个NCBI开发的序列相似搜索程序，还可作为鉴别基因和遗传特点的手段。BLAST能够在小于15秒的时间内对整个DNA数据库执行序列搜索。NCBI提供的附加的软件工具有：开放阅读框寻觅器（ORF Finder），电子PCR，和序列提交工具，Sequin和BankIt。所有的NCBI数据库和软件工具可以从WWW或FTP来获得。NCBI还有E-mail服务器，提供用文本搜索或序列相似搜索访问数据库一种可选方法。NCBI相关介绍核苷酸数据库核苷酸数据库dbESTdbEST EST来源于mRNA基因长度（
7、300-400bp，数据长度足以分析编码的产物）或者全基因（已知）5端或3端的cDNA序列（EST）300-400bp single-pass sequence （可能有误，如果要求2kb）dbSNPdbSNP 每100-300bp有一个SNPEPD EPD （Eukaryotic Promoter DatabaseEukaryotic Promoter Database） 启动子数据库文献数据库文献数据库序列相关检索操作序列相关检索操作序列查询序列查询登录号（如登录号（如X58929X58929）序列名称（如序列名称（如SCARGCSCARGC）核酸同源性搜索核酸同源性搜索 BLASTBLA
8、ST分析分析浏览整个基因组浏览整个基因组直观显示各染色体，可以在染色体水平直观显示各染色体，可以在染色体水平上选择感兴趣的位点，逐层放大上选择感兴趣的位点，逐层放大 浏览染色体浏览染色体 浏览染色体浏览染色体 浏览染色体浏览染色体Blastp：氨基酸序列检索蛋白质库 将待查询的蛋白质序列及其互补序列一起对蛋白质序列数据库进行查询；(Search a nucleotidenucleotide database using a nucleotidenucleotide query)Blastn：核苷酸序列检索核苷酸库 将待查询的核酸序列及其互补序列一起对核酸序列数据库进行查询；(Search a
9、nucleotidenucleotide database using a nucleotidenucleotide query)Blastx：核苷酸序列氨基酸序列蛋白质库 先将待查询的核酸序列按6种可读框架(逐个向前3个碱基和逐个向后3个碱基读码)翻译成蛋白质序列，然后将翻译结果对蛋白质序列数据库进行查询；(Search proteinprotein database using a translated translated nucleotidenucleotide query )tBlastn 先将核酸序列数据库中的核酸序列按6种可读框架翻译成蛋白质序列，然后将待查询的蛋白质序列及其互补
10、序列对其翻译结果进行查询；(Search translated nucleotidetranslated nucleotide database using a proteinprotein query )tBlastx 先将待查询的核酸序列和核酸序列数据库中的核酸序列按6种可读框架翻译成蛋白质序列，然后再将2种翻译结果从蛋白质水平进行查询。(Search translated nucleotidetranslated nucleotide database using a translated translated nucleotidenucleotide query )同源性搜索同源性搜索
11、（Basic Local Alignment Search Tool ）序列特征注释Annotation by sequence featuresSubcellular LocalizationNone Signal peptideNone obvioustransmembraneregionMotifsDomainsPfamInterProCoiled Coil RegionsSTRUCTURECan not find data in PDBPredicted in GTD多序列比对Multiple sequence alignment analysisClustalW, view as J
12、alView引物设计 primer primer 5 软件引物设计的一般步骤序列查询单基因序列多基因序列引物设计引物确定引物的设计原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配) 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbo
13、r method)。Tm值：50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度 引物的设计原则引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。引物的设计原则引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰
14、位点或标记物。对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。引物的设计原则primer primer 5 软件的使用primer primer 5 软件的使用primer primer 5 软件的使用primer primer 5 软件的使用primer primer 5 软件的使用primer primer 5 软件的使用primer primer 5 软件的使用作业按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验材料、实验用品及药品、实验步原理、实验材料、实验用品及药品、实验步骤、实验结果。骤、实验结果。网上查找拟南芥、水稻网上查找拟南芥、水稻FER/PIP/MDAR基因基因序列序列基因序列进行比对基因序列进行比对设计设计FER/PIP/MDAR基因引物基因引物Thank you for your attention!
