《年研究生高级生化技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《年研究生高级生化技术（17页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、高级生化技术高级生化技术中山医学院中山医学院中山医学院中山医学院生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室钱艳钱艳Email：实验一实验一 基因组基因组DNADNA的制备的制备基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA的提取通常用于构建基因组文的提取通常用于构建基因组文的提取通常用于构建基因组文的提取通常用于构建基因组文库、库、库、库、SouthernSouthernSouthernSouthern杂交及杂交及杂交及杂交及PCRPCRPCRPCR分离基因等。分离基因等。分离基因等。分离基因等。 基因组基因组DNA的提取与纯化的
2、提取与纯化核酸分离纯化的总原则：核酸分离纯化的总原则： 保证核酸一级结构完整保证核酸一级结构完整保证核酸一级结构完整保证核酸一级结构完整 排除其他分子的污染（蛋白质、脂排除其他分子的污染（蛋白质、脂排除其他分子的污染（蛋白质、脂排除其他分子的污染（蛋白质、脂 类、糖、有机熔剂、金属离子、外源类、糖、有机熔剂、金属离子、外源类、糖、有机熔剂、金属离子、外源类、糖、有机熔剂、金属离子、外源DNADNADNADNA、 RNA RNA RNA RNA等）等）等）等） 核酸提取的主要步骤核酸提取的主要步骤主要包括：破碎细胞，去除与核酸结合的主要包括：破碎细胞，去除与核酸结合的主要包括：破碎细胞，去除与核
3、酸结合的主要包括：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂不需要的核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂不需要的核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂不需要的核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。质，纯化核酸等。质，纯化核酸等。质，纯化核酸等。核酸提取注意事项核酸提取注意事项减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱）减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱）减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱）减少化学因素对核酸的降解（
4、如过量酸碱）减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力：减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力：减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力：减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融；高强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融；高强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融；高强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融；高温等）温等）温等）温等）防止核酸的生物降解（核酸酶的预防）防止核酸的生物降解（核酸酶的预防）防止核酸的生物降解（核酸酶的预防）防止核酸的生物降解（核酸酶的预防） 人基因组人基因组DNA的制备的制备n 实验目的及意义实验目的及意义实验目的及意义实验目的及意义1.1.从人口腔上皮细胞中提
5、取纯的基因组从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNADNA2.2.掌握基因组掌握基因组掌握基因组掌握基因组DNADNA抽提的方法，理解核酸分抽提的方法，理解核酸分抽提的方法，理解核酸分抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理离纯化的基本原理离纯化的基本原理离纯化的基本原理 基因组基因组基因组基因组DNADNA提取原理提取原理提取原理提取原理 利用基因组利用基因组DNADNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子小分子DNADNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分离。加入一定量的异丙醇或
6、乙醇，基因组的大分子分子DNADNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子取出，而小分子DNADNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。从而达到提取的目的。 分离纯化基因组分离纯化基因组分离纯化基因组分离纯化基因组DNADNA的方法有很多种的方法有很多种的方法有很多种的方法有很多种： 不不不不同同同同生生生生物物物物（植植植植物物物物、动动动动物物物物、微微微微生生生生物物物物）的的的的基基基基因因因因组组组组DNADNA的的的的提提提提取取取取方方方方法法法法有有有有所所所所不
7、不不不同同同同，分分分分离离离离方方方方法法法法也也也也有有有有差差差差异异异异。但但但但原原原原理理理理相相相相似似似似，因因因因此此此此它们有共同的步骤它们有共同的步骤它们有共同的步骤它们有共同的步骤： 裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞：SDSSDS裂解细胞，裂解细胞，裂解细胞，裂解细胞，EDTAEDTA抑制核酸酶抑制核酸酶抑制核酸酶抑制核酸酶 除去蛋白质除去蛋白质除去蛋白质除去蛋白质：蛋白酶：蛋白酶：蛋白酶：蛋白酶K K K K水解蛋白质，酚和氯仿水解蛋白质，酚和氯仿水解蛋白质，酚和氯仿水解蛋白质，酚和氯仿/ / / /异戊醇异戊醇异戊醇异戊醇 抽提、分离蛋白质；抽提、分离蛋白质；抽提、
8、分离蛋白质；抽提、分离蛋白质； 析出析出析出析出DNADNADNADNA：乙醇沉淀使：乙醇沉淀使：乙醇沉淀使：乙醇沉淀使DNADNADNADNA从溶液中析出。从溶液中析出。从溶液中析出。从溶液中析出。 n实验材料及试剂实验材料及试剂实验材料及试剂实验材料及试剂 材料：材料：材料：材料：人口腔上皮细胞人口腔上皮细胞人口腔上皮细胞人口腔上皮细胞 试剂：试剂：试剂：试剂：抽提缓冲液：抽提缓冲液：抽提缓冲液：抽提缓冲液：Tris-ClTris-ClpH8.0pH8.0，EDTAEDTA，NaClNaCl， RNAaseRNAaseSDSSDS，蛋白酶，蛋白酶，蛋白酶，蛋白酶KK，饱和酚饱和酚饱和酚饱和
9、酚氯仿氯仿氯仿氯仿/ /异戊醇（异戊醇（异戊醇（异戊醇（24:124:1）75%75%及及及及95%95%乙醇乙醇乙醇乙醇TETE缓冲液：缓冲液：缓冲液：缓冲液：TrisTris，EDTAEDTA主要试剂的功能主要试剂的功能抽提缓冲液抽提缓冲液：由由SDS、EDTA、蛋白酶蛋白酶K组成组成.wSDS的作用是裂解细胞的作用是裂解细胞.wEDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止防止DNA酶对酶对DNA分子的降解作用。分子的降解作用。w蛋白酶蛋白酶K的作用是水解蛋白质。的作用是水解蛋白质。酚和氯仿酚和氯仿/ /异戊醇异戊醇：抽提分离蛋白质：抽提分离蛋白质乙醇乙醇：沉
10、淀：沉淀DNATE：溶解：溶解DNA取材取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水用生理盐水漱口后，口含生理盐水1015ml约约23min，用，用15ml离心管（离心管（4000rpm 10min）收集细胞沉淀）收集细胞沉淀（台式离心机的使用，平衡）（台式离心机的使用，平衡）加入加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至，转移至1.5mlEP管管（微量移液器的正确使用）（微量移液器的正确使用）混匀，混匀，65温育温育15min加入等体积的加入等体积的500ul饱和酚饱和酚(0.5ml)，充分颠倒混匀，充分颠倒混匀（不要震荡！）（不要震荡！）P13P13实验步骤及注意事项（一人一组
11、）：实验步骤及注意事项（一人一组）： 10000rpm 5min，上层水相，上层水相300ul转移至转移至新的新的EP管管（高速离心机的使用与安全意识）（高速离心机的使用与安全意识）加入加入300ul氯仿氯仿/异戊醇，颠倒混匀异戊醇，颠倒混匀10000rpm 5min，上层水相，上层水相300ul转移到转移到新的新的EP管管加入加入2倍体积倍体积600ul95%的乙醇，颠倒混匀的乙醇，颠倒混匀10000rpm 10min弃上清，沉淀中加入弃上清，沉淀中加入800ul75%乙醇乙醇10000rpm 2min轻轻弃去上清，打开轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置盖，室温静置23min加入加入40 lTE溶液后溶液后4保存保存实验结果及其分析实验结果及其分析实验结果及其分析实验结果及其分析 定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳 定量分析：紫外分光光度法测定DNA溶液 的浓度 常见问题：常见问题： 1、提取的DNA不纯： 变性不充分；关键过程反应时间过短； 离心时间或速度不够。 2、提取的DNA成涂布状： 操作过程中用力过猛，动作粗暴； 操作系统有污染。 3、与细胞器DNA分离不全； 变性过程不完全； 试剂配置问题。
