《柱色谱分离实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《柱色谱分离实验（39页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、柱柱 色色 谱Column Chromatography了了 解：解： 1. 1. 柱色谱法别离有机物柱色谱法别离有机物的原理。的原理。 2 2固定相和流动相的选固定相和流动相的选择原那么。择原那么。掌掌 握：握： 1. 1. 色谱柱的填充方法。色谱柱的填充方法。 2 2柱色谱别离的根本操柱色谱别离的根本操作。作。一、一、实 验 目目 的的色色 谱 法法 简 介介 色谱法亦称色层法，层析法等，是别离，纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一，还可定量分析。 色色谱谱法法分分类类固定相、流固定相、流动相的物理相的物理状状态操作形式操作形式分离原理分离原理液液固色谱法固色谱法气气固色谱法固色谱法气气液色
2、谱法液色谱法液液液色谱法液色谱法柱色谱法（柱色谱法（column chromatography）薄层色谱法（薄层色谱法（TLC）纸色谱法（纸色谱法（paper chromatographypaper chromatography）气相色谱（气相色谱（GCGC）高效液相色谱（高效液相色谱（HPLCHPLC）吸附色谱法吸附色谱法分配色谱法分配色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法排阻色谱排阻色谱操作形式操作形式柱色谱法柱色谱法column chromatographycolumn chromatography二、二、实 验 原原 理理柱色谱别离示意图柱色谱别离示意图混合物混合物吸附吸附剂( (固定相固
3、定相) )洗洗脱脱剂( (流流动相相) )二、二、实 验 原原 理理二、二、实 验 原原 理理吸附剂的性质：均匀、吸附剂的性质：均匀、外表积大、不反响、外表积大、不反响、吸附能力不同吸附能力不同化合物的结构：化合物的结构：化合化合物的吸附性和它们的物的吸附性和它们的极性成正比极性成正比洗脱剂的极性：溶解洗脱剂的极性：溶解度适中、不反响、易度适中、不反响、易获取回收获取回收影响别离效果主要因素影响别离效果主要因素和和在氧化铝柱子上假设别离以下各组混合物，哪一个组分先被洗脱下来？三、三、实 验 内内 容容装柱装柱加样加样洗脱洗脱收集收集鉴定鉴定干法：干法：10g 硅胶硅胶 +乙醇乙醇先用乙醇先用乙
4、醇 后用水后用水操作操作组分颜色组分颜色组分颜色组分颜色1mL样品样品加样操作加样操作0.5mL2乙醇洗涤乙醇洗涤 柱色谱操作柱色谱操作：实实 验验 步步 骤骤: : 吸附剂装填紧密，排除吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面，无断层。端平整，无凹凸面，无断层。u 干法装柱干法装柱u 湿法装柱湿法装柱装装 柱柱三、三、实 验 内内 容容装柱时应该注意均匀，不能有气泡，裂缝，否那么样品可能顺缝隙流动而不吸附，影响样品的别离，应用质软的物体如吸耳球等轻轻敲击柱身，促使吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面 样品为液体，可直接加样；
5、样品为固体，可选择适宜溶剂溶解为液体再加样。加样时，要沿管壁慢慢参加至柱顶部，勿使样品搅动吸附剂外表。 加加 样样三、三、实 验 内内 容容洗洗 脱脱 在柱顶不断参加洗脱剂，使洗脱剂永远保持有适当的量，不要让洗脱剂外表流干，使流动相流速适当。三、三、实 验 内内 容容洗脱时应注意：1向柱内参加95%乙醇溶液洗脱可以通过注射器沿管壁或安装滴液漏斗在恒压或加压条件下进行洗脱。控制流出速度1滴/秒。逐渐出现色层带别离。2第一色层带到达色谱柱底部时，立即用锥形瓶收集第一色层的溶液，直到其完全被洗出。【注意】洗脱时切勿使溶剂流干！3然后，改用水溶液作为洗脱剂，当第二色层带到达色谱柱底部时，立即收集第二色
6、层的的溶液，直到其完全被洗出。4用量筒分别量取所别离出来的两种溶液的体积后，倒入指定的回收瓶中。5别离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从活塞 向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里。 试样有色试样有色，在层析柱上可直接观察。洗脱后，在层析柱上可直接观察。洗脱后分别收集各个组分。分别收集各个组分。收收 集集 试样无色，收集洗脱液时，多采用等份收试样无色，收集洗脱液时，多采用等份收集，每份洗脱剂的体积随所用吸附剂的量及试样集，每份洗脱剂的体积随所用吸附剂的量及试样的别离情况而定。收集的每份洗脱剂的体积越小，的别离情况而定。收集的每份洗脱剂的体积越小，别离效果
7、越好。别离效果越好。三、三、实 验 内内 容容三、三、实 验 内内 容容鉴鉴 定定 试样有色试样有色依据颜色直接鉴定依据颜色直接鉴定 试样无色试样无色可结合薄层色谱结果可结合薄层色谱结果l 玻砂防堵塞l 装柱需紧密 l 加压不可大l 溶剂勿流干四、注四、注 意意 事事 项色谱法在有机化学中的应用:别离混合物精制提纯化合物利用比移值(Rf)鉴定化合物跟踪反响进程小小 结色谱法的特点:别离效率高 复杂混合物,同系物,异构体等。灵敏度高 可以检测出g g-1(10-6)级甚至ng g-1(10-9) 级的物质量。分析速度快 几分钟或几十分钟内可以完成一个试样分析。 小小 结柱色柱色谱法法别离甲基橙和
8、甲基离甲基橙和甲基蓝实验原理原理甲基橙和亚甲基蓝均为指示剂,它们的结构式如下所示:甲基橙甲基橙亚甲基蓝由于甲基橙和由于甲基橙和亚甲基甲基蓝的的结构构不同不同, ,极极性不同性不同, ,吸附吸附剂对它它们的吸附能的吸附能力不同力不同, ,洗洗脱脱剂对它它们的解析速度也不同的解析速度也不同, ,极极性小、吸附能力弱、解析速性小、吸附能力弱、解析速度快的度快的亚甲基甲基蓝先被洗先被洗脱脱下下来来，而，而极极性大、吸附能力强、解析速度慢性大、吸附能力强、解析速度慢的甲基橙后被洗的甲基橙后被洗脱脱下下来来，从从而使而使两种两种物物质得以得以别离。本离。本实验以硅以硅胶胶为吸附吸附剂，95%95%乙醇作乙
9、醇作为洗洗脱脱剂，先洗出，先洗出亚甲基甲基蓝，再用蒸，再用蒸馏水作洗水作洗脱脱剂把甲基橙洗把甲基橙洗脱脱下下来来。三、三、实 验 内内 容容装柱装柱加样加样洗脱洗脱收集收集鉴定鉴定干法：干法：10g 硅胶硅胶 +乙醇乙醇先用乙醇先用乙醇 后用水后用水操作操作组分颜色组分颜色组分颜色组分颜色1mL样品样品加样操作加样操作0.5mL2乙醇洗涤乙醇洗涤 柱色谱操作柱色谱操作：实实 验验 步步 骤骤: :仪器和试剂仪器和试剂l锥形瓶、玻璃漏斗、色谱柱l 柱层析硅胶、脱脂棉、乙醇95%甲 l 基橙、亚甲基蓝。lH2O95%乙醇=11(A液)l0.2molL-1HCl95%乙醇=11(B液)装置装置图装柱
10、装柱洗洗脱脱实验步骤实验步骤l装柱：装柱：l1 1、装色谱柱：、装色谱柱：l1 1取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花将色谱柱垂取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花将色谱柱垂 l 直固定在铁架台上。直固定在铁架台上。l (2) (2) 关闭活塞，向柱中倒入蒸馏水也是洗脱剂，至柱体积的关闭活塞，向柱中倒入蒸馏水也是洗脱剂，至柱体积的 l 1/2 1/2 l3 3填吸附剂：称取填吸附剂：称取10g10g硅胶于小烧杯中硅胶于小烧杯中, ,参加参加15mL15mL蒸馏水蒸馏水, ,用玻用玻 l 璃棒调好通过漏斗慢慢装入玻璃柱璃棒调好通过漏斗慢慢装入玻璃柱, , 使其逐渐沉入底使其逐渐沉
11、入底 l 部。用洗耳球敲打柱身使硅胶装填紧密，翻开活塞，用小锥型部。用洗耳球敲打柱身使硅胶装填紧密，翻开活塞，用小锥型 l 瓶承接瓶承接, , 控制滴速为控制滴速为1 1 滴秒滴秒, ,装完后在上面加一层脱脂棉装完后在上面加一层脱脂棉 l ，操作时要注意吸附剂始终不能露出液面。，操作时要注意吸附剂始终不能露出液面。实验步骤续实验步骤续l加样：当液面刚好流至脱脂棉平面相切时，立刻关闭活塞，参加5mL左右的A液,当硅胶面又将要露出时,关紧活塞,用量筒准确参加0.50mL以A液做溶剂的混合液(含甲基橙和亚甲基蓝各为0.400gL-1)。l 洗脱：待此混合液将要渗入柱内时,立即用A液洗脱,此时可以观察到有鲜明的黄、蓝两条色带形成。黄色的甲基橙色带随洗脱剂的参加不断下移,而其顶部蓝色带不移动,当黄色带到达柱底部时,更换接受器,全部收集此黄色带,洗脱时间约10min。此后改用B液做洗脱剂,这时可看到蓝色带开始下移,当亚甲基蓝色带到达底部时,更换接受器,全部收集此蓝色带,洗脱时间约30min。l
