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1、第七章第七章 核酸化学核酸化学大连大学生命科学与技术学院大连大学生命科学与技术学院吴海歌吴海歌核酸的发现和研究进展核酸的发现和研究进展v18681868年年 F F. .MiescherMiescher从脓菌细胞核中提取从脓菌细胞核中提取“核素核素”，后被称为脱氧核糖核酸，后被称为脱氧核糖核酸(DNA) (DNA) v19441944年年 AveryAvery等人等人证实证实DNADNA是遗传物质是遗传物质v19531953年年 WatsonWatson和和CrickCrick发现发现DNADNA的双螺旋结构的双螺旋结构, ,被誉为生物学和遗传学史上的被誉为生物学和遗传学史上的里程碑。里程碑。
2、v19581958年年 CrickCrick提出了提出了分子生物学中心法则；分子生物学中心法则；v19611961年年 提出提出操纵子学说操纵子学说v19661966年年 NirenbergNirenberg等发现等发现遗传密码遗传密码v19701970年年 TeminTemin和和BaltimoreBaltimore发发现现核酸逆转录酶，核酸逆转录酶，补充了中心法则。补充了中心法则。v19751975，19761976年年 GilbertGilbert和和SangerSanger等等建建立立DNADNA测序技术测序技术v19861986年年 美国启动美国启动人类基因组计划人类基因组计划( (
3、HGPHGP) ) v19991999年年 中国加入人类基因组计划，承担中国加入人类基因组计划，承担1%1%的测序任务的测序任务v目前目前 完成人类基因组计划全部测序工作，已进入后基因组时代。完成人类基因组计划全部测序工作，已进入后基因组时代。v19941994年年 澳大利亚学者提出澳大利亚学者提出“蛋白质组蛋白质组”。本章主要内容本章主要内容v第一节第一节 核酸的化学组成；核酸的化学组成；v第二节第二节 核酸的一级结构（核酸的一级结构（DNADNA、RNARNA）；）；v第三节第三节 DNADNA的空间结构与功能；的空间结构与功能；v第四节第四节 RNARNA的空间结构与功能；的空间结构与功
4、能；v第五节第五节 核酸的理化性质与应用核酸的理化性质与应用； （形状、大小、（形状、大小、吸光度、变性、复性、吸光度、变性、复性、 分子杂交、分子杂交、核酸酶等）核酸酶等）v第六节第六节 核酸的生物学功能和意义；核酸的生物学功能和意义；v第七节第七节 核酸的分离、合成和鉴定核酸的分离、合成和鉴定第一节第一节 核酸的化学组成核酸的化学组成 pp.478pp.478v核酸核酸(nucleic acid)(nucleic acid) 一种多聚核苷酸一种多聚核苷酸以核苷酸为基本以核苷酸为基本结构结构单单元，通过元，通过3,53,5磷磷酸二酯键连接形成多聚核苷酸链。酸二酯键连接形成多聚核苷酸链。一种一
5、种生物大分子，生物大分子，可可携带和传递遗传信息，携带和传递遗传信息，指导蛋白质生物合成。指导蛋白质生物合成。 核酸的分类及分布核酸的分类及分布(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸分分布布：90%90%以以上上存存在在于于细细胞胞核核中中，其其余余在在核核外外，如如线线粒粒体体，叶叶绿绿体体，质质粒等粒等处处。分布分布：胞核胞核( (10%)10%)、胞液、胞液( (9090%)%)功能：遗传信息的载体，决定细胞功能：遗传信息的载体，决定细胞和生命个体的基因型。和生命个体的基因型。功能：
6、参与功能：参与DNADNA遗传信息表达。遗传信息表达。 病病毒毒RNARNA也可作为遗传信息的载体。也可作为遗传信息的载体。一、一、核酸核酸的化学组成的化学组成 pp.478The Chemical Component of Nucleic Acid1. 核酸组成核酸组成 （1 1）元素组成）元素组成 C、H、O、N、P（910%）（2 2）核酸分子的三大组成成分：）核酸分子的三大组成成分： 碱基碱基(base)(base)： 嘌呤碱，嘧啶碱嘌呤碱，嘧啶碱 戊糖戊糖(ribose)(ribose)：核糖，脱氧核糖：核糖，脱氧核糖 磷酸磷酸(phosphate)(phosphate)核酸的特征元
7、素核酸的特征元素核酸分解产物核酸分解产物 pp.478DNADNA和和RNARNA间的区别主要在于核糖和碱基间的区别主要在于核糖和碱基碱碱 基基 pp.479pp.479嘌呤嘌呤( (purinepurine) ) 腺嘌呤腺嘌呤(adenine,(adenine, A) )6鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine,(guanine, G) )62嘧啶嘧啶(pyrimidine) pp.479pp.479胞嘧啶胞嘧啶(cytosine, C)可出现在可出现在DNADNA和和RNARNA中中24胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine, T)主要出现在主要出现在DNADNA中中245尿嘧啶尿嘧啶(uracil, U
8、)仅出现仅出现在在RNARNA中中24稀有碱基稀有碱基v稀有碱基特点：稀有碱基特点：vA,G,C,U,TA,G,C,U,T的甲基化产物，在的甲基化产物，在核酸合成后，由甲基化酶催化核酸合成后，由甲基化酶催化进行甲基修饰而成。进行甲基修饰而成。v存在量稀少，存在量稀少，tRNAtRNA中含量较多，中含量较多，约约5%5%左右；左右；v细胞中含有一些游离嘌呤衍生细胞中含有一些游离嘌呤衍生物，如：次黄嘌呤、黄嘌呤等。物，如：次黄嘌呤、黄嘌呤等。 v目前已知稀有碱基有近百种。目前已知稀有碱基有近百种。 pp.479次黄嘌呤次黄嘌呤注意：含有酮基的嘌呤或嘧啶均含有酮式和烯注意：含有酮基的嘌呤或嘧啶均含有
9、酮式和烯醇式结构，且处于二者平衡状态。醇式结构，且处于二者平衡状态。核糖和脱氧核糖核糖和脱氧核糖（构成（构成DNADNA）脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)（构成（构成RNARNA）12345核糖核糖(ribose)11112.2.核苷的结构核苷的结构 pp.480pp.480 （1 1）核苷的组成）核苷的组成v碱基碱基 + + 核糖核糖( (脱氧核糖脱氧核糖) )，v通过核糖通过核糖C C1 1位和碱基中的位和碱基中的N N原子相连，形成原子相连，形成N-N-型型糖苷糖苷键键，形成核苷，形成核苷( (脱氧核苷脱氧核苷) )。v核核 苷：苷：AR, GR, UR, CRAR, GR,
10、UR, CRv脱氧核苷：脱氧核苷：dARdAR, , dGRdGR, , dTRdTR, , dCRdCR113.3.核苷酸的结构与命名核苷酸的结构与命名 pp.481pp.481v核苷（脱氧核苷）和核苷（脱氧核苷）和 磷磷 酸以酸以磷酸酯键磷酸酯键连接形成连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。核苷酸（脱氧核苷酸）。v核苷酸：核苷酸： AMP, GMP, UMP, CMPv脱氧核苷酸脱氧核苷酸： dAMP, dGMP, dTMP, dCMPv在在RNARNA分子核糖的环中分子核糖的环中22、33、55位含自由羟基，均可与磷酸结合，形位含自由羟基，均可与磷酸结合，形成成2-2-核苷酸、核苷酸、3-3-核
11、苷酸、核苷酸、5-5-核核苷酸。苷酸。v在在DNADNA分子中均为分子中均为22位脱氧，因此，位脱氧，因此，只有只有33、55位核苷酸。位核苷酸。v生物体内主要存在生物体内主要存在5-5-核苷酸。核苷酸。组成组成DNADNA、RNARNA的核苷酸特点的核苷酸特点核酸核酸核苷酸核苷酸简称简称RNARNA( (核糖核酸核糖核酸) )腺嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸腺苷酸（腺苷酸（AMPAMP）鸟嘌呤核苷酸鸟嘌呤核苷酸鸟苷酸（鸟苷酸（GMPGMP）胞嘧啶核苷酸胞嘧啶核苷酸胞苷酸（胞苷酸（CMPCMP）尿嘧啶核苷酸尿嘧啶核苷酸尿苷酸（尿苷酸（UMPUMP）DNADNA( (脱氧核糖脱氧核糖核酸核酸) )脱氧腺
12、嘌呤核苷酸脱氧腺嘌呤核苷酸脱氧腺苷酸脱氧腺苷酸（d dAMPAMP）脱氧鸟嘌呤核苷酸脱氧鸟嘌呤核苷酸脱氧鸟苷酸脱氧鸟苷酸（d dGMPGMP）脱氧胞嘧啶核苷酸脱氧胞嘧啶核苷酸脱氧胞苷酸脱氧胞苷酸（d dCMPCMP）脱氧胸腺嘧啶核苷酸脱氧胸腺嘧啶核苷酸脱氧胸苷酸脱氧胸苷酸 ( (d dTMPTMP) )二、体内重要的游离核苷酸二、体内重要的游离核苷酸及其衍生物及其衍生物l一一磷酸磷酸或或多磷酸核苷酸：多磷酸核苷酸： NMP，NDP，NTPl3 3,5,5环状核苷酸环状核苷酸: : cAMP，cGMP AMP、ADP、ATP结构结构 pp.481pp.481ADPAMPADPATP3,5-cAM
13、P3,5-3,5-环状一磷酸腺苷（激素的媒介、第二信使）pp.482含有核苷酸的生物活性物质含有核苷酸的生物活性物质NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等中均含等中均含AMPNADP+NAD+AMPAMP 第二节第二节 核酸的一级结构核酸的一级结构 pp.482 核酸分子中核苷核酸分子中核苷酸的排列顺序。酸的排列顺序。 核核苷苷酸酸区别在于区别在于碱基碱基 也称也称碱基序列碱基序列5 5端端3端端CGAv3,5-3,5-磷酸磷酸二酯键连接而二酯键连接而成的多核苷酸成的多核苷酸链；链；v无分支。无分支。pp.483pp.4833 3端端5 5端端DNADNA、RNARNA的一级结构的一级
14、结构 pp.483-484pp.483-484RNADNA核酸链要点：核酸链要点：v核酸核酸骨架骨架：磷酸磷酸- -核糖，核糖， 碱基为侧链；碱基为侧链；vDNADNA、RNARNA区别区别： DNADNA组成：组成：脱氧核糖、碱基脱氧核糖、碱基、磷酸磷酸 DNADNA碱基：碱基：A A、G G、C C、T T； RNARNA组成：组成：核糖、碱基核糖、碱基、磷酸磷酸 RNARNA碱基：碱基：A A、G G、C C、U U；v具具方向性方向性( (极性极性) )：5 5 - -磷酸、磷酸、3 3 -OH-OH 阅读方向：阅读方向：3 3 端端5 5 端端简简便便书书写写法法5 pApCpTpG
15、pCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 书写规则书写规则：从左到右从左到右 55在左侧，含磷酸基；在左侧，含磷酸基； 33在右侧，含在右侧，含OHOH。 强调碱基顺序。强调碱基顺序。pp.482A G P5 P T PG PC PT P OH 3 3333355555第三节第三节 DNADNA的高级结构与功能的高级结构与功能Dimensional Structure and Function of DNA pp.485pp.485 一、一、 DNADNA的二的二级结构级结构右右手双螺旋结构手双螺旋结构 pp.486pp.486（一）研究背景和历史意义（一）研究背景和历史意义 背景和
16、依据：背景和依据： X-X-衍射结果显示：衍射结果显示： DNADNA呈规律性螺旋结构；呈规律性螺旋结构； 核酸分子组成的定量关系（核酸分子组成的定量关系（A=TA=T，G=C)G=C)； DNADNA具有种属特异性，不具有组织特异性；具有种属特异性，不具有组织特异性；不同种不同种类生物体类生物体DNADNA碱基组成不同，同种来源不同组织的碱基组成不同，同种来源不同组织的DNADNA分子碱基组成相同；分子碱基组成相同；* *意义：意义：DNADNA双螺旋结构揭示了基因结构、遗传信息和双螺旋结构揭示了基因结构、遗传信息和功能之间的关系。使结构学派、信息学派和生化遗功能之间的关系。使结构学派、信息
17、学派和生化遗传学派得到了高度的统一，开创了生命科学研究的传学派得到了高度的统一，开创了生命科学研究的新时期，推动了分子生物学和遗传学的迅速发展。新时期，推动了分子生物学和遗传学的迅速发展。v碱基组成特点：碱基组成特点： A A=T=T；G=G=C C A+G=C+T A+G=C+T（嘌呤（嘌呤= =嘧啶）嘧啶）A+C=G+TA+C=G+T（氨基碱基（氨基碱基= =酮基酮基碱基）碱基） vv碱基配对原则：碱基配对原则： (Chargaff(Chargaff规则规则) pp.486) pp.486 碱基以碱基以氢键氢键配对配对 A A = T = T（两个氢键）；（两个氢键）； G G C C（三
18、个氢键）（三个氢键） 此特点对此特点对DNADNA双螺旋结构模型的提双螺旋结构模型的提出起到了重要作用。出起到了重要作用。u两两条条反反向向平平行行的的多多聚聚脱脱氧氧核核苷苷酸酸链链，以以右右手手螺螺旋旋方方式式绕绕同同一一中心轴盘绕；中心轴盘绕；u脱脱氧氧核核糖糖- -磷磷酸酸链链骨骨架架在在双双螺螺旋旋外侧；外侧；u碱碱基基居居双双螺螺旋旋内内側側，与与对对側側碱碱基基通通过过氢氢键键互互补补，形形成成碱碱基基平平面面。垂直螺旋轴，即：。垂直螺旋轴，即： A=T; G C (称称碱基对碱基对,base pair,bp)（二）（二）DNADNA双螺旋结构模型特征双螺旋结构模型特征( (要点
19、）要点） （Watson-CrickWatson-Crick模型模型,1953,1953） pp.486pp.4865533u多聚核苷酸链的多聚核苷酸链的正方向为正方向为C3C5；u螺旋平均螺旋平均直径为直径为2nm，形，形成成大沟和小沟相间大沟和小沟相间； u相邻相邻碱基平面间距离：碱基平面间距离：0.34nm0.34nm；螺距：螺距：3.4nm3.4nm （近期测定：（近期测定：3.6nm3.6nm) )；u每每1010(10.5)(10.5)bpbp形成一个螺形成一个螺旋，旋，每个每个bpbp旋转约旋转约3636o o角角。55333.4nm3.4nmDNA碱基对的氢键和键长碱基对的氢键
20、和键长TACG三个氢键连接，两三个氢键连接，两链间距离较狭窄链间距离较狭窄两条氢键连接，两条氢键连接，两链间距离较宽松两链间距离较宽松pp.487 图图4-5u氢键：氢键：维持双链横向稳定性；维持双链横向稳定性；u碱碱基基堆堆积积力力：维维持持纵纵向向稳稳定定性性，疏水力和范德华力；疏水力和范德华力；u磷磷酸酸上上负负电电荷荷与与介介质质中中阳阳离离子子间形成间形成盐健；盐健；u前面两种力均为前面两种力均为： GCAT GC含含量量多多的的DNA片片段段横横向向纵纵向均稳定向均稳定。维持维持DNADNA双螺旋结构稳双螺旋结构稳定的定的三种力三种力 CCTTGAGA（三）（三）DNADNA结构的
21、多样性结构的多样性 pp.488pp.4881.1.双螺旋的多样性双螺旋的多样性vA-A-型：型：双连反向右手，较双连反向右手，较紧密，紧密，11bp/11bp/周；周；vB-B-型：型：Watson-CrickWatson-Crick模型，模型，常见，常见，10.5bp/10.5bp/周；周；vZ-Z-型：型：左手双螺旋，锯齿左手双螺旋，锯齿形；以形；以( (GC)GC)n n含量多，紧含量多，紧密；密；12bp/12bp/周；真核和原周；真核和原核核DNADNA中均有存在；中均有存在；Z-DNA B-DNA A-DNA二、二、DNADNA三级结构三级结构 pp.490pp.490vDNAD
22、NA携带遗传信息大分子携带遗传信息大分子v不同的生物体不同的生物体DNADNA分子不同，复杂程度也不分子不同，复杂程度也不同。进化程度越高，同。进化程度越高，DNADNA越复杂，分子量也越复杂，分子量也会越大。会越大。v真核线状真核线状DNADNA分子形成双螺旋后，虽然发生分子形成双螺旋后，虽然发生紧缩，但仍无法进入细胞核，因此必需进紧缩，但仍无法进入细胞核，因此必需进一步紧缩一步紧缩。（一）（一）DNADNA的超螺旋结构的超螺旋结构 pp.490-pp.490-v DNADNA来源不同，分子大小也不相同。来源不同，分子大小也不相同。v病毒病毒DNADNA进入病毒外壳、细菌染色体进入病毒外壳、
23、细菌染色体DNADNA进入胞内核区、人类进入胞内核区、人类4646条染色体条染色体DNADNA进入细胞核，这些长度极大的进入细胞核，这些长度极大的DNADNA分子必须经过多层次扭曲、盘绕，压分子必须经过多层次扭曲、盘绕，压缩成紧密结构缩成紧密结构( (超螺旋超螺旋) )，才能完成安，才能完成安装任务。装任务。（1 1）DNADNA超螺旋结构超螺旋结构 pp.491pp.491v DNADNA双螺旋链的再盘绕，即螺旋轴本身扭曲。双螺旋链的再盘绕，即螺旋轴本身扭曲。是是DNADNA结构张力的一种表现。结构张力的一种表现。正超螺旋正超螺旋(positive (positive supercoilsu
24、percoil) ) 张力过度，张力过度，盘绕方向与盘绕方向与DNADNA双螺旋方同相同双螺旋方同相同负超螺旋负超螺旋(negative (negative supercoilsupercoil) ) 张力不足，张力不足，盘绕方向与盘绕方向与DNADNA双螺旋方向相反双螺旋方向相反 图图13-1213-12 （2 2）DNADNA拓扑学性质拓扑学性质 pp.491pp.491v拓扑学拓扑学研究相互绕在一起的环在几何形态研究相互绕在一起的环在几何形态上的相互关系的学说。上的相互关系的学说。v用三个参数表示：用三个参数表示：vL( (总连环数总连环数)共价闭合环状共价闭合环状DNADNA两链缠绕次
25、两链缠绕次数；数；vT(盘绕数盘绕数) )：螺旋轮数；：螺旋轮数；vW(超螺旋数超螺旋数) )：双螺旋绕超螺旋轴旋转次数。：双螺旋绕超螺旋轴旋转次数。vDNADNA拓扑学关系式：拓扑学关系式： L=T+W （在（在DNA复制、转录过程起重要作用）复制、转录过程起重要作用）DNADNA超螺旋结构意义超螺旋结构意义超螺旋的超螺旋的拓扑学变化及其调控拓扑学变化及其调控对于对于DNADNA复制和复制和RNARNA转录具有重要意义。转录具有重要意义。 例如：例如：拓扑异构酶能通过引入或解除超拓扑异构酶能通过引入或解除超螺旋来调节超螺旋程度，从而影响螺旋来调节超螺旋程度，从而影响DNADNA的的复制和转录
26、时的解链过程。复制和转录时的解链过程。（二）（二）DNADNA在细胞内的组装在细胞内的组装（1 1）原核）原核生物生物DNADNA高级结构高级结构 原核原核DNADNA多为闭环双螺旋结构，在此基础多为闭环双螺旋结构，在此基础上再次螺旋化，形成超螺旋结构。上再次螺旋化，形成超螺旋结构。（2 2）真核生物细胞核内）真核生物细胞核内DNADNA形式形式真核生物核染色体：真核生物核染色体：DNADNA+蛋白质蛋白质 pp.494pp.494 分裂期分裂期棒状（染色体）棒状（染色体）染色体染色体DNA + Pr(DNA + Pr(组蛋白组蛋白) DNA) DNA超级结构，超级结构，基本单位基本单位核小体
27、核小体。核小体的组成：核小体的组成： DNA： 约约200bp 组蛋白：组蛋白：H1；H2A，H2B；H3；H4H1H1蛋白质数量：蛋白质数量：2(H2(H2A2A,H,H2B,2B,H H3 3.H.H4 4) ) 形成八面体形成八面体 两个核心颗粒之间再由两个核心颗粒之间再由6060个个bpbp( (碱基对）和碱基对）和H H1 1形成连接区，形成连接区，将核心颗粒和将核心颗粒和H H1 1连成串珠结构。连成串珠结构。核心颗粒核心颗粒核心颗粒核心颗粒pp.495pp.495 真核生物染色体真核生物染色体DNA组装不同层次的结构（与图组装不同层次的结构（与图13-17类似）类似）三、三、DN
28、ADNA结构与功能的关系结构与功能的关系1 1、确定、确定DNADNA是遗传物质的试验是遗传物质的试验( (肺炎球菌）肺炎球菌） pp.475pp.475破碎细胞破碎细胞+R型细胞型细胞(非致病非致病)R(粗糙粗糙)只有只有R型型RDNase降解后的降解后的DNAR型细胞型细胞接受接受S型型DNAS型细胞型细胞(致病致病)S(光滑光滑)少数少数R型细胞型细胞被转化为含被转化为含S型基因的荚膜型基因的荚膜光滑致病型光滑致病型S大多数仍为大多数仍为R型型+T T2 2噬噬菌菌体体感感染染大大肠肠杆杆菌菌同同位位素素试试验验标记的标记的T2与与大肠杆菌混大肠杆菌混合感染合感染充分搅拌使菌充分搅拌使菌
29、体表面体表面T2与菌与菌体分离体分离离心，检测上离心，检测上清和沉淀中放清和沉淀中放射性元素情况射性元素情况T2在侵染细菌时仅在侵染细菌时仅DNA进入进入菌体，菌体，Pr外壳没进入。外壳没进入。新病毒中仅有新病毒中仅有32P,没有没有35S存存在。在。35S标记标记T2蛋白质蛋白质35S在悬浮液中在悬浮液中32P标记标记T2DNA32P在沉淀在沉淀菌体内菌体内证明证明pp.476DNA是以基因的形式运载遗传信息，作为复制、转录的模板是以基因的形式运载遗传信息，作为复制、转录的模板 2.2.基因基因DNADNA分子上的一段序列分子上的一段序列v结构基因结构基因能编码多肽链或能编码多肽链或RNAR
30、NA的的DNADNA片段。片段。DNADNA分子中还含有其他序列，它们不编码蛋白分子中还含有其他序列，它们不编码蛋白质，是纯粹的质，是纯粹的调节序列。调节序列。v调节基因调节基因( (调节序列调节序列) )可提供下列信号，发可提供下列信号，发挥调节功能：挥调节功能： 指示结构基因的指示结构基因的开端和结尾；开端和结尾； 参与结构基因转录的参与结构基因转录的启动和关闭；启动和关闭； 具有具有复制、重组起点的作用。复制、重组起点的作用。v基因基因由由DNADNA上一段上一段编码肽链或转录编码肽链或转录RNARNA的序的序列列( (结构基因结构基因) )，和，和调节序列调节序列共同组成共同组成。3.
31、3.双螺旋提供了遗双螺旋提供了遗传信息传递基础传信息传递基础vDNADNA双螺旋性质为双螺旋性质为半半保留复制保留复制提供了结提供了结构基础。构基础。v细胞分裂时，按照细胞分裂时，按照碱基互补原则，以碱基互补原则，以亲代亲代DNADNA每条单链为每条单链为模板合成与其互补模板合成与其互补的子链的子链DNADNA（如图）。（如图）。 4.4.基因指导蛋白质合成基因指导蛋白质合成v反向平行的双螺旋也可以在反向平行的双螺旋也可以在DNADNA和和RNARNA链之间形成，链之间形成，叫做叫做DNA-RNADNA-RNA杂交链杂交链。在杂交分子中基因将信息在杂交分子中基因将信息准确地传递给准确地传递给R
32、NARNA，并可指导蛋白质合成。，并可指导蛋白质合成。杂交杂交链的碱基配对规则：链的碱基配对规则： DADA- -RURU、DGDG- -RCRC、DCDC- -RGRG、DTDT- -RARAv碱基配对的应用：碱基配对的应用：出现在复制中，产物为出现在复制中，产物为DNADNA； 出现在转录中，产物为出现在转录中，产物为RNARNAv细胞内细胞内RNA(mRNARNA(mRNA、tRNAtRNA和和rRNArRNA) )都是以都是以DNADNA为模板为模板转录产物。转录产物。vDNADNA和蛋白质之间的联系物是和蛋白质之间的联系物是RNARNA。分子生物学中性法则（遗传信息流传递方向）分子生
33、物学中性法则（遗传信息流传递方向）v 以亲代以亲代DNA为模板，通过为模板，通过 碱基配对原则，复制生成子碱基配对原则，复制生成子 代代DNADNA复制；复制；v以以DNA单链某一基因片段为模单链某一基因片段为模 板，通过碱基配对原则合成板，通过碱基配对原则合成 RNARNA转录；转录；v以以mRNA为模板，以过多种为模板，以过多种RNA配合，通过密码子配合，通过密码子的翻译，指导合成蛋白质的翻译，指导合成蛋白质翻译。翻译。vRNA病毒在宿主细胞中繁殖时，以其病毒在宿主细胞中繁殖时，以其RNA为模板，为模板，通过碱基配对原则，在通过碱基配对原则，在逆转录酶逆转录酶催化下，合成催化下，合成DNA
34、，称为，称为逆转录逆转录过程。过程。DNADNA不仅可以指导复不仅可以指导复制制DNADNA，也指导转录，也指导转录合成能与合成能与DNADNA链互补链互补的的RNARNA链。链。按照按照CrickCrick中心法则，中心法则，在信息表达时，编在信息表达时，编码蛋白质的基因可码蛋白质的基因可将信息转录给将信息转录给mRNAmRNA。再以再以mRNAmRNA为模板指为模板指导合成蛋白质。导合成蛋白质。DNA 5-A-G-A-G-G-T-G-C-T-3 3-T-C-T-C-C-A-C-G-A-5转录mRNA 5-A-G-A-G-G-T-G-C-T-3tRNA U-C-U C-CA C-G-AArg
35、GlyAla翻译蛋白质蛋白质 -ArgGlyAla 转录和翻译转录和翻译模板链在在mRNAmRNA线性序列上每三个核苷酸为一个线性序列上每三个核苷酸为一个遗传密码，编码一个氨基酸。因此，遗传密码，编码一个氨基酸。因此，mRNAmRNA的核苷酸序列确定了蛋白质的氨基的核苷酸序列确定了蛋白质的氨基酸序列。酸序列。基因的遗传信息通过基因的遗传信息通过RNARNA的中间传递，的中间传递，最终以蛋白质的形式表达出来最终以蛋白质的形式表达出来。发挥蛋发挥蛋白质生物学功能和特性。白质生物学功能和特性。 即：即：基因表达基因表达四、四、DNADNA的序列分析的序列分析v测定测定DNADNA核苷酸序列的核苷酸序
36、列的基本原则基本原则： 获得高纯度、均一完整的获得高纯度、均一完整的DNADNA基因片段；基因片段； 用用DNADNA限制性内切酶降解，获得一套大小不同片段；限制性内切酶降解，获得一套大小不同片段； 测定每个片段的核苷酸序列；测定每个片段的核苷酸序列； 完整完整DNADNA分子的拼接。分子的拼接。v核酸的测序，是测定碱基序列过程。核酸的测序，是测定碱基序列过程。v与蛋白质的氨基酸测序原则类似与蛋白质的氨基酸测序原则类似。五、五、DNADNA限制性内切酶限制性内切酶v 催化外源催化外源DNADNA中某特定部位水解的酶类。中某特定部位水解的酶类。（一）细菌（一）细菌DNADNA的限制、修饰系统：的
37、限制、修饰系统：v降解外源降解外源DNADNA特异部位，修饰内源特异部位，修饰内源DNADNA相同部位。相同部位。v即：菌体除含有降解外源即：菌体除含有降解外源DNADNA分子的酶外，还分子的酶外，还含有对含有对内源内源DNADNA分子中限制性内切酶识别部位分子中限制性内切酶识别部位修饰保护作用的修饰保护作用的酶类。酶类。v限制：限制：破坏外源破坏外源DNADNAv修饰：修饰：保护内源保护内源DNADNAAAGCGAGATTGGCTT.TTCGCTCTAACCGAA外源性外源性DNA.GCATTAAGCGAGATTGGAGCTTA.CGTAATTCGCTCTAACCTCGAAT.内源性内源性D
38、NA限制性内切酶修饰酶v修饰：修饰：多由专一性多由专一性甲基化酶甲基化酶完成完成v甲基化酶（对内源甲基化酶（对内源DNADNA保护）与限制性内切酶保护）与限制性内切酶（对外源（对外源DNADNA降解）作用于同一部位。降解）作用于同一部位。v宿主甲基化酶和限制性内切酶往往宿主甲基化酶和限制性内切酶往往成对存在成对存在。（二）限制性内切酶（二）限制性内切酶 两种类型：两种类型： 类型类型具有降解酶、修饰酶、具有降解酶、修饰酶、ATPATP酶功能；酶功能； 类型类型仅具有降解酶功能。仅具有降解酶功能。 限制性内切酶类型限制性内切酶类型切割部位特点：切割部位特点：v4-6bp4-6bp特定序列，呈双重
39、对称特定序列，呈双重对称v例如：例如：EcoEcoR R识别降解部位可产生黏性末端识别降解部位可产生黏性末端v EcoEcoR R识别降解部位可产生平齐末端识别降解部位可产生平齐末端 E：大肠杆菌（：大肠杆菌（E coli）；）；co：种名的字头；：种名的字头；R：Ecoli的株系；罗马字母：酶的编号的株系；罗马字母：酶的编号六、六、DNADNA测序的链终止法测序的链终止法 (pp.518-519)(pp.518-519)采用采用DNADNA复制原理复制原理在在DNADNA模板、引物、模板、引物、4 4种种5-dNTP5-dNTP及酶促合成所及酶促合成所需要的其他所有条件下：需要的其他所有条件
40、下：DNADNA聚合酶在模板指导下，以聚合酶在模板指导下，以3,5-3,5-磷酸二酯磷酸二酯键结合的方式依次将单个键结合的方式依次将单个5-dNTP5-dNTP连接到引物连接到引物或新合成链的或新合成链的3-OH3-OH上，依次合成，从而得到上，依次合成，从而得到与模板互补的与模板互补的DNADNA新链。新链。当向当向3-OH3-OH端加入的端加入的5-dNTP5-dNTP时，若同时加入时，若同时加入3-OH3-OH被被H H取代物，则部分取代物，则部分DNADNA新链合成便被终新链合成便被终止。止。v由于终止部位是随机的，所以可以获得任何一由于终止部位是随机的，所以可以获得任何一种长度的种长
41、度的DNADNA片段。片段。v通过电泳分离，再经放射自显影，从胶片上直通过电泳分离，再经放射自显影，从胶片上直接可读出核苷酸顺序接可读出核苷酸顺序( (如图如图) )。v此法简便、快速且准确。此法简便、快速且准确。v链终止法关键：链终止法关键： 2,3-ddNTP2,3-ddNTP与与dNTPdNTP的含量的含量比。比。 ddNTP/dNTPddNTP/dNTP比值恰当，可保证合成终止比值恰当，可保证合成终止在所需位置。在所需位置。 GGCCATCGTTGA2134链终止法测定链终止法测定DNADNA序列序列- -电泳图谱电泳图谱与膜板与膜板DNADNA互补序列互补序列pp.519123456
42、7981010 GGCCATCGTTGA10 GGCCATCGTTGA10 GGCCATCGTTGA七、七、DNADNA分子大小特点和分析分子大小特点和分析vDNADNA生物大分子生物大分子v病毒病毒DNADNA：几千：几千bpbpv细菌细菌DNADNA：几百万：几百万bpbpv真核染色体真核染色体DNADNA：几千万：几千万bpbp核酸的研究方法核酸的研究方法v分子杂交法分子杂交法v电子显微镜观察法电子显微镜观察法v核酸复性动力学研究法核酸复性动力学研究法vDNADNA、RNARNA核酸测序法核酸测序法v研究揭示了许多核酸的组织研究揭示了许多核酸的组织结构特点结构特点。第四节 RNA的结构与
43、功能 pp.483Structure and Function of RNAv除上列除上列RNARNA外，还有多种外，还有多种RNARNA存在于细胞中，如：存在于细胞中，如： 核内小核内小RNA(SnRNARNA(SnRNA) )，主要参与，主要参与HnRNAHnRNA的剪切与转运；的剪切与转运； 核仁小核仁小RNA(SnoRNARNA(SnoRNA) )，主要参与，主要参与rRNArRNA的加工与修饰。的加工与修饰。RNARNA的结构与功能的结构与功能vRNARNA结构：结构： 多以单链形式存在，多以单链形式存在， 有局部二、三级结构；有局部二、三级结构；v相对分子量（相对分子量（Mr.Mr
44、.）：）： 几十几千个核苷酸残基几十几千个核苷酸残基vRNARNA功能：功能：v几种几种RNARNA共同完成基因表达共同完成基因表达( (蛋白质合成蛋白质合成) )任务任务 一、信使核糖核酸一、信使核糖核酸（mRNAmRNA） 的结构与功能的结构与功能 1.mRNA1.mRNA的特证：的特证：vmRNAmRNA基因的携带者，含编码区和非编码区基因的携带者，含编码区和非编码区v编码区编码区( (结构基因结构基因) )指导蛋白质合成；指导蛋白质合成；v非编码区非编码区调控蛋白质合成的起始与终止；调控蛋白质合成的起始与终止；vmRNAmRNA量：量：约占细胞总约占细胞总RNARNA量的量的5%5%；
45、v不稳定，不稳定，细菌细菌mRNAmRNA半衰期仅几分钟；半衰期仅几分钟；vmRNAmRNA多以一级结构形式存在。多以一级结构形式存在。2. 2. 原核生物原核生物mRNAmRNA特征特征含非编码区；含非编码区；含多顺反子含多顺反子 非编码区非编码区不为蛋白质编码的核苷酸序列不为蛋白质编码的核苷酸序列单顺反子单顺反子一个基因仅携带为一条肽链编码一个基因仅携带为一条肽链编码 的核苷酸序列的核苷酸序列( (信息）。信息）。多顺反子多顺反子一个基因携带为多条肽链编码的全部核一个基因携带为多条肽链编码的全部核苷酸序列。每个顺反子编码一条肽链苷酸序列。每个顺反子编码一条肽链非编码区，多为核非编码区，多为
46、核糖体识别位点糖体识别位点 mRNAmRNA的的33端和端和55端均存在一段非编码区。端均存在一段非编码区。 非编码区功能非编码区功能调节基因的开放与关闭；调节基因的开放与关闭； 原核生物原核生物mRNAmRNA含多顺反子，含多顺反子，每两个顺反子每两个顺反子间被非编码区隔开；间被非编码区隔开；单顺反子单顺反子单顺反子单顺反子 原核生物原核生物mRNAmRNA的的SDSD序列序列v原核原核mRNAmRNA起始密码起始密码AUG上游上游( (左侧左侧) )约约1010核苷酸处核苷酸处，有一段有一段富含嘌呤的核苷酸序列，富含嘌呤的核苷酸序列，称为称为前导序列前导序列。 (Shine-(Shine-
47、DalgarnoDalgarno发现，因此命名，并称其为发现，因此命名，并称其为SDSD序列序列 ) )vSDSD序列功能：与翻译的起始密切相关，序列功能：与翻译的起始密切相关，是是mRNAmRNA与核与核 糖体小亚基中糖体小亚基中16S 16S rRNArRNA 结合的部位。结合的部位。 3.3.真核细胞真核细胞mRNAmRNA特征特征 pp.484pp.484 真核生物真核生物mRNAmRNA中只有单顺反子，中只有单顺反子，但在其两端但在其两端也存在非编码区。如下图。也存在非编码区。如下图。5 5 非编码区非编码区3 3 非编码非编码区区编码区编码区 真核生物真核生物mRNAmRNA的的内
48、含子和外显子内含子和外显子 真核真核mRNAmRNA合成初期的合成初期的HnRNAHnRNA中存在中存在不编码蛋白不编码蛋白的的内含子内含子和编码蛋白的和编码蛋白的外显子外显子。在成熟加工过在成熟加工过程中，需将内含子切掉，将外显子连接起来，程中，需将内含子切掉，将外显子连接起来，形成成熟的形成成熟的mRNAmRNA分子分子( (如图如图):):内含子内含子( (intron) ) 外显子外显子( (exon) )HnRNA 加工加工mRNA 真核生物真核生物mRNA的成熟与转移的成熟与转移细胞核细胞核DNA HnRNA mRNA mRNA Pr 胞质胞质DNA HnRNA mRNA mRNA
49、 Pr 核核糖糖体体核核糖糖体体转转录录加加工工翻翻译译真核真核mRNAmRNA结构特点结构特点 pp.484pp.484a.5a.5末端帽子结构：末端帽子结构：m m7 7G G55pppppp55Nm-Nm- 转录后加工上去的：转录后加工上去的：7-7-甲基鸟苷二磷酸甲基鸟苷二磷酸 有些第一个核苷酸残基的有些第一个核苷酸残基的G G2 2也被甲基化。也被甲基化。b.b.多数真核多数真核mRNAmRNA的的3 3末端有多聚末端有多聚A A尾：尾：polyAnpolyAn 转录后加工上去的：转录后加工上去的：-AAAAAA-An-AAAAAA-An 55非编码非编码区区33非编码非编码区区编码
50、区编码区55帽子结帽子结构构33多聚多聚A A尾结尾结构构 帽子结构：m7GpppNm- pp.484帽子结构的功能：帽子结构的功能：协助协助mRNA与核糖体识别，与核糖体识别，为为mRNA翻译的起始翻译的起始提供识别标志，提供识别标志，防止防止5末端降解起保护作用。末端降解起保护作用。75531CH3O4.mRNA4.mRNA的功能的功能 DNADNA携带的遗传信息，携带的遗传信息，通过碱基配对原则通过碱基配对原则转转录到录到mRNAmRNA分子上，分子上，然后，再以然后，再以mRNAmRNA为模板，为模板，在核糖体上在核糖体上指导合成蛋白质。指导合成蛋白质。mRNA原核细胞原核细胞DNA蛋
51、白合成蛋白合成转录转录翻译翻译细胞质细胞质细胞核细胞核DNA内含子内含子外显子外显子转录转录转录后剪接内含子，添转录后剪接内含子，添加加5帽子、帽子、3尾结构尾结构mRNAmRNAHnRNAHnRNA翻译翻译蛋白质合成蛋白质合成真核细胞真核细胞 m7GpppAAAAA二、转运核糖核酸二、转运核糖核酸（tRNAtRNA） 的结构与功能的结构与功能1.tRNA1.tRNA1.tRNA1.tRNA的一级结构特点的一级结构特点的一级结构特点的一级结构特点含稀有碱基含稀有碱基含稀有碱基含稀有碱基(10-20%)(10-20%)(10-20%)(10-20%)，如：二氢尿嘧啶环，如：二氢尿嘧啶环，如：二氢
52、尿嘧啶环，如：二氢尿嘧啶环(DHU)(DHU)(DHU)(DHU)；3 3 3 3 末端为末端为末端为末端为-CCA-OH-CCA-OH-CCA-OH-CCA-OH，氨基酸结合位点；氨基酸结合位点；氨基酸结合位点；氨基酸结合位点；氨基酸臂有较多的氨基酸臂有较多的氨基酸臂有较多的氨基酸臂有较多的 GC GC GC GC 结构结构结构结构( ( ( (稳定稳定稳定稳定) ) ) )；在在在在T T T T C C C C环中含环中含环中含环中含 假脲嘧啶假脲嘧啶假脲嘧啶假脲嘧啶( ( ( ( ) ) ) )- - - -胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T(T(T(T)-)-)-)-核苷酸核苷酸核
53、苷酸核苷酸环环环环 ；含反密码子环（反密码子与密码子反向识别）。含反密码子环（反密码子与密码子反向识别）。含反密码子环（反密码子与密码子反向识别）。含反密码子环（反密码子与密码子反向识别）。N,NN,N二甲基鸟嘌呤二甲基鸟嘌呤2 2稀有碱基二氢尿嘧啶二氢尿嘧啶（DHU）6 65 5假尿嘧啶假尿嘧啶()NHOOHNa.a.氨基酸臂（氨基酸臂（富含富含GCGC，且，且有有-CCA-OH3);-CCA-OH3);b.b.二氢尿嘧啶（二氢尿嘧啶（DHUDHU）环；）环；c.c.反密码子环反密码子环（7 7个碱基，个碱基，中部的中部的3 3个核苷酸残基形个核苷酸残基形成反密码子与密码子反成反密码子与密码
54、子反向识别）；向识别）；d.d.额外环额外环( (不同的不同的tRNAtRNA，此，此环大小不同，有一定的环大小不同，有一定的种属特异性）；种属特异性）；e.e.假尿嘧啶假尿嘧啶- -胸腺嘧啶胸腺嘧啶（TCTC）环）环（7 7个核苷酸个核苷酸残基，含残基，含TCTC成分）。成分）。2.tRNA2.tRNA的二级结构的二级结构三叶草型三叶草型 pp.496pp.49653 tRNAtRNA的三级结的三级结 倒倒L L形结形结构构t tRNARNA的功能的功能活化、转运氨基酸；活化、转运氨基酸；通过反密码子识别密码子；通过反密码子识别密码子；并并将将AAAA运运输输到到核核糖糖体体中中，参参与与蛋
55、蛋白质合成。白质合成。pp.177反密码子氨基酸臂5端端3端端三、三、核糖核蛋白体核糖核酸核糖核蛋白体核糖核酸( (rRNArRNA) ) 的结构与功能的结构与功能rRNArRNA细胞中含量最多的细胞中含量最多的RNA,RNA,约占约占80%80%vrRNArRNA的结构的结构( (如图）如图）v功能功能： rRNArRNA可与蛋白质可与蛋白质结合，形成核糖体结合，形成核糖体；为蛋白质生物合成提为蛋白质生物合成提供场所。供场所。 ( (如下表如下表) )pp.498 核糖核蛋白体的组成核糖核蛋白体的组成 pp.498占总重量的占总重量的35%49种种占总重量的占总重量的30%31种种蛋白质蛋白
56、质4718个核苷酸个核苷酸160个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸28S5.85S5S2940个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸23S5SrRNA60S50S大亚基大亚基占总重量的占总重量的50%33种种占总重量的占总重量的40%21种种蛋白质蛋白质1874个核苷酸个核苷酸18S1542个核苷酸个核苷酸16SrRNA40S30S小亚基小亚基真核真核生物（以小鼠肝为例）生物（以小鼠肝为例）原核原核生物（以大肠杆菌为例）生物（以大肠杆菌为例）第第 五五 节节核酸的理化性质与应用核酸的理化性质与应用The Physical and Chemical Charactersof Nucleic
57、Acid and its applicationpp.502 一、核酸的溶解性一、核酸的溶解性1.1.有机溶剂分离：有机溶剂分离：v 核酸分子中因含有许多极性基团，核酸分子中因含有许多极性基团， 例如：例如：-OH-OH、-NH-NH2 2、-PO-PO4 43- 3- 等；等； 易溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。易溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 用用70%70%乙醇可将核酸从水溶液中沉淀分离乙醇可将核酸从水溶液中沉淀分离2.2.低盐溶液分离低盐溶液分离核酸核酸- -蛋白复合物蛋白复合物： 胞内胞内DNADNA、RNARNA常以蛋白质复合物形式存在：常以蛋白质复合物形式存在： 如：如
58、：DNA-DNA-蛋白质蛋白质(DNP)(DNP)、RNA-RNA-蛋白质蛋白质( (RNPRNP) ) DNPDNP在低盐溶液中溶解度很低，在低盐溶液中溶解度很低，RNPRNP溶解度较高。溶解度较高。 v例如：例如：DNPDNP在在0.14molL0.14molL-1-1的的NaClNaCl中的溶解度仅为水中的溶解度仅为水中的中的1%1%，但，但RNPRNP却极易溶解。所以可用于分离。却极易溶解。所以可用于分离。RNPDNP0.14mol/LNaCl+DNP和和RNP混合样混合样DNP沉淀沉淀1mol/LNaCl加入加入DNP沉淀沉淀饱和苯酚饱和苯酚除蛋白除蛋白 二、核酸的紫外吸收特点二、核
59、酸的紫外吸收特点 pp.507v核酸在紫外光区具有强烈的吸收，其最大吸收核酸在紫外光区具有强烈的吸收，其最大吸收值在值在260nm260nm附近；因此，通过附近；因此，通过A A260260可初步测出核可初步测出核酸含量。酸含量。v原理：原理：碱基含有共轭双键；碱基含有共轭双键；v蛋白质在蛋白质在280nm280nm附近具有特征吸收，因为含有附近具有特征吸收，因为含有TyrTyr和和TryTry残基残基( (含共轭双键的芳香烃侧链含共轭双键的芳香烃侧链) )；v用紫外光对核酸定量时应用紫外光对核酸定量时应注意固定注意固定pHpH：v固定固定pHpH稳定解离状态稳定解离状态稳定空间结构稳定空间结
60、构得到得到稳定的稳定的A A260260值。值。 判断核酸纯度判断核酸纯度 pp.507v较纯的较纯的DNADNA：A A260260/A/A280280=1.8=1.8v较纯的较纯的RNARNA： A A260260/A/A280280=2.0=2.0v当样品中含有杂蛋白质时：当样品中含有杂蛋白质时：A A260260/A/A280280v当样品中含有当样品中含有RNARNA时：时：A A260260/A/A280280v纯品可用纯品可用A A260260定量测定其含量：定量测定其含量：v通常：通常：A A260260=1 =1 时时： v双链双链DNA=50g/mLDNA=50g/mL；单
61、链；单链DNA(DNA(或或RNA)=40g/mLRNA)=40g/mLv或寡聚核苷酸或寡聚核苷酸20g/mL20g/mL各种碱基的紫外吸收光谱（各种碱基的紫外吸收光谱（pH7.5）ACGTU消光系数波长波长A260三、三、DNADNA的变性的变性( (denaturationdenaturation) ) pp.508pp.508pp.508pp.508vDNADNA变性变性在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNADNA双链双链间间H H键断裂，形成两条单链的过程。键断裂，形成两条单链的过程。v条件：条件：过酸、过碱，加热，变性剂过酸、过碱，加热，变性剂( (如尿素、如尿素、 酰胺
62、等酰胺等) )以及某些有机溶剂等。以及某些有机溶剂等。v增色效应：增色效应： DNADNA变性时，使溶液变性时，使溶液A A260260增高的现象。增高的现象。200 260 300波长波长(nm)(nm)变性状态变性状态天然状态天然状态0.51.01.5解链曲线：解链曲线：在在连连续续加加热热DNADNA过过程程中中，以以A A260260T T作作图图，得得到到一一条条曲曲线线解链曲线。解链曲线。热变性热变性A260nm解解链链温温度度(Tm)：DNA变变性性是是在在一一个个很很窄窄的的温温度度范范围围内内完完成成。在在变变性性范范围围内内，A A260260=1/2A=1/2A26026
63、0时时对对应应的的温温度度（解解链链一一半半时时对对应应温温度度）。称称为为DNADNA的的解解链链温温度度，又称熔解温度又称熔解温度(Tm)(Tm)。特点：特点：TmTmG+CG+C 均质均质DNApolyd(GDNApolyd(G-C)-C) 或或polyd(Apolyd(A-T)-T)熔解熔解 范围窄，反之则较宽；范围窄，反之则较宽；介质中离子强度高，介质中离子强度高， TmTm也高，熔解范围窄；也高，熔解范围窄； 反之，离子强度底，反之，离子强度底， TmTm也低，熔解范围也低，熔解范围 则较宽。则较宽。A260nmpp.508DNADNA变性后理化性质变化：变性后理化性质变化：vA
64、A260260增高、溶液粘度下降、比旋光度增高、溶液粘度下降、比旋光度下降、浮力密度升高、酸碱滴定曲线下降、浮力密度升高、酸碱滴定曲线改变、生物活性丧失等。改变、生物活性丧失等。四、四、DNADNA的的复性复性与与分子杂交分子杂交 pp.509pp.509v1.DNA1.DNA复性复性( (renaturationrenaturation) )：在适当条件下，如解除变性因素，变性在适当条件下，如解除变性因素，变性DNADNA的两条的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一过程称为复互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一过程称为复性，也称退火。性，也称退火。如：热变性如：热变性DNADNA缓慢降温缓慢
65、降温复性复性v影响复性因素：影响复性因素：浓度、温度、链长浓度、温度、链长v减色效应：减色效应： DNADNA复性时，复性时，A A260 260 降低的现象。降低的现象。2.2.核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization) (hybridization) pp.510pp.510v在在DNADNA复性时，如果将复性时，如果将不同种类的不同种类的DNADNA单链或单链或RNARNA分子放在同一溶液中，分子放在同一溶液中，两单链核酸分子之两单链核酸分子之间存在一定程度的碱基配对关系。间存在一定程度的碱基配对关系。在适宜条件在适宜条件下，便可在两分子间发生互补结合，形成杂化。下，便可在两
66、分子间发生互补结合，形成杂化。v杂化可以在杂化可以在DNADNA与与DNADNA之间形成、之间形成、DNADNA和和RNARNA之间、之间、RNARNA与与RNARNA分子间形成。被称为分子间形成。被称为核酸分子的杂交。核酸分子的杂交。3.DNA3.DNA印迹技术印迹技术（Southern blotting) ) pp.510 pp.510 RNARNA和蛋白质印迹法和蛋白质印迹法 pp.511pp.511vNorthern blottingRNARNA印迹技术印迹技术v将变性将变性RNARNA转移到硝酸纤维素膜上，加入转移到硝酸纤维素膜上，加入3232P P标记的标记的RNARNA或或DNA
67、DNA探针，通过杂交，检探针，通过杂交，检测的方法。测的方法。vWestern blotting蛋白质印迹技蛋白质印迹技术。根据抗原术。根据抗原- -抗体相结合原理，通过标抗体相结合原理，通过标记，进行检测的方法。记，进行检测的方法。总总 结结v核酸的组成、结构、种类和特点；核酸的组成、结构、种类和特点；DNADNA和和RNARNA功能；碱基功能；碱基的种类；核苷，核苷酸；的种类；核苷，核苷酸；NMPNMP、NDPNDP、NTPNTP；dNMPdNMP、dNDPdNDP、dNTPdNTP；核酸的紫外吸收特征；核酸的紫外吸收特征；335-5-磷酸二酯键磷酸二酯键; ;核酸核酸的的33端、端、55
68、端特点；端特点；vDNADNA的二级结构的二级结构右手双螺旋结构要点及稳定力；碱右手双螺旋结构要点及稳定力；碱基配对原则；分子生物学中心法则；基配对原则；分子生物学中心法则；内切酶、外切酶；内切酶、外切酶；vRNARNA的种类、结构与功能的种类、结构与功能；真核细胞真核细胞mRNAmRNA的结构特点的结构特点、tRNAtRNA的结构（二级）特点及功能的结构（二级）特点及功能；rRNArRNA的功能；的功能；v核酸的核酸的紫外吸收特点（紫外吸收特点（260nm260nm）DNADNA的热的热变性变性（双链解开，（双链解开，松散，黏度下降，松散，黏度下降，紫外吸收增强紫外吸收增强- -增色效应增色
69、效应）、）、复性复性（双链恢复双螺旋，黏度增加，紫外吸收降低（双链恢复双螺旋，黏度增加，紫外吸收降低- -减色效减色效应）；应）；解链温度（或融解温度，解链温度（或融解温度，TmTm）；TmTm与碱基种类及与碱基种类及含量的关系；含量的关系；核酸核酸分子的杂交分子的杂交及其应用及其应用；核酶；核酶；v碱基配对原则（碱基配对原则（DNA-DNADNA-DNA；DNA-RNADNA-RNA；RNA-RNA-RNARNA）；）；v分子生物学中心法则；分子生物学中心法则；vDNADNA分子的测序（链终止法原理）；分子的测序（链终止法原理）；v基因重叠，真核基因重叠，真核mRNAmRNA的内含子，外显子
70、，回的内含子，外显子，回文结构。文结构。vRNARNA的分类的分类vmRNAmRNA的结构与功能的结构与功能 编码序列、非编码序列、编码序列、非编码序列、 原核：原核：多顺反子多顺反子 真核：真核：单顺反子、内含子、外显子、帽子结构、尾巴结单顺反子、内含子、外显子、帽子结构、尾巴结构。构。 功能：做为模板，指导合成蛋白质。功能：做为模板，指导合成蛋白质。vtRNAtRNA结构与功能结构与功能 含较多的稀有碱基；二级结构为：含较多的稀有碱基；二级结构为：三叶草型三叶草型( (氨基酸臂、氨基酸臂、反密码子环）反密码子环） 功能：功能：在反密码子的识别下，转运氨基酸，为合成蛋在反密码子的识别下，转运
71、氨基酸，为合成蛋白质提供原料；每种白质提供原料；每种tRNAtRNA仅携带一种特定的仅携带一种特定的AAAA。vrRNArRNA的的结构与功能：结构与功能：颈环结构颈环结构分子杂交检测技术的应用分子杂交检测技术的应用vDNA的变性和复性；分子杂交；的变性和复性；分子杂交；vDNA印迹技术（印迹技术（Southern blotting)vRNA印迹技术印迹技术Northern blotting；v蛋白质印迹技术蛋白质印迹技术Western blotting三、核苷酸的紫外吸收特性三、核苷酸的紫外吸收特性 pp.507pp.507v 核苷酸碱基核苷酸碱基( (共轭双键共轭双键) )紫外区具有强烈的
72、吸收峰紫外区具有强烈的吸收峰240-290nm240-290nm，最大吸收峰位，最大吸收峰位260nm260nm左右。可用作定左右。可用作定性定量检测。性定量检测。vv影响因素：影响因素：影响因素：影响因素： 碱基种类；碱基种类；解离状态。在解离状态。在不同不同pHpH下紫外吸收光下紫外吸收光谱不同谱不同( (如图如图) )。测定紫外吸收时应注意。测定紫外吸收时应注意pHpH要固定。要固定。 核苷酸的定性与定量分析核苷酸的定性与定量分析v定性分析定性分析紫外吸收标准比值法紫外吸收标准比值法: : 各种核苷酸在特定各种核苷酸在特定pHpH条件下紫外吸收的条件下紫外吸收的标准比标准比值值(A(A2
73、50250/A/A260260、A A280280/A/A260260、A A290290/A/A260260) )是固定的。是固定的。因因此，可分别测定未知样品在固定此，可分别测定未知样品在固定pHpH条件下的条件下的250nm250nm、260nm260nm、280nm280nm和和290nm290nm的吸光度，经计的吸光度，经计算对比，可基本确定其核苷酸种类；算对比，可基本确定其核苷酸种类；v定量分析定量分析摩尔吸光系数法：摩尔吸光系数法： 某核苷酸在某核苷酸在260nm260nm处的摩尔吸光系数，处的摩尔吸光系数，与与pHpH相关。相关。 因此，使用时应固定因此，使用时应固定pHpH。
74、四、核苷酸的两性解离四、核苷酸的两性解离 pp.505pp.505v碱基杂环中碱基杂环中氮氮(N)(N)原子及取代基原子及取代基具有接受质子具有接受质子和给出质子的能力，所以它们和给出质子的能力，所以它们即具有碱性解离即具有碱性解离又具酸性解离的性质。又具酸性解离的性质。 v核苷酸中核苷酸中磷酸基磷酸基也是可以解离的。也是可以解离的。 因此，因此，核苷酸也有等电点。核苷酸也有等电点。 解离基团的解离基团的pKpK值是可查的。值是可查的。（一）基因重叠（一）基因重叠v基因重叠基因重叠指不同基因在指不同基因在 核苷酸序列上相互重叠核苷酸序列上相互重叠 的现象。的现象。( (如图如图) )v分析表明
75、：分析表明： A A蛋白蛋白与与B B蛋白；蛋白；D D蛋白蛋白与与E E蛋白蛋白的的 氨基酸序列均是不同的；但其基因碱基序列却具有氨基酸序列均是不同的；但其基因碱基序列却具有一定的重叠性。一定的重叠性。原因：阅读框架发生了变化。原因：阅读框架发生了变化。v在同一段在同一段DNADNA序列上获得不同蛋白质信息的原序列上获得不同蛋白质信息的原因是：因是：采取不同阅读方式的结果。采取不同阅读方式的结果。 即：阅读三联体密码的起始点不同、即：阅读三联体密码的起始点不同、阅读框阅读框架移位所致。架移位所致。v基因重叠现象是否有普遍性目前还在研究中。基因重叠现象是否有普遍性目前还在研究中。vDNADNA
76、和和RNARNA杂交观察及核苷酸序列对比发现：杂交观察及核苷酸序列对比发现：v许多许多真核生物真核生物DNADNA基因片段与其转录基因片段与其转录RNARNA长度不等。长度不等。v原因：原因：v在真核生物基因中存在一段或几段非编码序列在真核生物基因中存在一段或几段非编码序列( (插插入序列）入序列）。即一个结构基因可被插入序列断开形成。即一个结构基因可被插入序列断开形成断裂基因断裂基因。v基因的编码区基因的编码区外显子外显子v基因的非编码区基因的非编码区内含子内含子（二）插入序列（二）插入序列v原核原核mRNA：核苷酸序列是其模板核苷酸序列是其模板DNA序列精确互补链序列精确互补链(无插入及断
77、裂问题无插入及断裂问题)；v真核真核mRNA：其基因是由外显子和内含其基因是由外显子和内含子（插入序列）相间排列而成的，成熟子（插入序列）相间排列而成的，成熟的的mRNA是其前体剪去插入序列后拼接是其前体剪去插入序列后拼接而成。而成。 vmRNA前体前体(前体前体RNA或不均一或不均一RNA，HnRNA) 基因初级转录产物，经加工基因初级转录产物，经加工(如：除去如：除去内含子等内含子等)后的形成成熟后的形成成熟mRNA。（三）回文序列（三）回文序列v一种一种对称性重复序列（反对称性重复序列（反向重复）向重复），多出现在，多出现在DNADNA非编码区非编码区；v在一假想轴的两侧顺同一在一假想轴的两侧顺同一极性阅读，极性阅读，两条链的某些两条链的某些碱基序列是相同的碱基序列是相同的，可表，可表现出现出双重对称。双重对称。v可形成链内可形成链内发卡式结构或发卡式结构或十字结构十字结构( (如图如图) )。v许多许多DNADNA限制性内切酶识别限制性内切酶识别位点为回文结构位点为回文结构End
