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1、色谱学色谱学第二讲第二讲2011年9月26日220082008年年9 9月月罪魁祸首：罪魁祸首：“假蛋白假蛋白”三聚氰胺三聚氰胺(Melamine) C3H6N6 3结石机理结石机理J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 7518-75334色谱技术色谱技术为什么会被添加？为什么会被添加？含氮量高、含氮量高、不易被发不易被发觉觉为什么不易被发觉为什么不易被发觉？检测方法检测方法有漏洞有漏洞如何来检测？如何来检测？56（一）色谱流出曲线术语：分离与柱效，（一）色谱流出曲线术语：分离与柱效， 定性与定量定性与定量 相对保留值相对保留值ri,s 分离因子分离因子分配系数分配系数K和
2、分配比和分配比k1 分配系数分配系数2 分配比分配比(容量因子容量因子)kk可直接从色谱图上获得。可直接从色谱图上获得。组分及固定相一定时组分及固定相一定时,温度增加温度增加,K减小减小?分配系数分配系数K与分配比与分配比k的关系的关系分离因子分离因子与与分配系数分配系数K及及分配比分配比k的关系的关系 最早由最早由Martin等人提出塔板理论，把色等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。标。
3、塔板理论塔板理论塔板理论塔板理论（plate theory）( (二）色谱理论二）色谱理论该理论假定：该理论假定： （i i）在在柱柱内内一一小小段段长长度度H H内内，组组分分可可以以在在两两相相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H H。 （iiii）以以气气相相色色谱谱为为例例，载载气气进进入入色色谱谱柱柱不不是是连连续续进进行行的的，而而是是脉脉动动式式，每每次次进进气气为为一一个个塔塔板板体体积积（VVm m）。）。 （iiiiii）所所有有组组分分开开始始时时存存在在于于第第0 0号号塔塔板板上上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。
4、而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。 （iviv）分分配配系系数数在在所所有有塔塔板板上上是是常常数数，与与组组分分在某一塔板上的量无关。在某一塔板上的量无关。 为简单起见，设色谱往由为简单起见，设色谱往由5 5块塔板（块塔板（n n5 5，n n为柱为柱子的塔板数）组成，并子的塔板数）组成，并以以r r表示塔板编号，表示塔板编号，r=1r=1，22，n nl l；某组分的分配比某组分的分配比k=1.k=1. 根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下： 开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1g）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。
5、当一个板体积（lV）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0.5，其中气液（或气固）两相各为0.25而1号板上所含总量同样为0.5气液（或气固）相亦各为0.25。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。 按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气液两相中的总质量）,由塔板理论可建流出曲线方程：m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔
6、板数。 当流动相体积V=Vr 时，C值最大，即理论塔板数理论塔板数理理论论塔塔板板高高度度色谱柱长度色谱柱长度柱效能柱效能指标指标当当色色谱谱柱柱长长度度一一定定时时，塔塔板板数数 n 越越大大( (塔塔板板高高度度 H 越越小小) )，被被测测组组分分在在柱柱内内被被分分配配的的次次数数越越多多，柱柱效效能能越越高高，所所得色谱峰越窄。得色谱峰越窄。 从从上上两两式式可可以以看看出出，色色谱谱峰峰W W越越小小，n n就就越越大大，而而H H就就越越小小，柱柱效效能能越越高高。因因此，此，n n和和H H是描述柱效能的指标。是描述柱效能的指标。 通通常常填填充充色色谱谱柱柱的的n n1010
7、3 3，H H1mm1mm。而毛细管柱而毛细管柱 n=10n=105 5-10-106 6，H H0.5mm0.5mm 由于死时由于死时t tM M包括在包括在t tR R中中, ,而实际而实际的的t tM M不参与柱内分配不参与柱内分配, ,所计算的所计算的n n值尽大值尽大,H,H很小很小, ,但与实际柱效能相差甚远但与实际柱效能相差甚远. .所以所以, ,提提出把出把t tM M扣除扣除, ,采用采用有效理论塔板数有效理论塔板数n neffeff和有和有效塔板高效塔板高H Heffeff评价柱效能。评价柱效能。 塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱塔板理论用热力学观点形象地描述了
8、溶质在色谱柱塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。但由于它的某些基本还提出了计算和评价柱效的参数。但由于它的某些基本还提出了计算和评价柱
9、效的参数。但由于它的某些基本还提出了计算和评价柱效的参数。但由于它的某些基本假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程，例如，纵假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程，例如，纵假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程，例如，纵假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程，例如，纵向扩能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，向扩能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，向扩能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，向扩能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔也不能说明为什么在不同流速下可以测得
10、不同的理论塔也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数，这就限制了它的应用板数，这就限制了它的应用板数，这就限制了它的应用板数，这就限制了它的应用。 塔板理论的作用与不足作用：1.塔板理论方程式描述色谱流出曲线应该是正态分布函数，与实际记录的色谱流出曲线相符合，对色谱分配系统有指导意义。2.理论塔板数公式：n评价色谱柱是成功的。3.塔板理论提出了塔板高度对色谱峰区域宽度扩张的影响。不足：1.模拟假设条件提出，同实际情况有差异，所以色谱分配定量关系不准确。2.塔板理论不能解释H与色谱峰扩张关系。3.忽略了纵向扩散的作用。4.流速差异所造成不同的塔板数。2 速率理论速率理论影响柱效的因素
11、影响柱效的因素流动相流动相线速度线速度范弟姆特方程范弟姆特方程沈昊宇，沈昊宇， 241) A涡流扩散项涡流扩散项 A A = 2 = 2dpdp dpdp：固定相的平均颗粒直径：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子：固定相的填充不均匀因子 固固定定相相颗颗粒粒越越小小dpdp，填填充充的的越越均均匀匀，A A，H H，柱柱效效n n。表表现现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。 空心毛细管柱：空心毛细管柱：A =0A =0沈昊宇，沈昊宇， 252) B B/ /u u 分子扩散分子扩散项项 B B = 2 = 2 DDg
12、g ：弯曲因子，填充柱色谱，弯曲因子，填充柱色谱，11。 D Dg g：试样组分分子在气相中的扩散系数（：试样组分分子在气相中的扩散系数（cmcm2 2s s-1-1） (1) (1) 存在着浓度差，产生纵向扩散存在着浓度差，产生纵向扩散; ; (2) (2) 扩散导致色谱峰变宽，扩散导致色谱峰变宽，H H(n n) )，分离变差，分离变差; ; (3) (3) 分子扩散项分子扩散项与流速有关与流速有关，流速，流速，滞留时间，滞留时间，扩散，扩散; ; (4) (4) 扩散系数：扩散系数：D Dg g (M M载气载气) )-1/2 -1/2 ； M M载气载气，B B值值。 (5) (5)
13、较低的柱温较低的柱温可以减小可以减小B B3) 传质阻力项传质阻力项Cu 气相传质阻力气相传质阻力固定相颗粒越小固定相颗粒越小气相传质阻力越小气相传质阻力越小 液相传质阻力液相传质阻力固定液粘度及液膜厚度越小固定液粘度及液膜厚度越小液相传质阻力越小液相传质阻力越小4) 流动相线速度对板高的影响流动相线速度对板高的影响气相色谱：气相色谱：H = B/u + Cu液相色谱：液相色谱：H = A + Cu 气相色谱与液相色谱法的气相色谱与液相色谱法的H-uH-u图图 图图18d1说说明明了了柱柱效效和和选选择择性性对对分分离离的的影影响响。图图中中（a）两两色色谱谱峰峰距距离离近近并并且且峰峰形形宽
14、宽。两两峰峰严严重重相相叠叠，这这表表示示选选择择性性和和柱柱效效都都很很差差。图图中中（b）虽虽然然两两峰峰距距离离拉拉开开了了，但但峰峰形形仍仍很很宽宽，说说明明选选择择性性好好，但但柱柱效效低低。图图中中（c）分分离离最最理理想想，说说明明选选择择性性好，柱效也高。好，柱效也高。 四四 分离度分离度分离度作为色谱柱的总分离效能指标，以判断难分离物质分离度作为色谱柱的总分离效能指标，以判断难分离物质对在色谱柱中的分离情况。对在色谱柱中的分离情况。分离度（分离度（R）定义为：定义为：相邻两峰的保留时间之差与两组分峰宽平均值之比相邻两峰的保留时间之差与两组分峰宽平均值之比值，值，R 1时，两峰
15、有时，两峰有 98 以上的分离；以上的分离； R= 1.5时，分离程度可达时，分离程度可达 99 7 。一般用一般用 R=1.5为相邻两峰完全分离的标志。为相邻两峰完全分离的标志。返回R=1.5完全分离完全分离分离度与分离度与k、n及及 的关系的关系 k从从1增加到增加到3，R增加到原来的增加到原来的1.5倍倍 (k: 2-7) n增加到原来的增加到原来的3倍倍，R增加到原来的增加到原来的1.7倍倍 从从1.01增加到增加到1.1，增加约增加约9，R增增 加到原来的加到原来的9倍倍结论结论选择合适的固定相选择合适的固定相(流动相流动相)以增加以增加 是改善分离度最有效的方法是改善分离度最有效的
16、方法1) 各组分的分配系数必须不同。这一条件各组分的分配系数必须不同。这一条件通过选择合适的固定相来实现。通过选择合适的固定相来实现。2) 色谱柱的柱效要高。色谱柱的柱效要高。3) 在保证快速分离的前提条件下，色谱柱在保证快速分离的前提条件下，色谱柱应足够长。应足够长。使试样中的不同组分分使试样中的不同组分分离需要满足的条件离需要满足的条件三三 气气相色谱分析方法及应用相色谱分析方法及应用一一 定性分析定性分析1 用已知纯物质用已知纯物质 对照定性对照定性保留值定性保留值定性峰高增加法定性峰高增加法定性 2 用经验规律和文献值定性用经验规律和文献值定性(1) 经验规律经验规律碳数规碳数规律律在
17、一定温度下，在一定温度下，同系物同系物同系物同系物的调整保留时间的的调整保留时间的对数与分子中碳数成线性关系对数与分子中碳数成线性关系如果知道两种或更多同系物的调整保留时间，则可如果知道两种或更多同系物的调整保留时间，则可求出常数求出常数A和和C。从色谱图查出未知物的。从色谱图查出未知物的 后，根后，根据上式即可求出未知物的碳数。据上式即可求出未知物的碳数。(2) 相对保留值相对保留值3.3.与其他分析仪器联用的定性方法与其他分析仪器联用的定性方法 色质谱联用仪（色质谱联用仪（GC-MSGC-MS；LC-MSLC-MS） 色谱色谱- -红外光谱仪联用仪、原子发射仪等；红外光谱仪联用仪、原子发射
18、仪等； 组分的结构鉴定组分的结构鉴定SampleSampleSampleSample 589058901.0 1.0 DEG/MIDEG/MIN NHEWLETTHEWLETTPACKARDPACKARDHEWLETHEWLETT T PACKARPACKARD D5972A5972AMass Mass SelectivSelective e DetectDetectororD D D DC C C CB B B BA A A A A A A AB B B BC C C CD D D DGasChromatograph(GC)GasChromatograph(GC)MassSpectromet
19、er(MS)MassSpectrometer(MS)SeparationSeparationIdentificationIdentificationB B B BA A A AC C C CD D D D气相色谱联用技术GC-MSMS：利用电磁学原理将样品分子转换为带电荷的气态离子，并按照核质比将其分离并记录下来，从而获得分子结构的方法。质谱单元：真空部分、电离源、质量分析器、检测器气质联用：接口单元色谱仪柱出口压力为105Pa，质谱仪必须保证在高真空度下运行。为了解决压力的不协调性接口。接口方式：开口分流法通入保护气流（He），使色谱柱的末端保持常压，而不会降低系统的分离效率。限阻管具有适当
20、的阻力，仅有一小部分被引入质谱（大部分被放空）。 分子分离器：通过分馏技术，使进入质谱的气流获得富集，以保证较高的灵敏度。 直接连接法：毛细管柱内径细，柱流量小，即使色谱出来的所有气流全部流入质谱系统，真空系统仍可以维持较好的状态。 GC/AES(气相色谱原子发射光谱气相色谱原子发射光谱)二二甲甲基基硒硒烯烯丙丙基基甲甲基基硒硒甲甲基基亚亚磺磺基基硒硒酸酸甲甲酯酯二二甲甲基基二二硒硒2丙丙稀稀硫硫硒硒酸酸甲甲酯酯 1丙丙稀稀硫硫硒硒酸酸甲甲酯酯 双双(甲甲硫硫)硒硒烯烯丙丙基基甲甲基基硫硫二二甲甲基基二二硫硫二二烯烯丙丙基基硫硫烯烯丙丙基基甲甲基基二二硫硫二二甲甲基基三三硫硫二二烯烯丙丙基基二
21、二硫硫烯烯丙丙基基甲甲基基三三硫硫二二烯烯丙丙基基三三硫硫GC-AES同时检测大蒜中碳、硫、硒化合物同时检测大蒜中碳、硫、硒化合物Se(196.1 nm)C(193.1 nm)S(180.7 nm)几种方法联合定性几种方法联合定性化合物化合物GC-MS色谱保留指数色谱保留指数质谱相似度质谱相似度 OV-101柱柱PEG 20M柱柱9号峰定性数据号峰定性数据9851149- -蒎烯蒎烯9349811124香叶烯香叶烯9269861156质谱和保留指数两种鉴定方法的结果质谱和保留指数两种鉴定方法的结果例：缬草挥发油化学成分的研究例：缬草挥发油化学成分的研究多种方法联合定性可大大提高鉴定的可靠性多种
22、方法联合定性可大大提高鉴定的可靠性二二 定量分析定量分析1 定量基础定量基础或或单位峰面积单位峰面积(或单位峰高或单位峰高)的组分的量的组分的量定量校正因定量校正因子子相对校正因子相对校正因子2 常用的几种定量分析方法常用的几种定量分析方法(1)归一化法归一化法试样中所有组分试样中所有组分均须出峰均须出峰要求要求操作条件如进样量、载气流速等操作条件如进样量、载气流速等变化时对结果的影响较小。变化时对结果的影响较小。优点优点组分组分乙苯乙苯对二甲苯对二甲苯 间二甲苯间二甲苯 邻二甲苯邻二甲苯峰面积峰面积12075140105fi0.971.000.960.98校正因子归一校正因子归一化定量结果化
23、定量结果27.017.531.324.1峰面积直接归峰面积直接归一化定量结果一化定量结果27.217.131.823.9C8芳烃异构体归一化定量分析芳烃异构体归一化定量分析 （2 2）外标法）外标法也称为标准曲线法。也称为标准曲线法。特点及要求：特点及要求： 外标法不使用校正因子，准确性较高外标法不使用校正因子，准确性较高， 操作条件变化对结果准确性影响较大。操作条件变化对结果准确性影响较大。 对进样量的准确性控制要求较高，适用对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。于大批量试样的快速分析。或或(3)内标法内标法 对内标物的要求：对内标物的要求：（a）试样中不含有该物质；试样
24、中不含有该物质；（b）与被测组分性质比较接近；与被测组分性质比较接近；（c）不与试样发生化学反应；不与试样发生化学反应；（d）出峰位置应位于被测组分附近，且无出峰位置应位于被测组分附近，且无 组分峰影响。组分峰影响。准确度高准确度高优点优点(a) (a) 内内标标法法的的准准确确性性较较高高，操操作作条条件件和和进进样样量量的的稍稍许许变变动动对对定定量量结果的影响不大。结果的影响不大。(b) (b) 每每个个试试样样的的分分析析，都都要要进进行行两两次次称称量量，不不适适合合大大批批量量试试样样的的快速分析。快速分析。(c) (c) 若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：归一法与内标法归一法与内标法: : 是相对法，与操作条件无关，误差小是相对法，与操作条件无关，误差小外标法外标法: : 简单，是绝对法，与操作条件有关简单，是绝对法，与操作条件有关 内标法特点内标法特点 小结小结
