荧光光度分析法荧光光度分析法Fluorescenceanalysis 概概 述述v光致发光光致发光：有些物质收到光照射时，除吸收：有些物质收到光照射时，除吸收某种波长的光外，还会发出比原来吸收管的某种波长的光外，还会发出比原来吸收管的波长更长的光波长更长的光v荧光荧光（（fluorescence））:物质分子接受光子能物质分子接受光子能量被激发后，从量被激发后，从激发态的激发态的最低最低振动能级振动能级返回返回基态时发出的光基态时发出的光v分子荧光光谱法分子荧光光谱法：又称荧光光谱法或荧光分：又称荧光光谱法或荧光分析法析法,是以物质所发射的荧光强度与浓度之间是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行的线性关系为依据进行定量定量分析分析,以荧光光谱以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行的形状和荧光峰对应的波长进行定性定性分析分析 Ø一种物质能否发射荧光取决于它的分子结构和它所处的环境 v发生荧光的必要条件发生荧光的必要条件 v荧光法与紫外可见法的比较 荧光分析的基本原理v一一 荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生 在在光线照射下光线照射下，一小部分的分子吸收了能量，，一小部分的分子吸收了能量，跃迁至较高能级而成为激发态分子。
这部分跃迁至较高能级而成为激发态分子这部分激发态分子不稳定，在很短的时间内，激发态分子不稳定，在很短的时间内，首先首先因撞击以热的形式损失去掉一部分能量，从因撞击以热的形式损失去掉一部分能量，从所处的激发能级所处的激发能级降至第一电子激发态的最低降至第一电子激发态的最低振动能级振动能级，然后再由这一能级下降至基态的，然后再由这一能级下降至基态的任何振动能级在后一过程中，激发分子以任何振动能级在后一过程中，激发分子以光的形式放出它们所吸收的能量，发出的光光的形式放出它们所吸收的能量，发出的光称为荧光称为荧光 v激发态分子在下降至第一激发态的最低振动激发态分子在下降至第一激发态的最低振动能级后，并不直接由此下降到基态的任何振能级后，并不直接由此下降到基态的任何振动能级，而是转入亚稳态的三重态在这里动能级，而是转入亚稳态的三重态在这里逗留的时间较长（有时长达逗留的时间较长（有时长达1s以上），然后以上），然后再由这里下降到基态的任何振动能级从三再由这里下降到基态的任何振动能级从三重态降到基态所发出的光为磷光重态降到基态所发出的光为磷光v因激发态分子在三重态逗留的时间稍长，有因激发态分子在三重态逗留的时间稍长，有时在入射光光源关闭之后，还存在磷光。
而时在入射光光源关闭之后，还存在磷光而荧光因激发态分子在很短的时间内便下降至荧光因激发态分子在很短的时间内便下降至基态，所以入射光源关闭后荧光立即消失基态，所以入射光源关闭后荧光立即消失 分子的激发态分子的激发态——单线激发态和三线激发态单线激发态和三线激发态 v“三线激发态三线激发态” 比比 “单线激发态单线激发态” 能量稍低但由于电子自旋方向的能量稍低但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态跃迁几率非常小，只相当于单线态 → 单线态过程的单线态过程的 10-6~10-7 分子结构与荧光的关系v发射荧光的两个条件 ① 强的紫外-可见吸收；②一定的荧光效率Ø1.跃迁类型 将一个将一个高原子序数高原子序数的原子引入，常常的原子引入，常常增增强磷光而减弱荧光强磷光而减弱荧光的，双取代和多取代的，双取代和多取代较难预测，但较难预测，但若能增加分子的平面性，若能增加分子的平面性，则荧光增强则荧光增强，反之荧光减弱，反之荧光减弱 荧光光度计 荧光光度计及荧光测定方法荧光光度计及荧光测定方法I0ItF氙灯氙灯(或高压汞灯）或高压汞灯）（（200-800 nm)光电倍增管光电倍增管荧光光度计部件示意图荧光光度计部件示意图 荧光仪部件荧光仪部件激发光源激发光源: 能够在紫外能够在紫外-可见光区连续发光，可见光区连续发光， 常用常用氙灯氙灯、、高压汞灯高压汞灯或或激光光源激光光源.样品池样品池: 石英池石英池, 四壁透明四壁透明.单色器单色器: 两个两个光栅单色器光栅单色器, 分置于样品池前后分置于样品池前后.检测器检测器: 光电池或光电池或光电倍增管光电倍增管, 与激发光与激发光成直角的成直角的 方向方向检测荧光检测荧光. 荧光光度法的应用荧光光度法的应用生物化学分析，生理医学研究，临床检测生物化学分析，生理医学研究，临床检测.v直接测定能产生荧光的物质直接测定能产生荧光的物质. 带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸.v测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质. 荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构； 致癌物同核酸结合常引起显著的荧光；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光； 无机离子（无机离子（Mg2+、、Al3+、、Zn2+、、Be+等）可同试剂形成荧等）可同试剂形成荧光络合物。
光络合物v荧光熄灭法测定猝灭剂荧光熄灭法测定猝灭剂 Ni2+对对Al-PAN络合物有荧光猝灭作用，可测络合物有荧光猝灭作用，可测Ni2+（（ 6×10-5 ～～6×10-3 g·mL-1）） NOHHOOHN=NHOSO3Na8－羟基喹啉－羟基喹啉(Al,Be等等)茜素紫酱茜素紫酱R(Al,F-等等)用于测定无机离子的有机试剂用于测定无机离子的有机试剂C COOHH安息香安息香(B,Zn,Ge,Si等等)黄酮醇黄酮醇(Zr,Sn等等)OOHO 举例举例— 痕量痕量3,4-苯并芘的测定苯并芘的测定: 苯并芘苯并芘萃取（环己酮或石油醚）萃取（环己酮或石油醚）→浓缩浓缩→层析层析→以以H2SO4 溶解苯并芘溶解苯并芘→荧光分析荧光分析荧光测定：荧光测定： ex = 520 nm em= 545 nm 测定方法测定方法—标准曲线法标准曲线法1. 确定确定 ex和和 em (激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱)；；2. 确定适宜的确定适宜的条件条件: 试剂浓度、试剂浓度、pH、、T、、t 等；等；3. 以标准溶液做以标准溶液做工作曲线工作曲线；；4. 测未知样测未知样的荧光强度的荧光强度(F), 根据工作曲线根据工作曲线计算荧光物质的浓度计算荧光物质的浓度. 。