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1、第五章第五章核酸的分离与核酸的分离与检测检测一、核酸的分离、提取通则一、核酸的分离、提取通则核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。 分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。除其他分子污染。分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。个主要步骤。1.细胞裂解胞裂解 机械作用：机械作用：低渗、超声、微波、低渗、超声、微波、冻融裂解和融裂解和颗粒破碎粒破碎等。不适于
2、高分子量等。不适于高分子量长链核酸的分离。核酸的分离。化学作用：化学作用：一定一定pH和和变性条件下，性条件下，细胞破裂，蛋白胞破裂，蛋白变性沉淀，核酸性沉淀，核酸水相。水相。变性条件：性条件：加加热、表面活性、表面活性剂(SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40等等)、强强离子离子剂(异硫异硫氰酸胍、酸胍、盐酸胍等酸胍等)。pH环境：境：强强碱碱(NaOH)或或缓冲液冲液(TE、STE等等)。金属离子螯合金属离子螯合剂(EDTA等等)螯合螯合Mg2+、Ca2+，抑制核酸，抑制核酸酶酶活性。活性。酶酶作用：作用：溶菌溶菌酶酶或蛋白或蛋白酶酶(蛋白蛋白酶酶K、植物蛋白、植物蛋白
3、酶酶或或链酶酶蛋白蛋白酶酶)破裂破裂细胞。降解与核酸胞。降解与核酸结合的蛋白合的蛋白质，促，促进核酸的分离。核酸的分离。联合使用合使用：细胞、待分离核酸胞、待分离核酸类型及后型及后续实验目。目。2.酶酶处理理 裂解液中加入蛋白裂解液中加入蛋白酶酶（蛋白（蛋白酶酶K或或链酶酶蛋白蛋白酶酶），降解蛋白，降解蛋白质；灭活核酸活核酸酶酶（DNase和和RNase）加入加入DNase和和RNase去除不需要的核酸。去除不需要的核酸。 防止核酸的降解和变性防止核酸的降解和变性 防止防止过酸、酸、过碱碱对磷酸二磷酸二酯键的破坏（一般在的破坏（一般在pH4-10下下进行）行）;避免避免剧烈烈搅拌；拌；防止核酸
4、防止核酸酶酶（DNase,RNase）的作用。）的作用。 抑制抑制DNase：可加可加柠檬酸檬酸钠、EDTA等金属螯合等金属螯合剂；或加去；或加去污剂十二十二烷基硫酸基硫酸钠（SDS）；或加蛋白）；或加蛋白变性性剂。抑制抑制RNase：实验器皿高温，或高器皿高温，或高压灭菌，不能高菌，不能高压灭菌的用菌的用具用具用0.1%二乙基焦碳酸二乙基焦碳酸盐（diethylpyrocarbonate,DEPC）处理。理。加加强强的蛋白的蛋白变性性剂如如硫硫氰酸胍酸胍、异硫异硫氰酸胍酸胍等。等。加核糖核酸加核糖核酸酶酶阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasin）等）等RNase的抑的抑制制剂。质粒质粒DNA的提取的
5、提取碱裂解法碱裂解法溶液溶液I：50mM葡萄糖，葡萄糖，25，10mMEDTA，pH8.0Tris-ClpH；葡萄糖；葡萄糖大肠杆菌悬浮；大肠杆菌悬浮；EDTA金属离子螯合剂。金属离子螯合剂。溶液溶液II：0.2NNaOH，1%SDSNaOH碱碱裂解细胞，控制时间，温柔混合裂解细胞，控制时间，温柔混合；SDS结合蛋合蛋白。白。溶液溶液III：3M醋酸钾醋酸钾，2M醋酸醋酸醋酸钾醋酸钾PDS沉淀；沉淀；醋酸醋酸中和碱。中和碱。3.核酸的分离与核酸的分离与纯化化 高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性。物大分子物质更具亲水性。根据
6、理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法。度离心等方法。 酚提取酚提取/沉淀法沉淀法 经典方法是典方法是酚酚:氯仿抽提法仿抽提法。裂解裂解细胞；离心分离含核酸水相；等体胞；离心分离含核酸水相；等体积酚酚:氯仿仿:异戊醇异戊醇(25:24:1体体积)混合液抽提，漩混合液抽提，漩涡振振荡混匀混匀(小分子量核酸小分子量核酸)/颠倒混匀倒混匀(高分子量核酸高分子量核酸)，离心分，离心分离；疏水性的蛋白离；疏水性的蛋白质有机相，核酸有机相，核酸上上层水相。水相。缓冲液冲液饱和酚和酚蛋白蛋白变性；性；氯仿增加有机相比重，仿增加有机相比重，防止酚流入水相；
7、异戊醇可减少操作防止酚流入水相；异戊醇可减少操作过程中程中产生的生的气泡，下气泡，下层的界面更清晰的界面更清晰。核酸核酸盐经有机溶有机溶剂沉淀沉淀浓缩酚、酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀仿抽提后用乙醇沉淀水相加水相加pH5.05.5，终浓度度0.3MNaAc或或KAc（钠离子中和核酸磷酸骨架离子中和核酸磷酸骨架负电荷，在酸性荷，在酸性环境境中促中促进核酸疏水复性），加核酸疏水复性），加22.5倍体倍体积乙醇，乙醇，沉淀核酸。沉淀核酸。离心收集，离心收集，70%乙醇漂洗核酸沉淀除乙醇漂洗核酸沉淀除盐分。分。其他可用于沉淀核酸的有机溶其他可用于沉淀核酸的有机溶剂：异丙醇、聚乙异丙醇、聚乙二醇二醇(PEG)
8、等；等；盐类：10.0mol/L醋酸醋酸铵、8.0mol/L的的氯化化锂、氯化化镁和低和低浓度的度的氯化化锌等。等。分离沉淀分离沉淀DNA层析法层析法 利用物利用物质些理化性些理化性质差异建立的分离分析方法。差异建立的分离分析方法。包括吸附包括吸附层析、析、亲和和层析、离子交析、离子交换层析等。析等。商品商品试剂盒，分离和盒，分离和纯化同步化同步进行。行。一定离子一定离子环境下，核酸被境下，核酸被选择性地吸附到硅土、性地吸附到硅土、硅胶或磁珠等表面与其他生物分子分离。硅胶或磁珠等表面与其他生物分子分离。结合至合至固相固相载体的核酸可用低体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。冲液或水洗脱。核酸核酸质量
9、好、量好、产量高、成本低、快速、量高、成本低、快速、简便、便、节省人力以及易于省人力以及易于实现自自动化。化。Promega质粒纯化系统质粒纯化系统以磁性颗粒为基础：采用磁性技以磁性颗粒为基础：采用磁性技术高通量纯化直接用于转染及其术高通量纯化直接用于转染及其它生物学实验的质粒。它生物学实验的质粒。 以膜为基础：采用硅化膜纯化柱，以膜为基础：采用硅化膜纯化柱，可用离心法进行纯化。可用离心法进行纯化。 以树脂为基础：利用树脂，真空以树脂为基础：利用树脂，真空法。法。 DNA在高盐条件下对硅树脂、膜在高盐条件下对硅树脂、膜的高亲和力。的高亲和力。全自动核酸分离纯化系统全自动核酸分离纯化系统 Roc
10、heMagNAPure96 MagNAPureLC2.0二、核酸含量的测定二、核酸含量的测定 核酸是由磷酸、戊糖、碱基所核酸是由磷酸、戊糖、碱基所组成的核苷酸成的核苷酸的多聚高分子。三者以等分子数而存在，所以的多聚高分子。三者以等分子数而存在，所以只要只要测定三者中任何一定三者中任何一处成分的含量，就可推成分的含量，就可推算出核酸的含量。常用的核酸算出核酸的含量。常用的核酸测定方法有定方法有：紫外吸收法紫外吸收法、定磷法、定糖法、定磷法、定糖法RNA的定量的定量测定：地衣酚法定：地衣酚法DNA的定量的定量测定：二苯胺法定：二苯胺法紫外吸收法中紫外吸收法中DNA或或RNA的定量的定量A260=1
11、.0相当于相当于:50g/ml双双链DNA40g/ml单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸分光光度计分光光度计Biophotometer NanophotometerSingleandmultiwavelengthmeasurementcombinedwithkineticmethods.Thefullwavelengthscan(190nm-1100nm)allowscurveinterpretationforattainmentofmoredetailedscientificknowledgeoverwholespectrum.samplesizeaslowas0.5uL
12、. ThermoScientificNanoDrop2000c(March2,2009) ThermoScientificNanoDrop2000and2000cSpectrophotometers.Theseeasy-to-use,UV-Visinstrumentsenablea5-secondmeasurementtimeofDNA,RNAandproteinsonasamplesizeaslowas0.5uL.核酸纯度鉴定核酸纯度鉴定A260/A280DNA纯品品:A260/A280=1.8RNA纯品品:A260/A280=2.0电泳泳核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 当前核酸研究中最常用的
13、方法，常用于当前核酸研究中最常用的方法，常用于检测核酸核酸的分子量、的分子量、纯度、度、结构构变化、序列分析等化、序列分析等 种种类：琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳（水平泳（水平电泳）泳）聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳（垂直泳（垂直电泳，泳，分辨率可达分辨率可达1bp常用于常用于测序）序）核酸样品的保存核酸样品的保存 DNA：DNA样品溶于品溶于pH8.0的的TE，4或或-20保存；保存；长期保存期保存样品中可加入品中可加入1滴滴氯仿。仿。RNA：RNA样品溶于品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸或双蒸灭菌菌水中，水中，-70保存保存;长期保存可以沉淀形式期保存可以沉淀形式贮于乙醇中于乙醇
14、中;在在RNA溶液中，加溶液中，加1滴滴0.2mol/LVRC(氧氧钒核糖核核糖核苷复合物苷复合物)冻贮于于-70,可保存数年。可保存数年。三、核酸的检测三、核酸的检测PCR：常：常规PCR、RT-PCR、荧光定量光定量PCR杂交：膜交：膜杂交（交（SouthernBlot、NorthenBlot）、）、组织样品原位品原位杂交交1.荧光定量光定量PCR（realtimePCR）1996，美国，美国Appliedbiosystems公司推出：在公司推出：在PCR反反应体系中加入体系中加入荧光基光基团，利用，利用荧光信号光信号积累累实时监测整个整个PCR进程。程。 克服了克服了终点点PCR法法进入
15、平台期或叫入平台期或叫饱和期后定量和期后定量的的较大大误差，差，实现DNA/RNA的精确定量。的精确定量。目前确定目前确定样品中品中DNA(或或cDNA)拷拷贝数最敏感、最数最敏感、最准确的方法。准确的方法。灵敏度和特异性高、能灵敏度和特异性高、能实现多重反多重反应、自、自动化程化程度高、无度高、无污染、染、实时和准确。和准确。与常与常规PCR的区的区别常常规PCR：PCR结束后束后对终点点产物物进行定量分析。行定量分析。实时定量定量PCR：实时检测PCR扩增，在增，在扩增的指数增的指数期期对起始模板起始模板进行定量。行定量。两个重要概念两个重要概念荧光域光域值（threshold）：）：是在
16、是在荧光光扩增曲增曲线上人上人为设定的一个定的一个值，它可以，它可以设定在定在荧光信号指数光信号指数扩增增阶段任意位置上段任意位置上，一般，一般荧光域光域值的的设置是基置是基线荧光信号的光信号的标准偏差的准偏差的10倍。倍。Ct值（Cyclesthreshold）：每个反：每个反应管内的管内的荧光光信号到达信号到达设定的域定的域值时所所经历的循的循环数数.Ct值与模板与模板DNA的起始拷的起始拷贝数成反比数成反比。荧光定量光定量PCR化学原理化学原理非特异性非特异性荧光光标记：SYBRGreen特异性特异性荧光光标记：TaqMan SYBRGreenI荧光染料的作用原理光染料的作用原理 SYB
17、RGreenI：结合于双合于双链DNA小沟。小沟。PCR反反应体系中，体系中，SYBR荧光染料特异性地光染料特异性地掺入入DNA双双链后，后，发射射荧光信号，而不光信号，而不掺入入链中的中的SYBR染染料分子不会料分子不会发射任何射任何荧光信号。光信号。优点：与所有双点：与所有双链DNA结合，不必因合，不必因为模板不同模板不同而特而特别定制定制通用性；价格相通用性；价格相对较低；一个低；一个PCR产物可以与多分子的染料物可以与多分子的染料结合，灵敏度很高。合，灵敏度很高。缺点：能与非特异性双缺点：能与非特异性双链DNA（如引物二聚体）如引物二聚体）结合。需要熔解曲合。需要熔解曲线分析。分析。S
18、YBRGreen熔解曲熔解曲线分析分析TaqMan探探针法法TaqMan探探针是一种寡核苷酸探是一种寡核苷酸探针，设计为与目与目标序列上游和下游引物序列上游和下游引物间的序列配的序列配对。荧光基光基团连接在探接在探针的的5末端，而淬末端，而淬灭剂则在在3末端。当末端。当探探针保持完整保持完整时，3端猝端猝灭基基团抑制抑制5发射基射基团的的荧光光发射。在射。在PCR的退火期。探的退火期。探针模板模板发生特异生特异性性杂交。延伸期引物在交。延伸期引物在Taq酶酶作用下延伸，到达探作用下延伸，到达探针处，Taq酶酶有有53外切核酸外切核酸酶酶活性，切割探活性，切割探针，荧光光发射基射基团远离猝离猝灭
19、基基团，荧光信光信释放。随着放。随着扩增循增循环数的增加，数的增加，荧光基光基团不断不断积累。即累。即荧光光强强度与度与扩增增产物的数量呈正比关系。物的数量呈正比关系。优点点：特异性高、重复性好、阴性：特异性高、重复性好、阴性结果确果确定、引物定、引物设计相相对简单公司网站公司网站缺点：只是用于一个靶基因，成本高。缺点：只是用于一个靶基因，成本高。定量方法定量方法绝对定量：确定定量：确定样品中某一核酸序列的拷品中某一核酸序列的拷贝数。数。相相对定量：定量：样品中某一核酸序列相品中某一核酸序列相对与与对照照样本中同一核酸序列的表达。本中同一核酸序列的表达。绝对定量绝对定量 通通过标准品定量准品定
20、量绝对定量的定量的标准准样品：已知拷品：已知拷贝数的数的质粒粒DNA，做系列稀做系列稀释。标准准样品的种品的种类：含有和待：含有和待测样品相同品相同扩增片段增片段的克隆的克隆质粒、含有和待粒、含有和待测样品相同品相同扩增片段的增片段的cDNA、PCR的的产物物相对定量相对定量通过内标定量通过内标定量内内标（EndogenousControl）通常是）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因靶基因表达的相靶基因表达的相对量以靶基因相量以靶基因相对其内其内标的的CT表示：表示：CT=靶基因靶基因CT-GAPDHCT 不同不同样本靶基因表达的差异以本靶基因表达的差异以CT表示，由最
21、高表示，由最高CT与其他各与其他各CT分分别相减而得。相减而得。靶基因表达的相靶基因表达的相对倍数以倍数以2-CT表示。表示。阶段段P311平均平均CTGAPDH平均平均CTCTCTE14.523.650.2916.490.077.160.25-0.65E16.523.010.4916.590.256.420.24-1.39E18.524.460.8818.010.656.450.22-1.36P524.790.6219.430.145.360.48-2.45P1123.500.9518.920.704.570.25-3.44P1424.180.8919.420.864.760.11-3.25
22、P3027.320.6019.510.257.810.280实时PCR显示示P311在肺在肺发育不同育不同阶段的表达段的表达 小鼠肺小鼠肺发育不同育不同阶段段P311mRNA的表达的表达 Bio-RadiQ5TM荧光定量光定量PCR仪ABIPrism7500型型荧光定量光定量PCR仪2.核酸核酸杂交交膜膜杂交交SouthernBlotDNANorthernBlotRNAWesternBlotProtein组织切片切片杂交交InsituHybridizationDNA/RNAImmunohistochemistryProtein主要杂交模式：主要杂交模式：膜杂交膜杂交原理：核酸原理：核酸变性和复
23、性性和复性杂交在持膜上交在持膜上进行行核酸印迹核酸印迹杂交交 分分类：DNA印迹印迹杂交（交（Southernblot）RNA印迹印迹杂交（交（Northernblot） 核酸杂交的基本过程核酸杂交的基本过程制制备样品品待待检测组织样品：品：动、植物器官、植物器官、组织，培养，培养细胞，胞，细菌，病毒等菌，病毒等核酸：分离提取核酸：分离提取DNA（RNA）酶酶切：限制性内切切：限制性内切酶酶消化消化DNA电泳：凝胶泳：凝胶电泳分离泳分离酶酶切切DNA混合物混合物DNA变性：性：获得得单链DNA转膜膜 ：将核酸：将核酸样品品转移到支持膜上移到支持膜上(硝酸硝酸纤维素膜、素膜、尼尼龙膜膜) 限制性
24、内切限制性内切酶酶消化消化DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳变性、转膜变性、转膜制备探针制备探针 探探针（probe）:互互补于靶基因于靶基因顺序的序的单链DNA或或RNA片段，通常片段，通常带有有标记物如：物如：放射性同位素、放射性同位素、荧光化合物或半抗原地高光化合物或半抗原地高辛等，以辛等，以检测目的基因。目的基因。 杂杂 交交杂杂 交交 炉炉杂交原理杂交原理漂洗、检测漂洗、检测检测结果检测结果Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)53正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析Southe
25、rnBlot：基因的有无：基因的有无遗传病、感染性疾病等病、感染性疾病等+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析电电泳泳方方向向限制性片段限制性片段长度多度多态性性菌落原位菌落原位杂交交筛选目地基因目地基因斑点杂交斑点杂交 NorthernBlot：基因表达的半定量分析：基因表达的半定量分析原位原位杂交交 应应用用已已知知碱碱基基顺顺序序并并带带有有标标记记物物的的核核酸酸探探针针与与组组织织、细细胞胞中中待待检检测测的的核核酸酸进进行行杂杂交交，再再用用与与标标记记物物相相应应
26、的的检检测测系系统统，通通过过放放射射自自显显影影、组组织织化化学学或或免免疫疫组组织织化化学学方方法法在在被被检检测测的的核核酸酸原原位位形形成成带带颜颜色色的的杂杂交交信信号号，在在显显微微镜镜或或电电子子显微镜下进行细胞内定位的技术。显微镜下进行细胞内定位的技术。1）原位）原位杂交的分交的分类根据所用探根据所用探针和靶核酸的不同：和靶核酸的不同：DNA-DNA杂交、交、DNA-RNA杂交、交、RNA-RNA杂交交根据探根据探针的的标记物是否直接被物是否直接被检测：直接法直接法放射性同位素、放射性同位素、荧光及某些光及某些酶酶标记探探针间接法接法半抗原半抗原标记探探针，免疫，免疫组织化学法
27、化学法对半抗原定位半抗原定位DNA-DNA杂交交 灵敏度灵敏度较低。低。主要用于外源性基因主要用于外源性基因检测（病毒的（病毒的检测）。）。杂交交时需需先先在在高高温温80-95短短时处理理，使使DNA探探针及及细胞胞内内靶靶DNA变性性，解解离离成成单链，迅迅速速置置于冰上冷却。然后置于于冰上冷却。然后置于3742杂交交过夜。夜。 宫颈息肉息肉HPVDNA探探针原位原位杂交交人人类染色体端粒染色体端粒DNA的的荧光原位光原位杂交交DNA-RNA杂交交 灵灵敏敏度度高高（cDNA中中无无内内含含子子、高高度度重复序列；无靶基因自身复性）重复序列；无靶基因自身复性）cDNA探探针制制备困困难RN
28、A-RNA杂交交避避免免了了应用用双双链DNA探探针在在杂交交反反应中中存存在在的的两条两条链之之间的复性和第二条的复性和第二条链的的竞争性争性杂交交问题cRNA-RNA杂交交体体较DNA-DNA、cDNA-RNA稳定定，在在杂交交后后可可用用RNA酶酶除除去去未未结合合的的探探针，因此特异性更因此特异性更强强。灵敏度灵敏度较高高RNA原位原位杂交交检测和分析的主要和分析的主要为内源性基内源性基E18.5lung-VEGF2）RNA原位核酸原位核酸杂交方法交方法uDNA-RNA杂交交uRNA-RNA杂交交原位杂交技术的基本方法原位杂交技术的基本方法 杂交交前前准准备：取取材材、固固定定、玻玻片
29、片和和组织切切片片处理理（增（增强强探探针的穿透性、减低背景染色、的穿透性、减低背景染色、RNase等）等）杂交：一定温度下，探交：一定温度下，探针与靶与靶RNA的的结合合杂交后交后处理：去除未理：去除未杂交探交探针显示示：放放射射自自显影影和和非非放放射射性性标记的的组织化化学学或或免疫免疫组织化学反化学反应显示示杂交交结果果取材取材新新鲜组织、细胞；尽快冷胞；尽快冷冻或固定或固定杂交前所有用具交前所有用具RNasefree固定固定 目目的的：保保持持细细胞胞形形态态结结构构，最最大大限限度度地地保保存存细细胞内胞内RNA水平；使探针易于进入细胞或组织。水平；使探针易于进入细胞或组织。最最常
30、常用用多多聚聚甲甲醛醛（4%）固固定定组组织织，因因其其不不会会与与蛋蛋白白质质产产生生广广泛泛的的交交叉叉连连接接，不不会会影影响响探探针针穿穿透入细胞或组织。透入细胞或组织。醋酸、酒精的混合液和醋酸、酒精的混合液和Bouins固定剂固定剂包埋、切片包埋、切片 石石蜡蜡切切片片：固固定定组组织织用用PBS冲冲洗洗后后，经经梯梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片。度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片。冰冰冻冻切切片片：组组织织固固定定后后，30%蔗蔗糖糖处处理理过过夜，夜，OCT包埋、切片，包埋、切片，-80保存备用。保存备用。OCT-optimumcuttingtemperaturecom
31、pound聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物性混合物在冰冻切片时支撑组织，以在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。折及碎裂。漂片时可溶于水，不增加背漂片时可溶于水，不增加背景染色。景染色。全自动脱水机（全自动脱水机（TissueProsessing）石蜡组织包埋机（石蜡组织包埋机（Embedding）包埋用具包埋用具包埋后的组织蜡块包埋后的组织蜡块石蜡切片机（石蜡切片机（Microtome）展片机展片机冰冰冻切片机切片机（Cyrostat）探针的制备探针的制备 特异性特异性cDNA探针：探针：制备困难制备困难cRNA探针：探针：
32、以以cDNA为模板，体外转录获得，单为模板，体外转录获得，单链探针，链探针，cRNARNA杂交体稳定；杂交体稳定；RNase敏感敏感人工合成寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸探针：DNA合成仪合成，不需合成仪合成，不需要纯化，组织穿透性极好；长短控制，过长要纯化，组织穿透性极好；长短控制，过长错配，过短错配，过短特异性差特异性差探针长度：探针长度：500碱基碱基探针标记方法探针标记方法末端标记法：末端标记法：将标记物导入线型将标记物导入线型RNA的的5端或端或3端，适用于合成寡核苷酸探针的标记，一般携带端，适用于合成寡核苷酸探针的标记，一般携带的标记分子较少。的标记分子较少。体外转录法：体外转录法：
33、模板模板线性化质粒线性化质粒DNA/PCR产物产物（含（含T7、T3或或SP6启动子），启动子），RNA聚合酶，聚合酶，NTP（一种标记带标记）所有的（一种标记带标记）所有的RNA就被标记。就被标记。末端标记法末端标记法碱性磷酸碱性磷酸酶酶T4多聚核苷酸激多聚核苷酸激酶酶T4多核苷酸激多核苷酸激酶酶是一种磷酸化是一种磷酸化酶酶，可将，可将ATP的的g-磷酸基磷酸基转移至移至DNA或或RNA的的5末端。末端。 体外转录基因克隆载体体外转录基因克隆载体体外转录标记体外转录标记标记物标记物同位素同位素 非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧
34、光素性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素 直直接标记、间接标记接标记、间接标记地高辛标记技术地高辛标记技术Digoxigenin（DIG），源于从洋地黄类植物中提），源于从洋地黄类植物中提取的类固醇。洋地黄花和叶片为取的类固醇。洋地黄花和叶片为Digoxigenin在自在自然界中的唯一来源，抗然界中的唯一来源，抗DIG的抗体不会与其他的的抗体不会与其他的生物物质结合，高特异性。生物物质结合，高特异性。灵敏度高。灵敏度高。DIG检测灵敏度接近同位素而无放射检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之苦。生物素
35、则没有样本内源干扰之苦。地高辛的结构地高辛的结构StructureofAlkali-liableDigoxigenin(DIG)-dUTPAP（碱性磷酸（碱性磷酸酶酶）标记抗抗-DIG抗体抗体检测碱性磷酸酶显色试剂碱性磷酸酶显色试剂 BCIP/NBTBCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)5-溴溴-4-氯-3-吲哚基基-磷酸磷酸盐NBT(四四唑硝基硝基蓝)是是碱性磷酸碱性磷酸酶酶最佳的底物最佳的底物组合之一。合之一。在碱性磷酸在碱性磷酸酶酶的催化下，的催化下，BCIP会被水解而会被水解而产生生强强反反应性的性的产物，物，该产物与物与NBT发生反生反应，
36、形成不，形成不溶性的深溶性的深蓝色至色至蓝紫色化合物。紫色化合物。相关设备相关设备杂交炉杂交炉杂交杂交脱蜡脱蜡：二甲苯脱蜡：二甲苯脱蜡，逐级梯度酒精，逐级梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)清洗，蒸馏水洗。清洗，蒸馏水洗。固定固定通透通透：蛋白酶（蛋白酶：蛋白酶（蛋白酶K/proteinaseK，链霉蛋白，链霉蛋白酶酶/pronase和胃蛋白酶和胃蛋白酶/pepsin)消化包围靶消化包围靶RNA的的蛋白质，促进探针渗透，提高杂交信号。过度消蛋白质，促进探针渗透，提高杂交信号。过度消化引起细胞形态结构的破坏、靶核酸的减少、导化引起细胞形态结构的破坏、靶核酸的减少、导致标本从载玻片上的脱落。致标本从载玻片上的脱落。再固定再固定酸酸酐处理：防止探理：防止探针与与组织中碱性蛋白之中碱性蛋白之间的的静静电结合，以降低背景合，以降低背景 脱水脱水预杂交交：阻断玻片和：阻断玻片和标本与探本与探针的非特异性的非特异性结合减低背景合减低背景杂交：探交：探针变性，性，过夜，温度、湿度夜，温度、湿度洗洗涤：SSC缓冲液洗除未冲液洗除未杂交探交探针显色：抗体（色：抗体（anti-dig-ap碱性磷酸碱性磷酸酶酶）孵）孵育，底物育，底物显色；复燃（色；复燃（苏木精、快木精、快绿）脱水、封片脱水、封片
