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1、1.引言喜树碱是四十多年前发现一种植物抗癌药物。拓扑异构酶是一种非常重要的DNA操作酶，是唯一知道的喜树碱的靶点，它结合在共价蛋白核酸复合物的界面。这主要与喜树碱的化学与生物学的三个方面有关：一是以拓扑异构酶为靶点合成的喜树碱抗肿瘤衍生物，二是由拓扑异构酶抑制剂诱导的细胞死亡机制，三是拓扑异构酶抑制剂靶点所对应的特定的DNA序列。作为设计抗癌药物的首选天然产物，或是作为研究拓扑异构酶对DNA新陈代谢的实验工具。20-(S)-Camptothecin (CPT)最早是在1966年，由美国的Wall等从中国特有的珙桐科植物喜树中提取到的，由美国国立肿瘤研究所（NCI）动物模型上证实其抗肿瘤作用，并
2、将其水溶性钠盐用于临床试验。在过去的四十年，从大量的植物科中发现了这种单萜吲哚类生物碱，包括茜草科、夹竹桃科、钩吻科、茶茱萸科等。尽管有抗肿瘤的活性，但是后来发现碱处理开环后药物活性明显下降，同时还伴随着严重的毒性反应包括严重的腹泻、出血性膀胱炎，使得CPT类化合物的临床研究就此中断。1985年发现CPT特异作用于核内蛋白拓扑异构酶。二十年后，拓扑异构酶仍是已知的CPT的唯一靶点，这使得这种生物碱成为真正的靶点抗癌制剂。2.喜树碱：拓扑异构酶-DNA复合体的分子钳DNA拓扑异构酶是生物体内及其重要的细胞核内酶，参与DNA复制、转录、重组和修复等所有关键的核内过程。拓扑异构酶为单体性100kDa
3、的多肽，由染色体20q1213.2位基因编码，可松解过度卷曲的DNA双链，以利于复制及转录的进行。酶先与DNA结合，成为可断裂复合物，在DNA磷酸二酯键上形成一个单链缺口，让未受损的单链从缺口中回转，使DNA松弛，以利于复制或转录，随后将缺口连接。CPT类化合物的作用机制是参与Topo作用过程中与DNA形成的“可切割复合物”，阻碍DNA链的闭合，导致细胞DNA单链断裂（SSB），这种单链断裂对细胞来说并不是致死性的，当可切割复合物与正在进行复制的DNA复制又相遇时，会继发性的造成不可逆的DNA双链断裂（DSB），最终引起细胞死亡。 因此，S期细胞对CPT类化合物特别敏感。另外，CPT稳定的可切
4、割复合物也作用于RNA聚合酶的转录过程，抑制RNA的合成，在DNA模板链形成不可逆的单链断裂，并在启动子区域引起少量双链断裂。 3. CPT衍生物的设计：永无止境根据在A-B、C-D、E环上取代基位置的不同，可以将CPT衍生物分成三类。第一类：A-B环的修饰。早期发现，A-B环被取代后不丧失活性。这个二元环上可以被许多官能团取代，特别是在7位、9位和10位上，尽管会保留甚至在某些情况下会提高天然产物的细胞毒性。当前已经研发了两种主要的抗癌药拓扑替康和伊立替康，并且已经用于临床。拓扑替康（拓扑替康（TPT），又名拓泊替康、和美新，结构如图。本品为CPT半合成衍生物，作用靶点为Topo，为S期抗肿
5、瘤药。临床前研究表明，TPT抗肿瘤谱较广，对L1210和P338白血病小鼠的活性及在体内抗Lewis肺癌和B-16黑色素瘤的作用均优于CPT。在人结肠癌异体移植物，TPT可以诱导肿瘤消退及延缓其生长。1996年，美国FDA批准其为治疗卵巢癌的二线药物。2000年，被批准为治疗小细胞肺癌的二线药。 不良反应：1.骨髓抑制：中性粒细胞下降、血小板减少、贫血等，为主要限制性毒性。2.胃肠道反应：恶心、呕吐、腹泻、便秘、肠梗阻、腹痛、口腔炎、厌食等。3.皮肤反应：脱发，偶见严重的皮炎及瘙痒。4.神经肌肉反应：头痛、关节痛、肌肉痛、全身痛、感觉异常。5.呼吸系统反应：可致呼吸困难。 6.肝脏：有时出现肝
6、功能异常，转氨酶升高。7.全身反应：乏力、不适、发热等。8.局部刺激：静脉注射时，若漏出血管外可产生局部刺激、红肿。伊立替康（伊立替康（CPT-11）：又名开普拓，结构如图。1998年，被批准与5-FU（5-氟尿嘧啶）和叶酸联用，作为治疗转移性结肠癌的一线药物，现在也是治疗非小细胞肺癌的一线药物。CPT-11是一个水溶性前药，在体内被羧酸酯酶代谢成活性形式SN-38，结构如图。SN-38是主要活性代谢产物，其活性比CPT-11强1001000倍。SN-38经肝脏尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDP-GT）生成葡萄糖醛酸化SN-38（SN-38G）。当SN-38G分泌进入肠道，肠道中细菌的-葡萄糖
7、醛酸酶又能使之变回SN-38。存在药物的肝肠循环。 不良反应：1.胃肠道：迟发性腹泻（给药24h后发生的腹泻）、恶心与呕吐、厌食、腹痛及黏膜炎。2.血液学：中性粒细胞减少。3.急性胆碱能综合症：主要症状为：早发性腹泻及其他症状，如用药后第一个24小时内发生：腹痛、结膜炎、鼻炎、低血压、血管舒张、出汗、寒战、全身不适、头晕、视力障碍、瞳孔缩小、流泪、流涎增多，以上症状于阿托品治疗后消失。4.其它作用：早期的反应如呼吸困难、肌肉收缩、痉挛及感觉异常等均有报道。 除了拓扑替康和伊立替康，还有很多A环和B环上被取代的CPT衍生物，如图：第二类：C-D环的修饰。对于C环和D环的衍生物，他们一般没有活性或
8、比CPT的活性低很多。在这一类中，唯一用于临床开发的是C环修饰的衍生物DRF-1042，在5位有一个取代基，现在已经进行到临床期开发阶段。第三类：E环的修饰。A-B环或C-D环的修饰往往是增加CPT的水溶性，并且减少内酯环E环开环形成无活性的羧化物形式。在以往的研究中，对CPT内酯环E环的改造都会造成化合物失活，因此一直以来认为，E环是CPT的活性必须基团，在结构修饰中一般都避免对E环的改造，而新一代的高喜树碱，用七元环替代了六元内酯环，能消除E环的分子内氢键，降低羰基活性。其中，二氟取代物Diflomotecan（BN280915）结构如图。它是一种口服的拓朴异构酶抑制剂，在临床期开发阶段，
9、在体内的稳定性较topotecan好，副作用特别是胃肠道毒性似更少。另外，发现该类化合物中的BN280927兼有抑制Topo和Topo两种酶的作用，但不形成Topo可切割复合物。该化合物对G0期的肿瘤细胞也有明显的抑制作用，细胞水平的IC50低于SN38，并且对SN38的耐药株也有很强的细胞毒作用。 4.DNA修复或细胞死亡Topo介导的DNA损伤的修复机制是复杂的，同源重组在DNA损伤中起着重要作用。Topo介导的DNA损伤也涉及其它的DNA修复复合物，比如与TopoIII相关的ReqQ解旋酶参与的碱基切除途径。喜树碱类药物为细胞周期特异性药物，主要作用于S期，并对G2+M期边界有延缓作用；
10、它能够抑制DNA Topo将DNA断端重新接上的正常功能，并进一步造成DNA链的断裂损伤，从而控制DNA复制，阻断RNA合成（即转录）、干扰细胞分裂周期（延迟G2期），最终导致癌细胞的死亡。当DNA损伤超过DNA修复的时候，细胞就会不可避免的趋向死亡。迄今为止，最好的描述由CPT诱导的细胞死亡机制称为细胞凋亡。Caspases（半胱天冬酶，胱门蛋白酶）（半胱天冬酶，胱门蛋白酶）是一类蛋白裂解酶，在细胞内以无活性的酶原形式存在。半胱天冬酶具有半胱氨酸激活位点和底物裂解位点，当作用于胞内特异性底物后将引起细胞凋亡。但当它们被激活后并不会降解胞内的所有蛋白，相反，它们只会选择性的作用于自身的靶蛋白，
11、在靶蛋白一级结构中Asp（天冬氨酸）残基的位置之后将靶蛋白裂解，介导细胞发生凋亡。5.拓扑异构酶介导DNA断裂的序列特异性靶点Topo毒剂可以作为抗生素直接作用于细菌的Tope，也可以作为抗肿瘤制剂直接作用于真核生物的酶类。但是，一些局限性阻碍了它们的广泛应用。毒性是重要的不需要的次生效应。比如，TopoII毒剂，会因为化疗引起白血病。这些副作用与Tope有非常弱的序列特异性有关在裂解位点周围只有一个或两个碱基。比如，对于CPT来说，只在T和G之间断裂。因此，化学家们正致力于增加这些药物的特异性。一种策略是，通过使用前体药使药物只在肿瘤细胞处释放。另一种策略是，将药物共价结合到DNA配体上，然
12、后再将这个特异性序列结合到DNA上，从而增加DNA的特异性。 第二种策略的图解6.喜树碱类化合物的构效关系A、B、C环：1）在C-7、9、10位及11位引入不同的取代基，特别是7位和10位引入双取代基，可干扰喜树碱开环形式及喜树碱与人血清白蛋白的结合，从而提高内酯在体内的稳定性。2）在C-7、9；C-9、10；C-10、11间增加一个环，虽然不能增加内酯环的稳定性，但能增加体内和体外的肿瘤活性。3）在C-5、12、14位取代则活性降低或丧失。4）B环饱和，几乎无活性。D、E环：1）20位的氧为活性必需，内酯环氧被氮或硫取代，活性丧失。2）D环吡啶酮为抗肿瘤活性必需。3）20（S）异构体较20（
13、R）异构体活性强10100倍。4）E环扩环成七元内酯环，形成高喜树碱能消除E环的分子内氢键，降低羰基活性。 5）E环羟基可以酯化，以增大羰基的位阻并破坏分子内氢键。其引入脂肪族氨基酸、大分子或糖均能增加药物的稳定性和水溶性。6）去除E环的AD四元环衍生物活性降低或丧失，说明喜树碱的内酯环是其抗肿瘤的关键部位。第九章第九章 靶向胸苷酸合成酶的抗叶靶向胸苷酸合成酶的抗叶酸药物的癌症治疗酸药物的癌症治疗1.引言四氢叶酸衍生物是细胞一碳代谢中的重要辅酶。在某些氨基酸、嘌呤和嘧啶的生物合成反应中，四氢叶酸衍生物作为各种酶的特殊底物，提供羟甲基、甲酰基和甲基等一碳单位，发挥着重要作用。抗叶酸药物是以叶酸依
14、赖性酶为靶点，设计合成的与这些酶的特殊底物（即叶酸辅酶）结构相似的一类化合物，它们和酶结合后可阻止正常底物与酶的结合，从而干扰细胞的叶酸代谢和一碳代谢一些抗叶酸药物通过阻断DNA生物合成中所需的嘌呤和嘧啶核苷酸的生物合成，导致肿瘤细胞的死亡，在临床上用作抗肿瘤药物。最早用作抗肿瘤药物靶点的叶酸依赖性酶是二氢叶酸还原酶（DHFR）。DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，然后在其他酶的作用下生成四氢叶酸的各种活性衍生物。因此，它在叶酸代谢循环中处于中心地位。 例如，抗叶酸药物甲氨蝶呤（MTX），它作为一种叶酸还原酶抑制剂，主要抑制二氢叶酸还原酶而使二氢叶酸不能还原成有生理活性的四氢叶酸，从而使嘌呤核
15、苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成过程中一碳基团的转移作用受阻，导致DNA的生物合成受到抑制。主要用于儿童急性白血病和绒毛膜上皮癌，可作为免疫抑制剂应用。 胸苷酸合成酶作为抗癌药物的靶点胸苷酸合成酶（TS）系有相同亚基构成的同源二聚体胞浆酶，它参与体内DNA生物合成所需的胸腺嘧啶核苷酸的起始合成过程，是该过程的限速酶。TS催化脱氧尿苷一磷酸（dUMP）的甲基化反应，生成脱氧胸苷一磷酸（dTMP），在此过程中，5,10-亚甲基四氢叶酸提供甲基。此后dTMP发生磷酸化形成脱氧胸苷三磷酸（dTTP），后者是DNA生物合成的必需物质。这是细胞内从头合成dTTP的唯一途径，因此TS是肿瘤化疗的一个关键靶点，抑制
16、TS将导致细胞“无嘧啶死亡”。根据TS的结合特性，其抑制剂可分为嘧啶类似物（与TS底物位点结合）、叶酸类似物（与TS辅酶位点结合）及具有独特结构的TS抑制剂（它们不与底物结合位点和辅酶结合位点结合，但具有TS抑制活性）3类。嘧啶类似物嘧啶类似物TS抑制剂：抑制剂：5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-FU）：）：该药首先在体内转变成氟尿嘧啶脱氧核苷酸与TS结合，再与辅酶5,10-亚甲基四氢叶酸作用，由于氟尿嘧啶脱氧核苷酸C-F键很稳定，导致不能有效地合成胸腺嘧啶脱氧核苷酸，使TS失活，从而抑制DNA的合成，最后导致肿瘤细胞死亡。氟尿嘧啶是目前临床上应用最广的抗嘧啶类药物，对多种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、
17、卵巢癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌等均有一定疗效。叶酸类似物叶酸类似物TS抑制剂：抑制剂：CB3717 ：是第一种有较高选择性的叶酸结构类似物TS抑制剂，在I期临床试验中表现出显著的抗肿瘤活性，在体外抗肿瘤试验证明其对卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及间皮癌都有明显效果。但后来发现CB3717有非常严重的肝肾毒性并致强烈的机体反应，因此该化合物退出了临床研究。尽管如此，CB3717是叶酸类似物TS抑制剂的一个里程碑，它的成功合成为其它叶酸类似物TS抑制剂的开发提供了先导。 雷替曲塞：雷替曲塞是由英国的Royal Marsden医院的癌症研究署与Zeneca药厂共同合作发展的药物。它是一种叶酸的衍生物，可以与
18、胸腺嘧啶合成酶（TS）结合而抑制其作用。现已有10多个国家将雷替曲塞作为晚期结直肠癌的一线用药。3项期临床研究已报告该药单药治疗结直肠癌的效能。它对结肠直肠癌细胞系的抑制作用强于5-氟尿嘧啶，并且毒副作用比5-氟尿嘧啶少。期实验已评估雷替曲塞单药治疗其他肿瘤的效果。在乳腺癌（26%）、卵巢癌（7%）、小细胞肺癌（9%）和胰腺癌（12%）病人中，已观察到完全反应和部分反映。雷替曲塞和5-FU各自均能有效的治疗晚期结直肠癌，两者联用可产生协同作用。 不良反应：静脉滴注本品后常见副作用为血液毒性包括骨髓抑制，中性粒细胞减少、血小板减少等，胃肠道副作用最常见有恶心、呕吐、腹泻，食欲不振。较少见黏膜炎、
19、口炎（包括口腔溃疡）、消化不良和便秘，一般患者耐受性良好，副作用发生率较低。 培美曲塞：培美曲塞是一个多靶点抗叶酸细胞毒药物，其作为一个广谱、高效、低毒的分子靶向治疗药物，受到临床广泛关注。作用机制：培美曲塞主要通过抑制叶酸代谢途径中多个关键酶的活性，影响嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的生物合成，进而影响肿瘤细胞DNA合成，抑制细胞增殖。其作用靶点包括胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和甘氨酰胺核苷甲酰基转移酶等叶酸依赖性酶，造成叶酸代谢和核苷酸合成异常，最终使肿瘤增殖停滞于S期，从而抑制肿瘤细胞生长。 2004年2月，培美曲塞在美国首次获得批准，联合顺铂用于一线治疗不可切除的恶性胸膜间皮瘤（MPM）这是美国
20、迄今批准的第一个和唯一一个用于这种罕见肿瘤的治疗方案。2004年10月培美曲塞在美国被批准为治疗局部晚期或转移的非小细胞肺癌（NSCLC）的二线药物。2007年在ASCO年会上，Taylor等报道了一项培美曲塞单药一线或二线治疗恶性胸膜间皮瘤的开放性研究，一线治疗临床获益率为59.1%，二线治疗临床获益率为58.1%。临床前研究发现，培美曲塞对白血病、结肠癌和回盲部癌细胞有细胞毒性作用。 不良反应：在培美曲塞期临床研究中，骨髓抑制是其突出的剂量相关毒性，以中性粒细胞减少为主，其它常见的不良反应包括度腹泻、黏膜炎、恶心、皮疹及感觉异常等。 小结几十年来，抗肿瘤药物研究的思路和领域不断发展，但我们应看到，肿瘤的发生和发展是一个极其复杂的过程，受到多种因素的影响，各种治疗手段在实际应用中都还存在一些问题，寻找无毒副作用且高效的新型抗肿瘤药将可能成为一个主要发展方向。拓扑异构酶抑制剂和抗叶酸代谢药物将进一步发展，分子靶向药物将迅猛发展，但新型抗肿瘤药物要达到真正治愈的目标还需要一个漫长的过程。
