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1、第九讲第九讲病毒增殖技术一一、病毒的复制、增殖与营养病毒的复制、增殖与营养n吸附：非特异性静电特异性受体吸附：非特异性静电特异性受体 影响因素：温度、阴、阳离子影响因素：温度、阴、阳离子n侵入：病毒直接进入胞浆；侵入：病毒直接进入胞浆； 细胞吞饮病毒；细胞吞饮病毒； 病毒囊膜与细胞融合病毒囊膜与细胞融合n脱壳脱壳 包括脱膜和脱衣壳、囊膜脂质与细胞膜融合，裸包括脱膜和脱衣壳、囊膜脂质与细胞膜融合，裸露的病毒体进入细胞浆内及衣壳被溶酶体消化裂露的病毒体进入细胞浆内及衣壳被溶酶体消化裂解并释放出核心中的核酸解并释放出核心中的核酸无囊膜病毒仅有脱壳过程无囊膜病毒仅有脱壳过程疱疹病毒则可能在细胞表面脱去
2、囊膜，而痘病毒疱疹病毒则可能在细胞表面脱去囊膜，而痘病毒在吞饮泡内脱去囊膜在吞饮泡内脱去囊膜主要在胞浆和胞核内完成主要在胞浆和胞核内完成n生物合成：细胞浆或细胞核中完成生物合成：细胞浆或细胞核中完成 早期：合成酶类、核苷酸原料早期：合成酶类、核苷酸原料 晚期：合成病毒结构蛋白晚期：合成病毒结构蛋白n装配：细胞浆或细胞核中完成装配：细胞浆或细胞核中完成 核酸、蛋白质盘曲浓缩多肽包壳核酸、蛋白质盘曲浓缩多肽包壳 细胞膜的脂质、细胞膜的脂质、糖类和病毒蛋白病毒颗粒糖类和病毒蛋白病毒颗粒n释放：细胞通道溢出；释放：细胞通道溢出； 细胞死亡自溶释出；细胞死亡自溶释出； 细胞膜出芽；细胞膜出芽； 细胞膨胀
3、破裂放出细胞膨胀破裂放出 掌握不同病毒的增殖规律，获得高滴度病毒，掌握不同病毒的增殖规律，获得高滴度病毒，对研制高质量生物制品十分重要。对研制高质量生物制品十分重要。二、动物增殖病毒技术二、动物增殖病毒技术n动物的选择：动物的选择：1 1 大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、青壮年和健康毒疫苗、青壮年和健康2 2 对相应病毒易感，并十分敏感对相应病毒易感，并十分敏感3 3 经隔离饲养和观察检查证明健康经隔离饲养和观察检查证明健康4 4 家兔、大、小鼠等应符合普通级或清洁级实验动家兔、大、小鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标准；鸡应属非免疫
4、鸡或物标准；鸡应属非免疫鸡或SPFSPF级标准；犬、猫应级标准；犬、猫应品种明确，并符合普通级实验动物标准品种明确，并符合普通级实验动物标准5 5 体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大n接种方法接种方法1 1 皮内接种：注入表皮与真皮之间，小鼠、大鼠、皮内接种：注入表皮与真皮之间，小鼠、大鼠、地鼠可在背部、尾根部或趾部，豚鼠、兔在耳部，地鼠可在背部、尾根部或趾部，豚鼠、兔在耳部，猴的结核菌素皮下接种在眼睑部猴的结核菌素皮下接种在眼睑部2 2 皮下接种：犬、猫多在大腿外侧，豚鼠在大腿皮下接种：犬、猫多在大腿外侧，豚鼠在大腿内侧，兔在背部或耳根部内侧，兔在背
5、部或耳根部3 3 肌肉接种：肌肉发达、血管丰富的部位肌肉接种：肌肉发达、血管丰富的部位4 4 静脉接种：大小鼠的尾静脉；兔耳缘静脉；犬、静脉接种：大小鼠的尾静脉；兔耳缘静脉；犬、豚鼠前肢皮下静脉或后肢小隐静脉；灵长类可豚鼠前肢皮下静脉或后肢小隐静脉；灵长类可用股静脉、隐静脉、前肢皮下头静脉；山羊颈用股静脉、隐静脉、前肢皮下头静脉；山羊颈静脉，小型猪耳静脉、颈静脉或前大静脉，鸡静脉，小型猪耳静脉、颈静脉或前大静脉，鸡翼下静脉，犬舌下小静脉翼下静脉，犬舌下小静脉5 5 腹腔接种腹腔接种6 6 脑内接种脑内接种三、禽胚增殖病毒技术三、禽胚增殖病毒技术n禽胚的选择禽胚的选择1 SPF1 SPF鸡胚：无
6、鸡的特定的鸡胚：无鸡的特定的2222种病原体种病原体2 2 非免疫鸡胚：无特定病原的母源抗体非免疫鸡胚：无特定病原的母源抗体3 3 鸭胚：无干扰抗体的健康鸭胚鸭胚：无干扰抗体的健康鸭胚1 1 卵黄囊卵黄囊 2 2 卵白卵白 3 3 尿囊腔尿囊腔4 4 羊膜腔羊膜腔 5 5 气室气室 6 6 壳膜壳膜（一）禽胚接种途径与收获（一）禽胚接种途径与收获n绒毛尿囊膜接种法绒毛尿囊膜接种法多用于嗜皮肤性病毒的增殖：痘病毒、新城疫和疱疹病毒多用于嗜皮肤性病毒的增殖：痘病毒、新城疫和疱疹病毒1 1 选择选择10101313日龄的鸡胚，划出气室和胚位日龄的鸡胚，划出气室和胚位2 2 消毒后在气室部位钻一小孔，
7、在鸡胚面避开血消毒后在气室部位钻一小孔，在鸡胚面避开血管钻一小孔，勿穿透绒毛尿囊膜管钻一小孔，勿穿透绒毛尿囊膜3 3 用橡胶吸球紧贴气室孔轻轻一吸，使鸡胚面小用橡胶吸球紧贴气室孔轻轻一吸，使鸡胚面小孔处的绒毛膜下陷造成人工气室孔处的绒毛膜下陷造成人工气室4 4 在人工气室孔注入在人工气室孔注入0.10.10.2ml0.2ml病毒液，轻摇鸡病毒液，轻摇鸡蛋使病毒液均匀散布于绒毛尿囊膜上蛋使病毒液均匀散布于绒毛尿囊膜上5 5 用石蜡封口，用石蜡封口，35353737培养培养1 1 选用选用10101313日龄鸡胚日龄鸡胚2 2 在气室部位距气室分界线在气室部位距气室分界线3 35mm5mm处打一小
8、孔处打一小孔3 3 用细针头斜向蛋壳面插入约用细针头斜向蛋壳面插入约5mm5mm，再退出于气室内注射，再退出于气室内注射4 4 封口后直立，封口后直立，3737，2h2h，不翻蛋，不翻蛋5 5 常规孵化，每日照蛋常规孵化，每日照蛋2 2次，及时取出死亡胚次，及时取出死亡胚44，12h12h收获收获 消毒后，去除蛋壳和壳膜，用灭菌镊子轻轻夹起绒毛尿消毒后，去除蛋壳和壳膜，用灭菌镊子轻轻夹起绒毛尿囊膜，并沿气室周围将绒毛尿囊膜全部剪下，取病变明囊膜，并沿气室周围将绒毛尿囊膜全部剪下，取病变明显部位，经研磨制成病毒悬液显部位，经研磨制成病毒悬液n尿囊腔接种尿囊腔接种用于新城疫病毒、鸭传染性肝炎病毒和
9、传染性支气管炎病毒用于新城疫病毒、鸭传染性肝炎病毒和传染性支气管炎病毒n接种：接种：911日龄鸡胚，划出气室边界，在胚胎日龄鸡胚，划出气室边界，在胚胎距气室边界上或距气室边界上或/和下和下23mm处做标记，消毒处做标记，消毒后，在标记处打孔，注入病毒液，封口，孵化后，在标记处打孔，注入病毒液，封口，孵化n收获：收获：4放置放置6h或或20 0.51h，消毒，去，消毒，去除蛋壳，用灭菌吸管插入尿囊腔，取出尿囊液和除蛋壳，用灭菌吸管插入尿囊腔，取出尿囊液和羊水备用羊水备用n卵黄囊接种法卵黄囊接种法 5 58 8日龄鸡胚，在气室日龄鸡胚，在气室中心壳上钻一小孔中心壳上钻一小孔 针头沿胚的纵轴插入约针
10、头沿胚的纵轴插入约30mm30mm，封口，孵化，封口，孵化主要用于立克次氏体、鹦鹉热衣原体及某些病毒的增殖主要用于立克次氏体、鹦鹉热衣原体及某些病毒的增殖收获：无菌撕破绒毛尿囊膜和羊膜，夹起鸡胚切收获：无菌撕破绒毛尿囊膜和羊膜，夹起鸡胚切断卵黄带置于灭菌平皿中。如系收获鸡胚则将断卵黄带置于灭菌平皿中。如系收获鸡胚则将鸡胚低温保存备用；如系收获卵黄囊则将内容鸡胚低温保存备用；如系收获卵黄囊则将内容物倒入平皿中，用镊子将卵黄囊及绒毛尿囊膜物倒入平皿中，用镊子将卵黄囊及绒毛尿囊膜分开，用灭菌生理盐水冲去卵黄，取卵黄囊低分开，用灭菌生理盐水冲去卵黄，取卵黄囊低温保存备用温保存备用n羊膜腔接种法：羊膜腔
11、接种法：1 1、操作在照蛋灯下进行，取、操作在照蛋灯下进行，取10101212日龄鸡胚直立于蛋盘上，划日龄鸡胚直立于蛋盘上，划出气室和胚胎位置出气室和胚胎位置2 2、在气室端靠近胚胎侧的蛋壳上钻孔，将注射器针头轻轻刺向、在气室端靠近胚胎侧的蛋壳上钻孔，将注射器针头轻轻刺向胚体，当稍感抵抗时即可注入病毒液胚体，当稍感抵抗时即可注入病毒液将注射器针头刺向胚体，以针头拨动胚体下颚或腿，如胚体随将注射器针头刺向胚体，以针头拨动胚体下颚或腿，如胚体随针头的拨动而动，说明针头已进入羊膜腔，注射病毒液针头的拨动而动，说明针头已进入羊膜腔，注射病毒液3 3、封口孵化，收获方法与尿囊腔接种方法同、封口孵化，收获
12、方法与尿囊腔接种方法同病毒感染鸡胚全部组织，且可以通过胚体泄入尿囊腔病毒感染鸡胚全部组织，且可以通过胚体泄入尿囊腔n脑内接种法脑内接种法1 1、8 81313日龄鸡胚，划出气室和胎位，在气室靠近胚日龄鸡胚，划出气室和胎位，在气室靠近胚胎侧的蛋壳上钻孔胎侧的蛋壳上钻孔2 2、在绒毛尿囊膜上无大血管处切开一小口，用弯头、在绒毛尿囊膜上无大血管处切开一小口，用弯头镊子通过羊膜夹住鸡胚眼睑固定头部，注射器插入鸡镊子通过羊膜夹住鸡胚眼睑固定头部，注射器插入鸡胚注入病毒液胚注入病毒液0.010.010.02ml0.02ml3 3、无菌条件下取出鸡胚，低温保存备用、无菌条件下取出鸡胚，低温保存备用常用于狂犬
13、病毒的增殖常用于狂犬病毒的增殖n胚体接种法胚体接种法1 1、接种方法同脑内接种、接种方法同脑内接种2 2、针头刺入胚体内接种、针头刺入胚体内接种n静脉接种法静脉接种法1 1、11111414日龄鸡胚，照蛋，选取绒毛尿囊膜上大而直的静日龄鸡胚，照蛋，选取绒毛尿囊膜上大而直的静脉，并在蛋壳上划一长方形记号，并划出血流方向脉，并在蛋壳上划一长方形记号，并划出血流方向2 2、用蛋钻在注射部位开一长方形裂痕，除去蛋壳，于蛋壳、用蛋钻在注射部位开一长方形裂痕，除去蛋壳，于蛋壳内膜上滴一滴灭菌液体石蜡，使静脉透明可见内膜上滴一滴灭菌液体石蜡，使静脉透明可见3 3、用注射器顺血流方向刺入血管注入、用注射器顺血
14、流方向刺入血管注入0.050.050.2ml0.2ml病毒液，病毒液，拔出针头可以不封口，孵化，弃掉拔出针头可以不封口，孵化，弃掉24h24h内死胚内死胚4 4、收获时按脑内接种法沿反血流方向静脉插入针头，可得、收获时按脑内接种法沿反血流方向静脉插入针头，可得0.050.050.5ml0.5ml血液，或去除气室蛋壳，滴一滴灭菌液体石蜡血液，或去除气室蛋壳，滴一滴灭菌液体石蜡于蛋膜，通过蛋膜用针头刺破内部大血管，使血液渗出壳膜于蛋膜，通过蛋膜用针头刺破内部大血管，使血液渗出壳膜之上，用吸管吸取，可得之上，用吸管吸取，可得0.5ml0.5ml血液血液（三）影响禽胚增殖病毒的因素（三）影响禽胚增殖病
15、毒的因素n种蛋质量：种蛋质量： 病原微生物：病原微生物：污染制品本身，又影响接种病毒污染制品本身，又影响接种病毒 在鸡胚中的增殖在鸡胚中的增殖 母源抗体：母源抗体：影响病毒在鸡胚内的增殖影响病毒在鸡胚内的增殖 抗生素：抗生素：影响病原体的增殖影响病原体的增殖n孵化技术：孵化技术：温度：温度：3739.5，宁低勿高，宁低勿高湿度：湿度：鸡胚鸡胚5357水禽比鸡胚高水禽比鸡胚高510通风：通风：机械通风或定期开启恒温培养箱机械通风或定期开启恒温培养箱翻蛋：翻蛋：大头向上垂直放置，定期翻蛋，孵化至大头向上垂直放置，定期翻蛋，孵化至47天翻蛋天翻蛋n接种技术：接种技术： 不同病毒有不同的接种途径，同种
16、病毒接种不同不同病毒有不同的接种途径，同种病毒接种不同日龄的禽胚获得的病毒量也不同；日龄的禽胚获得的病毒量也不同； 尿囊腔接种时，根据病毒培养所需时间选择最恰尿囊腔接种时，根据病毒培养所需时间选择最恰当的接种胚龄；当的接种胚龄； 严格操作，接种时不应伤及胚体和血管，以免影严格操作，接种时不应伤及胚体和血管，以免影响其发育。响其发育。n禽胚污染：禽胚污染： 接种时应严格无菌操作接种时应严格无菌操作 定期清扫消毒孵化室，保持空气新鲜定期清扫消毒孵化室，保持空气新鲜 种蛋入孵前要清洗、消毒、晾干种蛋入孵前要清洗、消毒、晾干细胞培养技术n概念：细胞培养概念：细胞培养原代细胞、细胞株、传代细胞原代细胞、
17、细胞株、传代细胞n细胞培养方法细胞培养方法静置培养、转瓶培养、悬浮培养、微载体静置培养、转瓶培养、悬浮培养、微载体培养、微囊化细胞培养培养、微囊化细胞培养n细胞制备：举例细胞制备：举例CEFCEF制备过程制备过程n细胞的冻存与复苏：慢冻快融法细胞的冻存与复苏：慢冻快融法n细胞培养要素细胞培养要素培养液、血清、细胞接种量、培养液、血清、细胞接种量、pHpH、温度、温度、无菌条件、培养器皿清洁度无菌条件、培养器皿清洁度n细胞培养污染问题细胞培养污染问题n细菌、真菌、支原体、病毒细菌、真菌、支原体、病毒四、细胞增殖病毒技术n细胞的选择：细胞的选择： 病毒须在敏感的宿主细胞中增殖病毒须在敏感的宿主细胞
18、中增殖 宿主细胞一般选择相应易感动物的组织细胞宿主细胞一般选择相应易感动物的组织细胞 可以根据病毒的细胞感染谱来选择细胞可以根据病毒的细胞感染谱来选择细胞n细胞培养病毒要素细胞培养病毒要素血清：血清：56灭活灭活30min，为了克服非特异性抑制因子的作，为了克服非特异性抑制因子的作 用，血清浓度不超过用，血清浓度不超过2温度：温度：37pH：7.67.8接毒量与接种方法：按维持液的接毒量与接种方法：按维持液的110（V/V)量接种；量接种； 异步接毒和同步接毒异步接毒和同步接毒n支原体污染问题支原体污染问题影响病毒的增殖影响病毒的增殖1 1 干扰素诱导与干扰素活性抑制干扰素诱导与干扰素活性抑制2 2 病毒、支原体对共同营养需求成分的竞争病毒、支原体对共同营养需求成分的竞争n病毒增殖指标与收获病毒增殖指标与收获细胞病变（细胞病变（CPE）：细胞圆缩、细胞聚合、细胞）：细胞圆缩、细胞聚合、细胞 融合成合胞体、轻微病变融合成合胞体、轻微病变包涵体和血凝性包涵体和血凝性CPE达到达到80左右时收获，反复冻融使病毒释放左右时收获，反复冻融使病毒释放
