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1、实验六实验六(二二)鸡血细胞的体外融鸡血细胞的体外融合合 动物细胞融合是细胞工程动物细胞融合是细胞工程技术的重要手段之一，是研究技术的重要手段之一，是研究细胞遗传、基因定位、细胞免细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。疫、病毒和肿瘤的重要手段。细胞生物学实验课件细胞生物学实验课件实验六细胞融合实验实验目的实验目的n了解聚乙二醇（了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融）诱导体外细胞融合的基本原理。合的基本原理。n通过通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。初步掌握细胞融合的基本方法。实验六细胞融合实验实验原理实验原理n细胞融合又称
2、体细胞杂交，是指用人工细胞融合又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。核的杂种细胞。实验六细胞融合实验实验原理实验原理n依据融合过程采用的助融剂不同，细胞依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分为：融合可分为：病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（HVJ）；）；化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇化学因
3、子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（PEG）；）；电场诱导的细胞融合；电场诱导的细胞融合；激光诱导的细胞融合激光诱导的细胞融合实验六细胞融合实验实验原理实验原理nPEG是乙二醇的多聚化合物，可改变各是乙二醇的多聚化合物，可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞融合。融合。n商品商品PEG存在一系列不同分子质量的多存在一系列不同分子质量的多聚体聚体(常用的有常用的有20012000)，一般应用，一般应用PEG40006000的溶液，能够产生高频率的溶液，能够产生高频率的细胞融合。的细胞融合。实验六细
4、胞融合实验方法与步骤方法与步骤n鸡血细胞储备液的制备鸡血细胞储备液的制备取鸡血，加入肝素（取鸡血，加入肝素（100U/5mL全血）制全血）制成抗凝全血。再加入成抗凝全血。再加入4倍体积生理盐水，倍体积生理盐水，制成红细胞储备液制成红细胞储备液n鸡血细胞的处理鸡血细胞的处理取鸡血细胞储备液取鸡血细胞储备液1mL，加入，加入4mL生理盐生理盐水，混匀后，水，混匀后，12000rpm离心离心5min，弃上，弃上清，用清，用5mL生理盐水重悬浮沉淀，重复离生理盐水重悬浮沉淀，重复离心操作心操作1次次实验六细胞融合实验方法与步骤方法与步骤n鸡血细胞悬液的制备鸡血细胞悬液的制备在离心后的鸡血细胞沉淀中加入
5、适量在离心后的鸡血细胞沉淀中加入适量Hanks缓冲缓冲液，将细胞悬浮，镜检，在血细胞计数板上计数。液，将细胞悬浮，镜检，在血细胞计数板上计数。适当的细胞浓度应控制在适当的细胞浓度应控制在1107个个/mL左右。根据左右。根据计数情况数情况调整整悬液密度，于液密度，于37保温保温。nPEG诱导细胞融合胞融合吸取吸取1mL鸡血血悬液放在离心管中，逐滴加入液放在离心管中，逐滴加入37的的50%50%PEGPEG约0.5mL,0.5mL,边加加边轻轻摇动试管，混匀后管，混匀后于于37水浴静置水浴静置15min15min。实验六细胞融合实验方法与步骤方法与步骤n终止终止PEG作用作用缓慢加入缓慢加入5m
6、L Hanks缓冲液，轻轻吹打混匀，于缓冲液，轻轻吹打混匀，于37水浴中静置水浴中静置10minn制备细胞悬液制备细胞悬液用吸管轻轻吹打细胞团数次使其分散，用吸管轻轻吹打细胞团数次使其分散， 12000rpm离心离心5min使细胞沉淀，去上清使细胞沉淀，去上清,留少许留少许Hanks缓冲液缓冲液,混匀混匀n染色和镜检染色和镜检吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，加入詹加入詹纳斯绿染液混匀，纳斯绿染液混匀，静置静置3min后盖上盖玻片，在显后盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。微镜下观察细胞融合情况。实验六细胞融合实验计算细胞融合率计算细胞融合率n细胞融合
7、率是指在显微镜的视野内，已细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合细胞的细胞核总数与该视野内发生融合细胞的细胞核总数与该视野内所有细胞的细胞核总总数之比，通常以所有细胞的细胞核总总数之比，通常以百分数表示。百分数表示。n测定时要进行多个视野计数，并进行统测定时要进行多个视野计数，并进行统计分析。计分析。实验六细胞融合实验注意事项注意事项n温度、融合时间、温度、融合时间、PEG的浓度与作用时的浓度与作用时间、细胞密度、机械力等因素均影响融间、细胞密度、机械力等因素均影响融合率，实验操作时应予以注意，并在需合率，实验操作时应予以注意，并在需要的时候及时镜检。要的时候及时镜检。实验六细胞融合实验作业作业n画出观察到的融合细胞，并计算融合率。画出观察到的融合细胞，并计算融合率。实验六细胞融合实验思考题思考题n根据自己的实验结果，分析在实验过程根据自己的实验结果，分析在实验过程中影响融合率的主要步骤。中影响融合率的主要步骤。nCa2+在实验中起什么作用在实验中起什么作用?实验六细胞融合实验
