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1、第三节蛋白质的一级结构蛋白质的相关概念肽的命名、书写及特点测序过程9/2/20241一、相关概念一、相关概念 1.1.蛋白质的一级结构（蛋白质的一级结构（Primary structurePrimary structure）: :又又称为共价结构或化学结构。它是指蛋白质中的氨基酸（残称为共价结构或化学结构。它是指蛋白质中的氨基酸（残基）的种类、排列顺序及连接方式。基）的种类、排列顺序及连接方式。 9/2/20242特点：特点：具有部分双键的性质具有部分双键的性质,不可不可以旋转以旋转肽键比一般的碳肽键比一般的碳-氧键短；氧键短；与肽键相连的氢原子和氧与肽键相连的氢原子和氧原子呈原子呈反式反式；
2、 2 2. .肽键肽键(peptide bond)(peptide bond) 一个氨基酸的一个氨基酸的-羧基羧基与另一个氨基酸的与另一个氨基酸的-氨基氨基缩水缩水形成的酰胺键（共价）键，称为肽键。形成的酰胺键（共价）键，称为肽键。9/2/202432.构型（构型（configuration）与构象）与构象conformation）构型构型指立体异构体中取代原子或基团在空间的指立体异构体中取代原子或基团在空间的取向，构型的改变必须通过共价键的断裂。取向，构型的改变必须通过共价键的断裂。构象构象是指这些取代基团当单键旋转时可能形是指这些取代基团当单键旋转时可能形成的不同的立体结构，构象的改变不涉
3、及共价键成的不同的立体结构，构象的改变不涉及共价键的改变。的改变。9/2/202443.肽肽(peptide)一个氨基酸的一个氨基酸的羧基羧基与另一个氨基酸的与另一个氨基酸的氨基氨基缩水形成的化缩水形成的化合物，称为合物，称为肽肽。在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起。在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成来，形成肽链肽链。9/2/20245肽和肽键的形成肽和肽键的形成肽单位肽单位肽键肽键肽平面肽平面9/2/202465.5.残基残基(residue)(residue) 肽链分子中的每一个氨基酸，由于相互连接而失去一肽链分子中的每一个氨基酸，由于相互连接而失去一分子水，与原来的结构相比，分子
4、稍有残缺，因此通常把分子水，与原来的结构相比，分子稍有残缺，因此通常把肽链分子中的每一个氨基酸单位称为氨基酸残基肽链分子中的每一个氨基酸单位称为氨基酸残基128/110.128/110.9/2/20247二、二、肽肽的的命名及书写命名及书写1.命名：命名：习惯：按数量的多少、按来源习惯：按数量的多少、按来源系统：某氨基酰系统：某氨基酰某氨基酰某氨基酰某氨基酸某氨基酸2.书写：从书写：从N(H)到到C(OH)，具方向性，具方向性三字母符号或单字母符号表示，中间用三字母符号或单字母符号表示，中间用“”或或“-”-”表示。表示。例如例如:Gly-Glu-Lys-Ala(甘氨酰甘氨酰谷氨酰赖氨酰丙氨酸
5、谷氨酰赖氨酰丙氨酸)9/2/20248 当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在一端仍然有游离的氨基和另一端有游离的羧基，每一端仍然有游离的氨基和另一端有游离的羧基，每一端连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接一端连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、形成长的、不带支链不带支链的寡肽和多肽。的寡肽和多肽。多肽仍然有游离的多肽仍然有游离的-氨基和氨基和-羧基。羧基。少于少于10AA成为成为寡肽寡肽，多于，多于10AA称为称为多肽多肽或聚肽。或聚肽。分子量大于分子量大于10000d称为称为蛋白质蛋白质，小于，小于10000d称称为多肽为多肽。9
6、/2/20249在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为称为活性肽活性肽。实例实例：谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)短杆菌肽短杆菌肽;脑啡肽脑啡肽；促甲状腺素释放因子（促甲状腺素释放因子（TRH） -天冬氨酸天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯苯丙氨酸甲酯（甜味剂）（甜味剂）激素类多肽；抗生素类多肽；蛇毒多肽激素类多肽；抗生素类多肽；蛇毒多肽等。等。9/
7、2/202410重要的肽9/2/202411GSH的作用解毒作用：解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化参与氧化还原反原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保保护巯基基酶的活性：的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持持红细胞膜胞膜结构的构的稳定：定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。9/2/2024129/2/2024133.3.肽的理化特点：肽的理化特点：肽键的酰氨氢不解离，肽的酸碱性质主要决定于肽肽键的酰氨氢不解离，肽的酸碱性质主要决定于肽键中的游离末端键中的游离末端-NH2、-COOH及侧链及侧链R基上的基上的可解离基团；可解离基团；肽中末端肽
8、中末端-羧基的羧基的pKa值比游离氨基酸的大，末端值比游离氨基酸的大，末端-氨基的氨基的pKa值比游离氨基酸的小；值比游离氨基酸的小；游离的游离的-氨基、氨基、-羧基和羧基和R基可发生与氨基酸中相基可发生与氨基酸中相应的类似反应，如茚三酮反应等；应的类似反应，如茚三酮反应等；蛋白质部分水解后所得的肽若不发生消旋，则具有蛋白质部分水解后所得的肽若不发生消旋，则具有旋光性，短肽的旋光性，短肽的旋光度约等于组成氨基酸的旋光旋光度约等于组成氨基酸的旋光度之和，较长的肽的旋光度则不是简单加和。度之和，较长的肽的旋光度则不是简单加和。9/2/202414二、蛋白质一级结构测定步骤二、蛋白质一级结构测定步骤
9、 测序前提：测序前提：l样品必须是均一的(纯度大于97%)l必须知道它的相对分子量，其误差允许在10%以内9/2/2024151. .测测定定蛋白质分子中多肽链的数目蛋白质分子中多肽链的数目 2.2.拆分蛋白质分子的多肽链拆分蛋白质分子的多肽链 3.3.断开链内二硫键断开链内二硫键 4.4.分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目 5.5.鉴定多肽链的鉴定多肽链的N N、C C端残基端残基 6.6.裂解多肽成小的肽段裂解多肽成小的肽段 7.7.测各肽段的氨基酸序列测各肽段的氨基酸序列 8.8.重建完整多肽链的一级结构重建完整多肽链的一级结构 9.9.确定二硫键的位置
10、确定二硫键的位置测序过程测序过程9/2/202416(一一)N末端末端测定测定二二硝基氟苯（硝基氟苯（DNFB）法）法：肽游离末端肽游离末端NH2与与DNFB反应生成反应生成DNP-肽肽黄色黄色DNP-氨基酸氨基酸丹磺酰丹磺酰氯（氯（DNS）法：法：用用DNS取代取代DNFB，生成生成DNS-氨基酸氨基酸苯异硫苯异硫氰酸（氰酸（PITC）法：法：生成生成PTH-氨基酸，从肽上断裂下来氨基酸，从肽上断裂下来氨肽酶氨肽酶法：法：外切酶，但效果不好外切酶，但效果不好9/2/2024179/2/2024189/2/2024199/2/202420氨肽酶法氨肽酶法氨肽酶是一类外切酶，它从肽链的氨肽酶是一
11、类外切酶，它从肽链的N末端逐末端逐个向里切。个向里切。最常用的氨肽酶是最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶也会遇到也会遇到N末端氨基封闭，用焦谷氨酸氨肽末端氨基封闭，用焦谷氨酸氨肽酶处理。酶处理。9/2/2024219/2/202422 C-末端末端测定测定肼肼解法解法：最重要的化学方法，肽与肼反应，除最重要的化学方法，肽与肼反应，除C-末端末端氨基酸游离外，其他氨基酸转变为氨基酸酰氨基酸游离外，其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物肼化物还原法还原法：C-末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的-氨基醇氨基醇羧肽酶羧肽酶法法：最有效、最常用最有效、最常用羧肽酶羧肽酶A羧肽
12、酶羧肽酶B羧肽酶羧肽酶Y羧肽酶羧肽酶C9/2/202423氨基酸酰肼可以与苯甲醛苯甲醛作用变成水不溶性二苯基衍生物而沉淀GlnAsnCys等不易测出，末端Arg变成鸟氨酸9/2/2024249/2/202425羧肽酶法羧肽酶法本方法目前最有效。本方法目前最有效。从羧基端开始向里逐一水解蛋白质从羧基端开始向里逐一水解蛋白质羧肽酶羧肽酶A：释放除：释放除Pro，Arg和和Lys以外的所以外的所有有C-末端残基末端残基羧肽酶羧肽酶B：只水解以碱性：只水解以碱性Arg和和Lys为为C-末端末端的肽键的肽键羧肽酶羧肽酶C：羧肽酶羧肽酶Y：可以作用于任何一个：可以作用于任何一个C-末端残基末端残基9/2/
13、2024269/2/202427二硫二硫键的键的断裂断裂氧化法：氧化法：过甲酸过甲酸还原法：还原法：巯基化合物还原巯基化合物还原（-巯巯基乙醇，二硫基乙醇，二硫苏苏糖糖醇等）醇等）9/2/202428此外还需要加此外还需要加8mol/L尿素或尿素或6mol/L的盐酸胍，使蛋白质变性。的盐酸胍，使蛋白质变性。生成的巯基要生成的巯基要用碘乙酸等烷化剂保护。用碘乙酸等烷化剂保护。9/2/2024299/2/202430(三三)氨基酸氨基酸组成的测定：组成的测定：酸酸水解水解：是主要方法，同时辅以碱水解；是主要方法，同时辅以碱水解；所得氨基酸不消旋，但所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破坏，全部被破坏，
14、Ser，Thr，Tyr部分破坏，部分破坏，Asn和和Gln的酰的酰氨基被氨基被水解，生成水解，生成Asp和和Glu,同时释放出同时释放出NH3；碱水解碱水解：多数氨基酸都被破坏，但多数氨基酸都被破坏，但Trp可可定量回收定量回收9/2/202431(四四)多多肽肽链链的的部分部分裂解裂解酶酶裂裂解解胰蛋白酶胰蛋白酶：专一性强，断裂：专一性强，断裂Lys或或Arg的的羧羧基基参与形成的肽键参与形成的肽键糜糜蛋白酶蛋白酶：断裂：断裂Phe，Trp，Tyr，Leu等等疏水疏水氨基酸氨基酸的的羧基端羧基端肽键肽键嗜热菌嗜热菌蛋白酶蛋白酶：专一性差，断裂：专一性差，断裂Val，Leu，Phe，Tyr，T
15、rp等等氨基氨基参与形成的肽键参与形成的肽键胃蛋白酶胃蛋白酶：在：在酸性条件稳定酸性条件稳定，肽键，肽键两侧两侧均为均为疏水氨基酸。在确定二硫键位置时常用，专疏水氨基酸。在确定二硫键位置时常用，专一性与糜蛋白质酶类似一性与糜蛋白质酶类似化化学学裂裂解解溴化溴化氰氰（CNBr）：）： 只断裂只断裂Met羧基羧基形成的肽键形成的肽键羟羟氨氨（NH2OH）：）： 在在pH9时，专一断裂时，专一断裂Asn-Gly之间的肽键，其它条件下不专一之间的肽键，其它条件下不专一9/2/2024329/2/2024339/2/2024349/2/202435今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是今有一个七肽，经分析
16、它的氨基酸组成是Lys，Pro, Arg, Phe, Ala,Tyr和和Ser，该肽未经，该肽未经糜蛋白酶糜蛋白酶处处理时，与理时，与DNFB反应不产生反应不产生-DNP-氨基酸氨基酸，经，经糜蛋糜蛋白酶白酶作用后，此肽断裂成两肽段。其氨基酸组成分作用后，此肽断裂成两肽段。其氨基酸组成分别是别是Ala, Ser, Tyr和和Lys，Pro, Arg, Phe。这两个肽这两个肽段分别与段分别与DNFB反应可分别生成反应可分别生成DNP-SerDNP-Lys。此肽与。此肽与胰蛋白酶胰蛋白酶反应，同样能生成两个肽段，反应，同样能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是它们的氨基酸组成分别是Arg,Pro
17、和和Phe,Tyr,Lys,Ser,Ala。试问此七肽的一级结构序列是怎样。试问此七肽的一级结构序列是怎样？9/2/202436(五五)肽肽段段的的氨氨基基酸酸测测序序Edman化学降解法：化学降解法： 用用Edman试剂试剂PITC与游离氨基作用生成与游离氨基作用生成PTH-氨基酸，并可用各种层析技术分离；氨基酸，并可用各种层析技术分离；现改用蛋白质测序仪。现改用蛋白质测序仪。酶酶解法解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难质谱质谱法法：质谱仪：质谱仪由由核苷酸序列推定法核苷酸序列推定法：从从mRNA推出推出 cDNA的核苷酸序列，然后的核苷酸序列，然后
18、推测出蛋白质的氨基酸序列推测出蛋白质的氨基酸序列9/2/202437(六六)肽段在多肽段在多肽链中次肽链中次序的决定序的决定9/2/202438(七七)二硫键位置的确定：二硫键位置的确定： 对角线电流法：对角线电流法： 一般采用一般采用胃蛋白酶胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。一是水解原来的含二硫键的蛋白质。一是胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易分离鉴定；二是在酸性条件下，有利于防止二硫键发生交换分离鉴定；二是在酸性条件下，有利于防止二硫键发生交换反应。反应。9/2/2024399/2/2024409/2/2024419/
19、2/202442对角线电泳过程对角线电泳过程：把水解后的混合肽段点到：把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在滤纸的中央，在pH6.5条件下进行第一向电泳，肽条件下进行第一向电泳，肽段将按大小及电荷不同分离开，然后段将按大小及电荷不同分离开，然后把滤纸暴露把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使在过甲酸蒸气中，使S-S氧化成一对含磺酸基丙氨氧化成一对含磺酸基丙氨酸的肽。滤纸旋转酸的肽。滤纸旋转90度，在与第一向完全相同的条度，在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。这时大多数氨基酸的迁移率件下进行第二向电泳。这时大多数氨基酸的迁移率未变，将交于滤纸的一条对角线上，而含磺基丙氨未变，将交于滤纸的一条对角线上，
20、而含磺基丙氨酸的成对肽段将比原来含二硫键的肽小而负电荷增酸的成对肽段将比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。加，结果它们都偏离了对角线。9/2/202443问题：问题：有一个有一个A肽，经酸水解分析得知由肽，经酸水解分析得知由Lys、Asp、Glu、Arg、Ala、Val和和Tyr组成组成。当。当A肽与肽与DNFB反应后，得反应后，得DNP-Glu，当用羧肽酶处理后得游离，当用羧肽酶处理后得游离Asp。如果我们在实。如果我们在实验中将验中将A肽用胰蛋白酶降解时，得到三个肽，其中一种肽用胰蛋白酶降解时，得到三个肽，其中一种(Arg、Gln、Tyr),在在pH6.4时净电荷为时
21、净电荷为+1，另一种，另一种(Ala、Lys)第三种为（第三种为（Val和和Asn）在）在pH6.4时，带电荷为零。时，带电荷为零。此外，此外，A肽用糜蛋白酶降解时，也得以两种肽，一种肽用糜蛋白酶降解时，也得以两种肽，一种(Gln、Tyr、)在在pH6.4时不带电荷，另一种时不带电荷，另一种(Arg、Ala、Val、Lys、Asn)在在pH6.4时带时带2个正电荷个正电荷，问，问A肽的序列如何肽的序列如何？详细写出推理过程。？详细写出推理过程。9/2/202444作业：1名词解释名词解释蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(proteinprimarystructure）、肽和肽键）、肽和肽键2裂解多肽链的部分方法有哪些，各有何特裂解多肽链的部分方法有哪些，各有何特点？点？9/2/202445
