马玉超北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼117；：62336016；:myc0307gmail现代微生物学实验技术 实 验 内 容♣ 染色体步移法克隆知序列的染色体步移法克隆知序列的侧翼序列翼序列♣ 转座子随机突座子随机突变及目的表型的挑及目的表型的挑选♣ 大大肠杆菌杆菌β-半乳糖苷半乳糖苷酶的的诱导♣ 利用利用SDS-PAGE分析交融蛋白的可溶性分析交融蛋白的可溶性♣ 绿色糖色糖单胞菌的胞菌的发酵及酵及孢外外酶的提取的提取 转座子随机突变及目的表型的挑选李丽萍 实验目的实验目的1.了解细菌常见转座子Tn5的构造及转座机理2. 学习利用转座子进展随机插入突变的实验过程3. 掌握双亲接合实验的原理及过程 实验原理转座子：转座因子或腾跃因子，它可以从遗传物质的一部分腾跃到另一部分，从而引起遗传变异转座子的发现：20世纪50年代初期，美国冷泉港实验室遗传育种学家McClintock 经过对玉米籽粒色斑不稳定景象的研讨而发现转座景象，初次发现了能在基因组内不同区域转移的控制成分 实验原理细菌转座子的类型：插入序列 (Insertion sequence);复合转座子 (Composite transposons); Tn5TnA 转座子家族 (TnA family);可挪动噬菌体 (Mu phage). 实验原理Tn5：发现于E.coli，序列全长5818bp。
中心序列：编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)； 两个倒置的IS50：IS50R编码53KD的Tnp和48KD的转座阻遏蛋白(Inh),两者运用同一阅读框，但启动子不同IS50L的第1442碱基处存在一个赭石突变，IS50具有19bp的倒置末端，二者有7个碱基不一样，是转座酶(Tnp)的作用位点kanr strr bleorOE IE IE OEIS50L IS50RP1 (Tnp)P2 (Inh)P3P4突变位点(Mutation site) Tn5的转座机理 实验原理 实验原理DNA sequencing 实验原理非转移性质粒：转移性质粒：能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能 带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移;接协作用：质粒在细菌间的转移，需求供体和受体细胞间的直接 接触才干进展.受体菌，Ap Nx巴西固氮螺菌Sp7供体菌 S17-1质粒pRL1063a,Km重组巴西固氮螺菌，Ap Nx Km 实验原理植物生长激素，由植物根系细菌合成，对植物的生长及一些发育阶段的调控起关键作用细菌中IAA合成的几种途径A-B：吲哚乙酰胺途径；E-F-D：吲哚丙酮酸途径；C-D：色氨酸侧链途径 实验资料1.菌株2. E. coli S17-1/pPRL1063a; 巴西固氮螺菌sp73.2. 培育基及试剂4.(1). 细菌丰富培育基LB培育基 LD培育基胰蛋白胨 (g) 10 10酵母提取物 (g) 5 5氯化钠 (g) 10 2.5pH 7.0 6.8固体培育基参与1.3% 琼脂粉，dH2O定容至1L，121℃灭菌20min (2).用于IAA摇瓶培育的培育基(MAZ培育基) (3).抗生素抗生素称号 储存液配制方法氨苄青霉素 (Ap) 100 mg/ml 水溶液，-20℃ 25 μg/ml卡那霉素(Km) 100 mg/ml 水溶液，-20℃ 50 μg/ml 30-50 μg/ml萘啶酮酸(Nx) 20 mg/ml 水溶液，-20℃ 5 μg/mlE.coli A.brasilense运用浓度3. 主要仪器 小型离心机 实验步骤第一天：第一天：中午中午12：：30～～13：：30接种接种sp7 至至5ml LD 液体培育基中，液体培育基中，30℃℃振振荡培育培育约20小小时。
晚晚5：：30，接种供体菌，接种供体菌pRL1063a/E.coil S17-1 至至5ml LB+Km液体培育基中，液体培育基中，37℃℃振振荡培育培育约16小小时第二天：第二天：上午上午9：：00，用同一个，用同一个1.5 ml 离心管搜集适量供体菌和受体菌离心管搜集适量供体菌和受体菌12000rpm 离心离心30 sec，弃上清，用移液器将菌泥，弃上清，用移液器将菌泥悬浮混匀后浮混匀后移入移入LD平板中央，尽量减少气泡的平板中央，尽量减少气泡的产生 30℃℃正置培育正置培育过夜 留意：事先留意：事先预备好好LD平板平板 第三天：用液体LD培育基洗下菌泥，铺于同时含有Km、Ap、Nx的LD平板上，30℃培育，挑选接合子第四天：挑取接合子在含有上述三种抗生素的LD培育基平板上划线分别，保证得到的为单菌落第五天：挑单菌落分别接种于5ml MAZ培育基中30℃摇瓶培育〔野生菌对照〕. 第六天：用比色法测定菌液中的IAA含量比色试剂：含12g/L FeCl3 的H2SO4 留意平安取1ml 丈量OD600；取1ml 菌液12000rpm 离心 5min后取上清与比色试剂等量混合，摇匀后在暗处放置30 min，然后测OD540nm注：空白对照，未接菌的培育基与比色用试剂的混合液。
规范曲线 实验结果菌株(Strains) (OD600) (OD540) IAA浓度 (μg/ml)ck(培育基)Sp71-11-21-31-4表 巴西固氮螺菌 Yu62 野生型及突变体的IAA产量 ●下次实验大大肠杆菌杆菌β-半乳糖苷半乳糖苷酶的的诱导 。