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1、第六章 发酵生产染菌及防治学习目标知识目标掌握染菌对发酵过程的影响；掌握发酵异常现象及原因分析掌握杂菌污染的途径能力目标：能够发现种子培养和发酵的异常现象；能进行染菌的检查和判断、发酵染菌原因分析；能杂菌污染的挽救与处理措施。2一一 、染菌对发酵的影响、染菌对发酵的影响纯种培养要求必须防止杂菌污染，为防止染菌，采取了一系列措施：纯种培养要求必须防止杂菌污染，为防止染菌，采取了一系列措施：密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作；密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作；染菌无法彻底避免；据报道染菌无法彻底避免；据报道, ,国外抗生素发酵染菌率为国外抗生素发酵
2、染菌率为2 25%5%，国内抗，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为生素发酵、青霉素发酵的染菌率为2 2，链霉素、红霉素和四环素发酵，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为染菌率为5%5%，谷氨酸噬菌体感染率为，谷氨酸噬菌体感染率为1 12 2；染菌对产率、质量、三废治理都有很大的影响。染菌对产率、质量、三废治理都有很大的影响。3（一） 染菌染菌对各种各种发酵的影响：酵的影响： 青霉素：青霉素：产青霉素青霉素酶的的杂菌菌 疫苗：全部疫苗：全部废弃弃 柠檬酸：主要防止前期染菌檬酸：主要防止前期染菌 谷氨酸：噬菌体危害大谷氨酸：噬菌体危害大 肌苷、肌苷酸：易染菌肌苷、肌苷酸：易染菌4（二）染菌种（二）
3、染菌种类对发酵的影响酵的影响 青霉素青霉素发酵酵污染染细短短产气杆菌比气杆菌比污染粗大杆菌危害大，染粗大杆菌危害大，链霉素霉素发酵酵污染染细短杆菌和假短杆菌和假单孢杆菌和杆菌和产气杆菌比气杆菌比污染粗大杆菌危害大，四染粗大杆菌危害大，四环素怕素怕污染双球菌、芽染双球菌、芽孢杆菌和杆菌和夹膜杆菌膜杆菌（三）不同染菌（三）不同染菌时期期对发酵的影响：酵的影响：（1）种子培养期染菌：易染菌。）种子培养期染菌：易染菌。处理措施；理措施；应灭菌后除去，并菌后除去，并对种子罐、种子罐、管道管道进行行检查和和彻底底灭菌。菌。（2）发酵前期染菌：易染菌。酵前期染菌：易染菌。处理措施：理措施：应特特别防止，可重
4、新防止，可重新灭菌，菌，补充充营养，重新接种养，重新接种发酵。酵。5（3）发酵中期染菌：酵中期染菌： 发酵中期染菌，挽救酵中期染菌，挽救处理困理困难，危害性大；，危害性大； 处理措施：理措施： A、青霉素、青霉素发酵：酵： 将另一罐将另一罐发酵正常、酵正常、单位高的位高的发酵液的一部分酵液的一部分输入染菌罐入染菌罐中，以抑制中，以抑制杂菌繁殖，同菌繁殖，同时采取低通采取低通风，低流加糖量等措施，低流加糖量等措施6B、柠檬酸檬酸发酵：酵：污染染细菌：加大通菌：加大通风量，加速量，加速产酸，降低酸，降低pH，抑制，抑制细菌生菌生长；污染酵母染酵母 ：加硫酸：加硫酸铜；污染黄曲霉；加入另一罐将近成熟
5、的醪液，使染黄曲霉；加入另一罐将近成熟的醪液，使pH下降，黄曲霉自溶；下降，黄曲霉自溶；污染青霉：青霉能在低染青霉：青霉能在低pH环境下生境下生长，可考，可考虑提前放罐。提前放罐。（4）发酵后期染菌酵后期染菌 处理措施：可考理措施：可考虑提前放罐。提前放罐。7 （四）染菌程度（四）染菌程度对发酵的影响酵的影响 染菌程度越大，即染菌程度越大，即进入入发酵罐的酵罐的杂菌数目越多，菌数目越多，对发酵酵的危害越大。的危害越大。 染少量染少量杂菌，有菌，有时可以容忍。可以容忍。 （五）染菌（五）染菌对产物提取和物提取和产品品质量的影响量的影响 菌体自溶，菌体自溶，发酵液酵液发粘、粘、发臭，臭，过滤困困难
6、8（一）种子培养和（一）种子培养和发酵的异常酵的异常现象象 1、种子培养异常、种子培养异常（1）菌体生）菌体生长缓慢：原料慢：原料质量、菌体老化、供氧不足、温度、酸碱度，量、菌体老化、供氧不足、温度、酸碱度，种子冷藏种子冷藏时间长或接种量或接种量过低。低。（2）菌）菌丝结团：菌：菌丝团中央中央结实，内部菌，内部菌丝的的营养吸收和呼吸受到影响，养吸收和呼吸受到影响，不能正常生不能正常生长。原因多而且复。原因多而且复杂。（3）代）代谢不正常：接种物不正常：接种物质量和培养基量和培养基质量、培养量、培养环境境查，接种量小、，接种量小、杂菌菌污染等有关染等有关二、二、 染菌的染菌的检查、分析和防治、分
7、析和防治92、发酵异常酵异常（1）菌体生）菌体生长差：种子差：种子质量的影响；量的影响；导致代致代谢缓慢。慢。（2）pH不正常：培养基不正常：培养基质量、量、灭菌效果、菌效果、补糖等影响；是糖等影响；是所有代所有代谢反反应的的综合反映。合反映。（3）溶解氧异常）溶解氧异常 染菌：染好氧菌，染染菌：染好氧菌，染厌氧菌氧菌10（4）泡沫）泡沫过多多 泡沫的消泡沫的消长不符合不符合规律；律； 原因：培养基原因：培养基灭菌菌时温度温度过高或高或时间过长，葡萄糖，葡萄糖变成成氨基糖会引起泡沫。氨基糖会引起泡沫。（5）菌体）菌体浓度度过高或高或过低低 原因；罐温原因；罐温长时间偏高；溶氧不足；偏高；溶氧不
8、足；营养条件差；种子养条件差；种子质量差；菌体自溶。量差；菌体自溶。11（二）染菌的（二）染菌的检查与判断与判断1、染菌的、染菌的检查（1）显微微镜检查法（最法（最简单、最直接、最、最直接、最经常）常）（2）平板划）平板划线培养或斜面培养培养或斜面培养检查法；法； 平板制好后，平板制好后，应先保温先保温24小小时，确定无菌，确定无菌（3）肉）肉汤培养基培养基检查法（酚法（酚红变色）色）122、检查法的不足法的不足 以上以上3种种检查法未法未发现染菌，染菌，还不能肯定未不能肯定未被染菌；被染菌； 原因是以上原因是以上检查法只能法只能检查杂菌菌浓度度较大的大的染菌情况（染菌情况（1个个/ml）13
9、3、发酵酵过程的异常程的异常现象来判断染菌象来判断染菌（1）溶解氧水平异常）溶解氧水平异常显示染菌（谷氨酸）示染菌（谷氨酸）-正常 异常 异常14（2）排气中）排气中CO2异常异常显示染菌示染菌CO2的含量的含量变化是有化是有规律的；律的；染菌引起糖的消耗染菌引起糖的消耗变化，染好氧性化，染好氧性杂菌，糖菌，糖耗加快，耗加快， CO2含量增加；染噬菌体，糖耗减含量增加；染噬菌体，糖耗减慢，慢， CO2含量减少。含量减少。15（三）（三）发酵染菌率和染菌原因分析酵染菌率和染菌原因分析1、发酵的染菌率酵的染菌率发酵染菌批数发酵染菌批数总投料批数总投料批数总染菌率总染菌率 100 染菌率与发酵的菌种
10、、培养基、产品性质、染菌率与发酵的菌种、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件设备和管理技术水发酵周期、生产环境条件设备和管理技术水平等有关。平等有关。162、染菌原因分析、染菌原因分析（1）染菌原因分析就是）染菌原因分析就是总结染菌的教染菌的教训，防范于未，防范于未然。然。（2）主要染菌原因：种子）主要染菌原因：种子带菌，无菌空气菌，无菌空气带菌，菌，设备渗漏，渗漏，灭菌不菌不彻底，操作管理不当。底，操作管理不当。17日本抗生素发酵染菌原因分析(1965年前)18上海第三制药1961年310月染菌原因分析19（3）染菌的）染菌的杂菌种菌种类分析分析 杂菌是耐菌是耐热的芽的芽孢杆菌：（杆菌：
11、（灭菌、死角）菌、死角） 杂菌是不耐菌是不耐热菌：菌： （种子（种子带菌、空气菌、空气带菌，菌，设备渗漏，管理操作等）渗漏，管理操作等） 杂菌是真菌菌是真菌20（4）染菌的）染菌的规模分析模分析 大批量大批量发酵罐染菌：种子、空气；酵罐染菌：种子、空气； 前期：种子前期：种子带菌，菌，灭菌菌问题； 中后期：空气中后期：空气带菌；菌； 部分部分发酵罐染菌：酵罐染菌： 个个别发酵罐酵罐连续染菌：染菌：设备渗漏渗漏21（5）染菌的）染菌的时间分析分析 种子培养种子培养阶段：段： 种子，种子，灭菌，操作；菌，操作；发酵前期：酵前期： 种子，种子，灭菌，操作；菌，操作；发酵后期：酵后期： 空气，空气，补
12、料，料，设备渗漏，泡沫渗漏，泡沫22（四）染菌途径及（四）染菌途径及预防防1、种子、种子带菌的防止菌的防止（1）培养基及用具）培养基及用具灭菌要菌要彻底，底，应防止假防止假压；（2）菌种在）菌种在转接接过程中受程中受污染：操作不当，管理不染：操作不当，管理不严；（；（缓冲冲间）（3）菌种在培养或保存）菌种在培养或保存过程中受程中受污染染（试管塞，管塞，查看的看的时候要注意）候要注意）2、无菌空气、无菌空气带菌及其防止：菌及其防止： 流程流程设计，介，介质灭菌菌233、培养基和、培养基和设备灭菌不菌不彻底底导致染菌及防治致染菌及防治（1）原料性状：淀粉）原料性状：淀粉质原料，升温原料，升温过快或
13、混合不均匀，易快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的活菌不易中包埋的活菌不易杀灭；可升温前；可升温前搅拌和加淀拌和加淀粉粉酶。（2）实罐罐灭菌菌时未充分排除罐内空气：造成假未充分排除罐内空气：造成假压，升温，升温时，应打开排气等打开排气等阀门放气。放气。24（3）连续灭菌菌时，蒸汽，蒸汽压力波力波动大，培养基未达到大，培养基未达到灭菌温菌温度，度，导致致灭菌不菌不彻底。底。（4）设备和管道存在和管道存在“死角死角” 死角：由于操作、死角：由于操作、设备结构、安装或人构、安装或人为造成的屏障造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定定应该到达
14、的局部到达的局部灭菌部位，从而不能达到菌部位，从而不能达到彻底底灭菌的要求。菌的要求。25 常常见的的设备、管道、管道“死角死角” 发酵罐的酵罐的“死角死角”：不：不锈钢衬里破裂造成死角，里破裂造成死角，发酵罐罐酵罐罐底底脓疱状疱状积垢垢。26 罐底的加强板27管道安装不当形成的死角 法兰的“死角”a 垫圈内圆过小 b 垫圈内圆过大c 法兰不平造成的泄露与“死角”28灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法29 压力表安装不合理形成“死角”1、6-发酵罐 2-缓冲管 3、4-压力表 5-旋塞304、设备渗漏引起的染菌及其防止渗漏引起的染菌及其防止 （1）发酵酵设备、管道、管道、阀门长期使用，由
15、于腐期使用，由于腐蚀、摩擦和、摩擦和振振动等原因，造成渗漏。等原因，造成渗漏。 （2）微小渗漏的）微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚：加入碱性水，用浸湿酚酞 指示指示剂的白布擦，有渗漏的白布擦，有渗漏则白布白布显红色。色。315、操作失、操作失误导致染菌及其防治致染菌及其防治（1）灭菌菌过程中程中严防泡沫升防泡沫升顶，尽可能添加消泡，尽可能添加消泡剂防止泡沫大量防止泡沫大量产生；生；（2）传感器探感器探头用化学用化学试剂浸泡法浸泡法灭菌可能菌可能导致致灭菌不菌不彻底。底。32抗生素染菌实例分析1、现象： 一级种子罐连续染菌，菌型一致，均为芽孢杆菌，接种后24小时就当班片子种发现，量相当大。5
16、批染34批。罐内无搅拌，夹套降温，罐内无结垢，可以说无死角。332、分析母瓶无菌斜面正常，不接种的白料无菌试验罐也染菌（种子原因排除），消后无菌斜面正常，接种后12小时左右的斜面能镜检出杂菌（操作原因基本排除）。罐体内只有一取样管和一空气管，较干净，蒸汽压力和仪表温度对应良好，消毒工都有十几年的工作经验，操作问题不大（为了排除操作问题，我和技术员和消毒工共同消了几个罐，无菌仍不正常）。 判断有罐体内可能有料垢和死角。343、结论 根据我在生产中碰到和解决的无菌问题来看，靠罐阀的检修不到位造成的染菌占15左右，包括密封垫脱落、老化，阀头脱落，外漏，内漏等等，作大生产，要不有钱买好设备，要没钱必须
17、要有好的制度和好的操作工。根据我的生产经验看，买好设备要划算的多，染一罐少则损失几百元，多则几十万。356、噬菌体、噬菌体污染和防治染和防治 （1）、噬菌体）、噬菌体污染的染的预防防 严格活菌体排放，切断噬菌体的粮源格活菌体排放，切断噬菌体的粮源 做好做好环境境卫生，消生，消灭噬菌体与噬菌体与杂菌菌 严防噬菌体与防噬菌体与杂菌菌进入种子罐或入种子罐或发酵罐内酵罐内 抑制罐内噬菌体的生抑制罐内噬菌体的生长36（2）、）、污染噬菌体后的染噬菌体后的处理方法理方法 并罐法并罐法 转换使用菌种或使用抗性菌株使用菌种或使用抗性菌株 放罐重消法放罐重消法 罐内罐内灭噬菌体的方法噬菌体的方法 添加噬菌体抑制添加噬菌体抑制剂的方法的方法37 （五）染菌的挽救与（五）染菌的挽救与处理理 1、种子培养期染菌的、种子培养期染菌的处理理 灭菌、重新制种、倒种菌、重新制种、倒种 2、发酵前期染菌的酵前期染菌的处理理 3、发酵中后期染菌的酵中后期染菌的处理理 废液液应加加热至至120，保持，保持30min才能放罐。才能放罐。 4、染菌后、染菌后对设备的的处理理 重新使用前，重新使用前，应彻底清洗，空罐底清洗，空罐灭菌菌38作作业：1、不同染菌、不同染菌时期期对发酵有何影响。酵有何影响。2、试从染菌分析染菌的可能原因有哪几种？从染菌分析染菌的可能原因有哪几种？39The End40
