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1、微生物发酵工程微生物发酵工程6无菌保障无菌保障 v 6 无菌保障无菌保障提取困难pH 噬菌体细胞裂解产率下降产率下降污染污染的危害的危害2发酵工程发酵工程v；无菌的保障无菌的保障设备无死角种种子子，培培养养过过程程加加入入的的物物料料无无污污染染。培养基和生产环境灭菌培养基和生产环境灭菌好氧发酵过程空气除菌；好氧发酵过程空气除菌；3发酵工程发酵工程灭菌（除菌）的方法灭菌（除菌）的方法v培养基湿热灭菌培养基湿热灭菌 空气过滤除菌空气过滤除菌 发酵的污染与防治发酵的污染与防治6 无菌保障无菌保障4发酵工程发酵工程灭菌灭菌：用物理或化学方法杀灭或去除物：用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切生命
2、的过程。料或设备中一切生命的过程。一些化学药剂能一些化学药剂能使微生物中的蛋使微生物中的蛋白、酶及核酸白、酶及核酸发生反应。发生反应。 乙醇，乙醇，甲醛，氯，高锰甲醛，氯，高锰酸钾，环氧乙烷，酸钾，环氧乙烷，季銨盐，臭氧等。季銨盐，臭氧等。主要用于器械和主要用于器械和环境灭菌和消毒环境灭菌和消毒化学灭菌化学灭菌1160下保温下保温1-2h。要求保。要求保持干燥的器具持干燥的器具和材料。和材料。v干热灭菌干热灭菌34v利用饱和蒸利用饱和蒸汽进行灭菌。汽进行灭菌。有效，使用广有效，使用广泛。泛。2利用电磁波、利用电磁波、紫外线、紫外线、x射射线、线、r-射线等射线等射线灭菌射线灭菌湿热灭菌湿热灭菌
3、过滤除菌利用过过滤除菌利用过滤方法截流微生滤方法截流微生物，达到除菌的物，达到除菌的目的。适用于热目的。适用于热敏性培养基和制敏性培养基和制备无菌空气备无菌空气过过滤除菌滤除菌35发酵工程发酵工程v原理原理：当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质和酶的基本成分生质和酶的基本成分-蛋白质发生不可逆的变化，蛋白质发生不可逆的变化，使微生物在很短时间内死亡。使微生物在很短时间内死亡。v以能否杀死芽孢细菌为以能否杀死芽孢细菌为标准标准。v杀死微生物的极端温度称为杀死微生物的极端温度称为致死温度致死温度。 在致死温度在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为下，
4、杀死全部微生物所需的时间称为致死时间。致死时间。 v6.2 培养基湿热灭菌培养基湿热灭菌6发酵工程发酵工程v培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比正比。v即：即： dN/dt= -kNv式中：式中：N- 培养基中残留活菌数（培养基中残留活菌数（ 个）个）v t- 受热时间（受热时间（ min）v k- 反应速率常数或比死亡速率反应速率常数或比死亡速率（min-1）v一微生物的死亡速率与理论灭菌时间一微生物的死亡速率与理论灭菌时间7发酵工程发酵工程v 若开始灭菌时（若开始灭菌时（t=0）
5、，培养基中微生物的数），培养基中微生物的数量为量为N0， 将上式积分得将上式积分得：v lnN/N0=-ktv N= N0e-kt ( 对数残留定律对数残留定律)v lnN/N0=-ktv t = 1/k ln N0/Ntv t = 2.303 /k lg N0/Ntv 计算时，计算时，Nt 一般可取一般可取0.001，N0 可参照一可参照一般培养基中活微生物数，取（般培养基中活微生物数，取（1-2）X107而得而得。8发酵工程发酵工程灭菌灭菌时间时间污染程度污染程度灭菌程度灭菌程度k值值通常110-130， 5-20min培培养养液液采采用用高高温温短短时时间间加加热热的的方方式式，可可以以
6、达达到到彻彻底底灭灭菌菌并并且且减减少少对对培培养养液液成成分分的的破破坏坏。9发酵工程发酵工程kK值越大，值越大， 微微生物越容易死生物越容易死亡亡10发酵工程发酵工程 即即: k =Ae - E/RTv式中：式中： A-频率因子频率因子v E-杀死微生物所需的活化能杀死微生物所需的活化能v R-气体常数，气体常数，8.314 J/（mol K）v v Lg k = - 1 E /2.303 RT +lg Av耐热芽胞杆菌耐热芽胞杆菌 A 取作取作1.34X10 36s-1v E取取 2.844X105 J/molk值随着温度的变化遵循阿仑尼乌斯定律值随着温度的变化遵循阿仑尼乌斯定律11发酵
7、工程发酵工程v以以Lg k与与1/T作图，得一直线，从直线的斜率和截作图，得一直线，从直线的斜率和截距求得距求得 E和和A。v进而根据灭菌温度可以求出进而根据灭菌温度可以求出k值，值， 并计算出并计算出灭菌时灭菌时间。间。v一般杀灭微生物一般杀灭微生物营养细胞的营养细胞的 E值约为值约为2.09X105-2.71X105J/mol, 杀死微生物杀死微生物芽孢芽孢的的 E值约为值约为4.48X105 J/mol。 12发酵工程发酵工程v 因为加热灭菌过程中对培养基的破坏反应的速率因为加热灭菌过程中对培养基的破坏反应的速率常数也符合阿仑尼乌斯定律，常数也符合阿仑尼乌斯定律， 同理计算出了培养基同理
8、计算出了培养基中中某营养成分分解的某营养成分分解的 E，值值。v 一般一般酶和维生素酶和维生素等营养成分分解的等营养成分分解的 E，值为值为8.36X103- 8.36X104。13发酵工程发酵工程v 由于灭菌时杀死微生物的活化能由于灭菌时杀死微生物的活化能 E值值大于大于培培养基营养成分破坏的活化能养基营养成分破坏的活化能 E，值，值， 因此随着温因此随着温度的升高，灭菌速率常数增加的倍数度的升高，灭菌速率常数增加的倍数大于大于培养基中培养基中营养成分分解的速率常数的增加倍数。营养成分分解的速率常数的增加倍数。v lnk2/k1 E v lnk2/k1 E， v v 因此较高的灭菌温度，因此
9、较高的灭菌温度， 较短的灭菌时间能减少较短的灭菌时间能减少培养基营养成分的损耗。培养基营养成分的损耗。14发酵工程发酵工程v1分批灭菌，不计升温阶段所杀灭的菌数，分批灭菌，不计升温阶段所杀灭的菌数， t = 2.303 /k lg N0/Ntv 例例1有一发酵罐内装有一发酵罐内装40m3 培养基，培养基， 在在121温度温度下进行实罐灭菌。下进行实罐灭菌。 原污染程度为每原污染程度为每1mL 有有2X105 个耐个耐热细菌芽孢，热细菌芽孢，121 时灭菌速率常数为时灭菌速率常数为1.8min-1v 求求灭菌失败几率为灭菌失败几率为0.001 时所需要的灭菌时间时所需要的灭菌时间v 解：解：N0
10、 = 40 X106 X 2 X105 = 8X 1012个个v Nt= 0.001个个v K = 1.8 min-1v 灭菌时间：灭菌时间：t = 2.303 /1.8 lg （8X 1012/0.001） = 20.34minv二培养基灭菌时间的计算二培养基灭菌时间的计算15发酵工程发酵工程v例例2.若将例若将例1中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度131，此温度下灭菌速率为，此温度下灭菌速率为15min-1。求灭菌所。求灭菌所需的维持时间。需的维持时间。v解：解：C0=2X105(个个/ml)v Cs=1/40X106X1000= 2.5X10-11 (个个/
11、ml)v v 灭菌所需的时间灭菌所需的时间v t = 2.303 /15 lg （2X 105/2.5X10-11）v = 2.37min16发酵工程发酵工程v1分批灭菌分批灭菌：将配制好的培养基放在发酵罐或其将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所有设备仪器灭菌他容器中，通入蒸汽将培养基和所有设备仪器灭菌的操作过程，也称的操作过程，也称实罐灭菌。实罐灭菌。 分批分批灭菌灭菌优点优点缺点缺点设备投资少，灭设备投资少，灭菌效果可靠，菌效果可靠，对蒸汽要求低对蒸汽要求低（0.2-0.3MPa）。）。培养基破坏作用大，培养基破坏作用大， 操作难于自动化。操作难于自动化。v三培养基
12、的灭菌：三培养基的灭菌：17发酵工程发酵工程18发酵工程发酵工程19发酵工程发酵工程20发酵工程发酵工程v 将配制好的培养基在高温快速的情况下，向发将配制好的培养基在高温快速的情况下，向发酵罐输送的同时经过加温，保温，冷却的过程进行酵罐输送的同时经过加温，保温，冷却的过程进行灭菌。灭菌。v 2. 连续灭菌连续灭菌21发酵工程发酵工程设备利设备利用率高用率高蒸汽负蒸汽负荷均衡荷均衡便于自便于自动控制动控制营养成营养成分破坏少分破坏少22发酵工程发酵工程23发酵工程发酵工程24发酵工程发酵工程25发酵工程发酵工程6.3 空气过滤除菌空气过滤除菌 一、发酵用无菌空气的质量标准:发酵用的无菌空气,就是
13、将自然界的空气经过压缩,冷却,减湿,过滤等过程达到:26发酵工程发酵工程 1v连续提供一定流量的压缩空气。连续提供一定流量的压缩空气。2空气的压强为空气的压强为0.2-0.4Mpa3进入过滤器之前，空气的相对湿度进入过滤器之前，空气的相对湿度 70%4进入发酵罐的空气温度可比培养温度高进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10-305v压缩空气的洁净度一般以失败概率为压缩空气的洁净度一般以失败概率为10-3为指标。为指标。27发酵工程发酵工程二二.空气除菌设备空气除菌设备28发酵工程发酵工程三三.空气净化的流程空气净化的流程v1. 空气的预处理空气的预处理v1). 采风塔采风塔: 10m ,上风头
14、上风头, 流速流速8m/s. v2). 粗过滤器粗过滤器:前置过滤器前置过滤器, 拦截空气中较大的灰尘以保护拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机空气压缩机,同时减轻总过滤器的负担同时减轻总过滤器的负担.过滤介质采用泡沫过滤介质采用泡沫塑料或无纺布塑料或无纺布.实际流速为实际流速为0.1-5 m/s.v3). 空气压缩机空气压缩机: 提供动力以克服随后各设备的阻力提供动力以克服随后各设备的阻力.v4). 空气贮罐空气贮罐: 主要为消除压缩机空气的脉动主要为消除压缩机空气的脉动, 特别是对特别是对于往复式空压机于往复式空压机.29发酵工程发酵工程v5). 冷却器冷却器: 温度温度120左右左右,必
15、须冷却。降湿。必须冷却。降湿。v6). 气液分离设备气液分离设备: 除去空气中的水和油保护过滤介质除去空气中的水和油保护过滤介质.有有利用离心力沉降的旋风分离器利用离心力沉降的旋风分离器,和利用惯性拦截的介质分和利用惯性拦截的介质分离器离器.v旋风分离器旋风分离器：利用离心力进行气液和气固沉降分离的设备。利用离心力进行气液和气固沉降分离的设备。结构简单，阻力小，分离效率高。可去除空气中绝大多数结构简单，阻力小，分离效率高。可去除空气中绝大多数的的20m以上的液滴。但是以上的液滴。但是10m左右的液滴，除去效左右的液滴，除去效率只有率只有60-70% 。 v丝网除沫器丝网除沫器：可除去可除去1m
16、以上的雾滴，去除率为以上的雾滴，去除率为98%。 v7）.空气加热设备空气加热设备v此时的压缩空气湿度为此时的压缩空气湿度为100% 30发酵工程发酵工程31发酵工程发酵工程32发酵工程发酵工程v 2空气的过滤除菌空气的过滤除菌过滤过滤介质介质绝对过滤绝对过滤深度过滤深度过滤介质的空隙介质的空隙小于被拦截的小于被拦截的微生物大小，微生物大小，如用聚四氟乙如用聚四氟乙烯或纤维素酯烯或纤维素酯材料做成的微材料做成的微孔滤膜。孔滤膜。介质孔隙大于介质孔隙大于被拦截的微生物被拦截的微生物大小，但介质有大小，但介质有一定厚度，机理一定厚度，机理是静电，扩散，是静电，扩散，惯性及拦截作用。惯性及拦截作用。
17、 如棉花过滤器，如棉花过滤器，超细玻璃纤维纸，超细玻璃纤维纸，金属烧结管等。金属烧结管等。33发酵工程发酵工程v1). 纤维及颗粒状介质的过滤器纤维及颗粒状介质的过滤器 ：用于总过滤器。：用于总过滤器。玻璃纤维玻璃纤维活性炭活性炭棉花棉花34发酵工程发酵工程v棉花棉花：未脱脂棉花，未脱脂棉花， 纤维直径为纤维直径为16-20m， 其实密度为其实密度为1520Kg/m3。填充率为。填充率为8.5-10%。 v玻璃纤维玻璃纤维：用无碱的玻璃纤维介质作为过滤介质。用无碱的玻璃纤维介质作为过滤介质。纤维直径为纤维直径为3-20m， 其实密度为其实密度为2600Kg/m3。填充率为。填充率为5-11%。
18、 v活性炭活性炭：常与纤维状介质分层堆放成过滤床。常与纤维状介质分层堆放成过滤床。v通过过滤器的气流速度一般为通过过滤器的气流速度一般为0.2-0.3m/s, 相相应的压力降也较小。应的压力降也较小。35发酵工程发酵工程36发酵工程发酵工程v过滤器进行灭菌时，一般是自上而下通入过滤器进行灭菌时，一般是自上而下通入0.2-0.4 Mpa的蒸汽，灭菌的蒸汽，灭菌45min后用压缩空气吹后用压缩空气吹干备用。总过滤器约每月灭菌一次。干备用。总过滤器约每月灭菌一次。37发酵工程发酵工程v介质介质:超细玻璃纤维纸。超细玻璃纤维纸。v孔径孔径:1-1.5mv厚度厚度: 0.25-0.4mmv实密度实密度:
19、2600Kg/m3v填充率填充率:14.8%。除菌效率高，阻除菌效率高，阻力小，强度低。力小，强度低。用酚醛树脂，甲用酚醛树脂，甲基丙烯酸树脂等基丙烯酸树脂等处理以提高防湿处理以提高防湿能力能力用多孔板夹住提用多孔板夹住提高其抗冲击能力。高其抗冲击能力。2). 滤纸过滤器：滤纸过滤器：38发酵工程发酵工程39发酵工程发酵工程v3）金属烧结管空气过滤器：）金属烧结管空气过滤器：v压缩空气进入壳程，通过金属微孔滤管的壁除去杂菌和颗粒，压缩空气进入壳程，通过金属微孔滤管的壁除去杂菌和颗粒，得到的无菌空气由管程排出。得到的无菌空气由管程排出。使用寿命长，耐使用寿命长，耐高热，气体阻力高热，气体阻力小，
20、安装维修方小，安装维修方便。便。空气预过滤器和空气预过滤器和蒸汽过滤器。蒸汽过滤器。40发酵工程发酵工程v4）微孔膜过滤器）微孔膜过滤器-绝对过滤器：绝对过滤器：v 由耐高温，疏水的，厚度为由耐高温，疏水的，厚度为150m的聚四氟乙烯薄膜的聚四氟乙烯薄膜构成。能绝对滤除所有的大于构成。能绝对滤除所有的大于0.01m 以上的微粒，能除以上的微粒，能除去几乎所有空气中夹带的微生物。去几乎所有空气中夹带的微生物。 过滤器体积小，处理过滤器体积小，处理量大，压降小，除菌量大，压降小，除菌效率高效率高41发酵工程发酵工程42发酵工程发酵工程v3空气净化的流程空气净化的流程：粗粗过过滤滤器器一一级级冷冷却
21、却器器空空气气加加热热器器分分过过滤滤器器无无菌菌空空气气二二级级冷冷却却器器分分水水器器空空气气贮贮罐罐旋旋风风分分离离器空空气气压压缩缩机机丝丝网网除除末末器器空空气气吸吸气气口口总总过过滤滤器器43发酵工程发酵工程v1）.两级冷却，加热除菌流程两级冷却，加热除菌流程v特点特点：两次冷却，两次分离，适当加热。两次冷却，两次分离，适当加热。v 适应性广，充分分离油水，节约冷却水。适应性广，充分分离油水，节约冷却水。44发酵工程发酵工程v2）.冷热空气直接混合式空气除菌流程冷热空气直接混合式空气除菌流程v特点：特点：省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设备
22、，备， 流程比较简单，冷却水用量少。适用于中等湿流程比较简单，冷却水用量少。适用于中等湿度的地区。度的地区。45发酵工程发酵工程v3）.高效前置过滤空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程46发酵工程发酵工程v4影响介质过滤效率的因素：影响介质过滤效率的因素：v 介质过滤效率指被介质层捕集的尘埃颗粒与空介质过滤效率指被介质层捕集的尘埃颗粒与空气中原有颗粒数之比。气中原有颗粒数之比。v = N1-N2/ N1过滤过滤效率效率纤维纤维直径直径填充填充密度密度空气空气流速流速滤层滤层厚度厚度47发酵工程发酵工程设计合理设计合理预处理设备预处理设备 选择合适选择合适净化流程净化流程保证进口保证进口空气的洁空气的洁净度。净度。降低空气降低空气相对湿度相对湿度保证过滤保证过滤介质干燥介质干燥合理空气合理空气过滤器，除过滤器，除菌效率菌效率高的过滤高的过滤介质介质48发酵工程发酵工程
