《大肠杆菌感受态细胞的制备和转化参考PPT》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大肠杆菌感受态细胞的制备和转化参考PPT（23页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 1 1分分子子生生物物学学2008实实验验一一. . 实验目的实验目的学学习习SDS-PAGESDS-PAGE测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量的原理。的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。运运用用SDS-PAGESDS-PAGE测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量及染色鉴定。及染色鉴定。分分子子生生物物学学2008实实验验 二二 . .实验原理实验原理带带带带电电电电质质质质点点点点在在在在电电电电场场场场中中中中向向向向带带带带有有有有异异异异相相相相电电电电荷荷荷荷的的的的电电电电
2、极极极极移移移移动动动动，这这这这种种种种现现现现象称为电泳象称为电泳象称为电泳象称为电泳。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。区区区区带带带带电电电电泳泳泳泳是是是是在在在在半半半半固固固固相相相相或或或或胶胶胶胶状状状状介介介介质质质质上上上上加加加加一一一一个个个个点点点点或或或或一一一一薄薄薄薄层层层层样样样样品品品品溶溶溶溶液液液液，然然然然后后后后加加加加电电电电场场场场，分分分分子子子子在在在在支支支支持持持持介介介介质质质质上上上上或或或或
3、支支支支持持持持介介介介质质质质中中中中迁迁迁迁移移移移。支支支支持持持持介介介介质质质质的的的的作作作作用用用用主主主主要要要要是是是是为为为为了了了了防防防防止止止止机机机机械械械械干干干干扰扰扰扰和和和和由由由由于于于于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。区区区区带带带带电电电电泳泳泳泳使使使使用用用用不不不不同同同同的的的的支支支支持持持持介介介介质质质质，早早早早期期期期有有有有滤滤滤滤纸纸纸纸、玻玻玻玻璃璃璃璃珠珠珠珠、淀淀淀淀粉粉粉粉粒粒粒粒
4、、纤纤纤纤维维维维素素素素粉粉粉粉、海海海海砂砂砂砂、海海海海绵绵绵绵、聚聚聚聚氯氯氯氯乙乙乙乙烯烯烯烯树树树树脂脂脂脂；以以以以后后后后有有有有淀淀淀淀粉粉粉粉凝凝凝凝胶胶胶胶、琼琼琼琼脂脂脂脂凝凝凝凝胶胶胶胶、醋醋醋醋酸酸酸酸纤纤纤纤维维维维素素素素膜膜膜膜，现现现现在在在在则则则则多多多多用用用用聚聚聚聚丙烯酰胺（丙烯酰胺（丙烯酰胺（丙烯酰胺（PAGEPAGEPAGEPAGE）和琼脂糖凝胶。）和琼脂糖凝胶。）和琼脂糖凝胶。）和琼脂糖凝胶。分分子子生生物物学学2008实实验验PAGEPAGE根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，分分为为连连续续系系统统和和不不连连续续系系统统两两大大类类，
5、连连续续系系统统电电泳泳体体系系中中缓缓冲冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度度相相同同，带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下下，主主要要靠靠电电荷荷和和分分子子筛筛效效应应。不不连连续续系系统统中中由由于于缓缓冲冲液液离离子子成成分分，pHpH，凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性，带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应，分分子子筛筛效效应应，还还具具有有浓浓缩缩效效应应，因因而而其其分分离离条条带带清晰度及分辨率均较前者佳。清晰度及分辨率均较前者佳。分分子子生生物物学学2008实实验验SDS-SDS-SDS-SDS-聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯
6、烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳，是是是是在在在在聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶系系系系统统统统中中中中引引引引进进进进SDSSDSSDSSDS（十十十十二二二二烷烷烷烷基基基基磺磺磺磺酸酸酸酸钠钠钠钠）， SDSSDSSDSSDS能能能能断断断断裂裂裂裂分分分分子子子子内内内内和和和和分分分分子子子子间间间间氢氢氢氢键键键键，破破破破坏坏坏坏蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的二二二二级级级级和和和和三三三三级级级级结结结结构构构构，强强强强还还还还原原原原剂剂剂剂能能能能使使使使半半半半胱胱胱胱氨氨氨氨酸酸酸酸之之之之间间间间的的的的二二二二硫硫硫硫
7、键键键键断断断断裂裂裂裂，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质在在在在一一一一定定定定浓浓浓浓度度度度的的的的含含含含有有有有强强强强还还还还原原原原剂剂剂剂的的的的SDSSDSSDSSDS溶溶溶溶液液液液中中中中，与与与与SDSSDSSDSSDS分分分分子子子子按按按按比比比比例例例例结结结结合合合合，形形形形成成成成带带带带负负负负电电电电荷荷荷荷的的的的SDS-SDS-SDS-SDS-蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质复复复复合合合合物物物物，这这这这种种种种复复复复合合合合物物物物由由由由于于于于结结结结合合合合大大大大量量量量的的的的SDSSDSSDSSDS，使使使使蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质丧丧丧丧失失失
8、失了了了了原原原原有有有有的的的的电电电电荷荷荷荷状状状状态态态态形形形形成成成成仅仅仅仅保保保保持持持持原原原原有有有有分分分分子子子子大大大大小小小小为为为为特特特特征征征征的的的的负负负负离离离离子子子子团团团团块块块块，从从从从而而而而降降降降低低低低或或或或消消消消除除除除了了了了各各各各种种种种蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子之之之之间间间间天天天天然然然然的的的的电电电电荷荷荷荷差差差差异异异异，由由由由于于于于SDSSDSSDSSDS与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的结结结结合合合合是是是是按按按按重重重重量量量量成成成成比比比比例例例例的的的的，因因因因此此此此
9、在在在在进进进进行行行行电电电电泳泳泳泳时时时时，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子的的的的迁迁迁迁移移移移速速速速度度度度取取取取决决决决于于于于分分分分子子子子大大大大小小小小。当当当当分分分分子子子子量量量量在在在在15KD15KD15KD15KD到到到到200KD200KD200KD200KD之之之之间间间间时时时时，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的迁迁迁迁移移移移率率率率和和和和分分分分子子子子量量量量的的的的对对对对数数数数呈呈呈呈线线线线性性性性关关关关系系系系，符符符符合合合合下下下下式式式式：logMW=K-bXlogMW=K-bXlogMW=K-bXlogMW=K-b
10、X，式式式式中中中中：MWMWMWMW为为为为分分分分子子子子量量量量，X X X X为为为为迁迁迁迁移移移移率率率率，k k k k、b b b b均均均均为为为为常常常常数数数数，若若若若将将将将已已已已知知知知分分分分子子子子量量量量的的的的标标标标准准准准蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的迁迁迁迁移移移移率率率率对对对对分分分分子子子子量量量量对对对对数数数数作作作作图图图图，可可可可获获获获得得得得一一一一条条条条标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线，未未未未知知知知蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质在在在在相相相相同同同同条条条条件件件件下下下下进进进进行行行行电电电电泳泳泳泳，根根根根据据据据它
11、它它它的的的的电电电电泳泳泳泳迁迁迁迁移移移移率率率率即即即即可可可可在在在在标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线上上上上求求求求得分子量。得分子量。得分子量。得分子量。分分子子生生物物学学2008实实验验 SDSSDSSDSSDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与是样品制备过程中蛋白质与是样品制备过程中蛋白质与是样品制备过程中蛋白质与SDSSDSSDSSDS的结合程度。影的结合程度。影的结合程度。影的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：响它们结合的因素主要有三
12、个：响它们结合的因素主要有三个：响它们结合的因素主要有三个：1)1)1)1)溶液中溶液中溶液中溶液中SDSSDSSDSSDS单体的浓度，当单体浓度大于单体的浓度，当单体浓度大于单体的浓度，当单体浓度大于单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L1mmol/L1mmol/L1mmol/L时大多数蛋白质与时大多数蛋白质与时大多数蛋白质与时大多数蛋白质与SDSSDSSDSSDS结合的重量比结合的重量比结合的重量比结合的重量比为为为为1:1.41:1.41:1.41:1.4，如果单休浓度降到如果单休浓度降到如果单休浓度降到如果单休浓度降到0.5 0.5 0.5 0.5 mmolmmolmmolmmol/
13、L/L/L/L以下以下以下以下时，两者的结合比仅为时，两者的结合比仅为时，两者的结合比仅为时，两者的结合比仅为1: 0.41: 0.41: 0.41: 0.4这样就不能消除蛋这样就不能消除蛋这样就不能消除蛋这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDSSDSSDSSDS的充的充的充的充分结合，它们的重量比应该为分结合，它们的重量比应该为分结合，它们的重量比应该为分结合，它们的重量比应该为1:41:41:41:4或或或或1:31:31:31:32)2)2)2)样品缓冲液的离子强度。样品
14、缓冲液的离子强度。样品缓冲液的离子强度。样品缓冲液的离子强度。SDSSDSSDSSDS电泳的样品缓冲液电泳的样品缓冲液电泳的样品缓冲液电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是离子强度较低，通常是离子强度较低，通常是离子强度较低，通常是10101010100mmol/L100mmol/L100mmol/L100mmol/L3)3)3)3)二二二二硫键是否完全被还原硫键是否完全被还原硫键是否完全被还原硫键是否完全被还原分分子子生生物物学学2008实实验验采采采采用用用用SDS-SDS-SDS-SDS-聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳法法法法测测测测蛋蛋蛋蛋白白白
15、白质质质质分分分分子子子子量量量量时时时时，只只只只有有有有完完完完全全全全打打打打开开开开二二二二硫硫硫硫键键键键， 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子才才才才能能能能被被被被解解解解聚聚聚聚，SDSSDSSDSSDS才才才才能能能能定定定定量量量量地地地地结结结结合合合合到到到到亚亚亚亚基基基基上上上上而而而而给给给给出出出出相相相相对对对对迁迁迁迁移移移移率率率率和和和和分分分分子子子子量量量量对对对对数数数数的的的的线线线线性性性性关关关关系系系系。因因因因此此此此在在在在用用用用SDSSDSSDSSDS处处处处理理理理样样样样品品品品同同同同时时时时往往往往往往往往用用用用巯巯
16、巯巯基基基基乙乙乙乙醇醇醇醇处处处处理理理理，巯巯巯巯基基基基乙乙乙乙醇醇醇醇是是是是一一一一种种种种强强强强还还还还原原原原剂剂剂剂，它它它它使使使使被被被被还还还还原原原原的的的的二二二二硫硫硫硫键键键键不不不不易易易易再再再再氧氧氧氧化化化化，从从从从而而而而使使使使很很很很多多多多不不不不溶溶溶溶性性性性蛋蛋蛋蛋白质溶解而与白质溶解而与白质溶解而与白质溶解而与SDSSDSSDSSDS定量结合。定量结合。定量结合。定量结合。有有有有许许许许多多多多蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质是是是是由由由由亚亚亚亚基基基基（如如如如血血血血红红红红蛋蛋蛋蛋白白白白）或或或或两两两两条条条条以以以以上上上上肽
17、肽肽肽链链链链（如如如如胰胰胰胰凝凝凝凝乳乳乳乳蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶）组组组组成成成成的的的的，它它它它们们们们在在在在SDSSDSSDSSDS和和和和巯巯巯巯基基基基乙乙乙乙醇醇醇醇作作作作用用用用下下下下，解解解解离离离离成成成成亚亚亚亚基基基基或或或或单单单单条条条条肽肽肽肽链链链链，因因因因此此此此这这这这一一一一类类类类蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质，测测测测定定定定时时时时只只只只是是是是它它它它们们们们的的的的亚亚亚亚基基基基或单条肽链的或单条肽链的或单条肽链的或单条肽链的MWMWMWMW。已已已已发发发发现现现现有有有有些些些些蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质不不不不能能能能用用用用SD
18、S-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE测测测测定定定定分分分分子子子子量量量量。如如如如电电电电荷荷荷荷异异异异常常常常或或或或构构构构象象象象异异异异常常常常的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质，带带带带有有有有较较较较大大大大辅辅辅辅基基基基的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质（某某某某些些些些糖糖糖糖蛋蛋蛋蛋白白白白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。一般至少采用两种方法测定未知
19、样品的分子量，互相验证。一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。分分子子生生物物学学2008实实验验三三. . 实验试剂和器材实验试剂和器材 1.1.材料：材料：材料：材料： 低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒: : 低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶兔磷酸化酶兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 MW=66,200 兔肌动蛋白兔肌动蛋白兔肌动蛋白兔肌动蛋白 MW=43,000 M
20、W=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 MW=14,400 根据说明书处理标准蛋白根据说明书处理标准蛋白根据说明书处理标准蛋白根据说明书处理标准蛋白 样品：称样品：称样品：称样品：称3mg3mg样品，加样品，加样品，加样品，加2 ml2 ml蒸馏水溶解。蒸馏水溶解。蒸馏水溶解。蒸馏水溶解。分分子子生生物物学学2008实实验验2.实验试剂实验试剂 (1) 30%(1) 3
21、0%丙烯酰胺（丙烯酰胺（丙烯酰胺（丙烯酰胺（AcrAcr）：称）：称）：称）：称Acr30gAcr30g，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺 （BisBis）0.8g0.8g，加蒸馏水至，加蒸馏水至，加蒸馏水至，加蒸馏水至100ml100ml，过滤后置棕色瓶中，过滤后置棕色瓶中，过滤后置棕色瓶中，过滤后置棕色瓶中， 4 4贮存可用贮存可用贮存可用贮存可用1-21-2月。月。月。月。（2 2）10%SDS10%SDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（3 3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl1.5mol/L pH8.
22、8 Tris-HCl缓冲液：称取缓冲液：称取缓冲液：称取缓冲液：称取Tris18.2gTris18.2g， 加入加入加入加入50ml50ml水，用水，用水，用水，用1mol/L1mol/L盐酸调盐酸调盐酸调盐酸调pH8.8pH8.8， 最后用蒸馏最后用蒸馏最后用蒸馏最后用蒸馏 水定容至水定容至水定容至水定容至100ml100ml。（4 4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取缓冲液：称取缓冲液：称取缓冲液：称取Tris12.1gTris12.1g，加，加，加，加 入入入入50ml50ml水，用水，用水，用水，用1mol/L1mol/L
23、盐酸调盐酸调盐酸调盐酸调pH6.8pH6.8， 最后用蒸馏水最后用蒸馏水最后用蒸馏水最后用蒸馏水 定容至定容至定容至定容至100ml100ml。（5 5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取缓冲液：称取缓冲液：称取缓冲液：称取Tris0.6gTris0.6g，加，加，加，加 入入入入50ml50ml水，用水，用水，用水，用1mol/L1mol/L盐酸调盐酸调盐酸调盐酸调pH8.0pH8.0，最后用蒸馏水定，最后用蒸馏水定，最后用蒸馏水定，最后用蒸馏水定 容至容至容至容至100ml100ml。分分子子生生物物学学2008实实验验（7
24、 7）10%10%过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵(AP)(AP)（8 8）TEMEDTEMED（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）（9 9）样品溶解液：）样品溶解液：）样品溶解液：）样品溶解液：SDSSDS（100mg100mg）+ +巯基乙醇（巯基乙醇（巯基乙醇（巯基乙醇（0.1ml0.1ml）+ + 溴酚蓝（溴酚蓝（溴酚蓝（溴酚蓝（2mg2mg）+ +甘油（甘油（甘油（甘油（2g2g） +0.05mol/L pH8.0Tris- +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl HCl（2ml2ml），最后定容至），最后定容至），最后定容至），最后定容至10
25、ml10ml。（1010）固定液：取）固定液：取）固定液：取）固定液：取50%50%甲醇甲醇甲醇甲醇454ml454ml，冰乙酸，冰乙酸，冰乙酸，冰乙酸46ml46ml混匀。混匀。混匀。混匀。（1111）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125gR250 0.125g，加上述固定液，加上述固定液，加上述固定液，加上述固定液 250ml 250ml， 过滤后备用。过滤后备用。过滤后备用。过滤后备用。（1212）脱色液：冰乙酸）脱色液：冰乙酸）脱色液：冰乙酸）脱色液：冰乙酸75ml75ml，甲醇，甲醇，甲醇，甲醇50ml50
26、ml，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至1000ml1000ml。（1313）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含0.1%SDS0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘甘甘甘氨酸缓冲液氨酸缓冲液氨酸缓冲液氨酸缓冲液pH8.3pH8.3）：称）：称）：称）：称Tris6.0gTris6.0g，甘，甘，甘，甘 氨酸氨酸氨酸氨酸28.8g28.8g，加入，加入，加入，加入SDS1gSDS1g，加，加，加，加蒸馏水使其溶解后定容至蒸馏水使其溶解后定容至蒸馏水使其溶
27、解后定容至蒸馏水使其溶解后定容至1000ml1000ml。分分子子生生物物学学2008实实验验3. 3. 实验器材实验器材实验器材实验器材l l垂直板电泳装置垂直板电泳装置垂直板电泳装置垂直板电泳装置l l直流稳压电源直流稳压电源直流稳压电源直流稳压电源l l移液管移液管移液管移液管l l滤纸滤纸滤纸滤纸 l l微量注射器微量注射器微量注射器微量注射器l l大培养皿大培养皿大培养皿大培养皿分分子子生生物物学学2008实实验验各部分凝胶配制各部分凝胶配制分分子子生生物物学学2008实实验验四四. . 实验过程实验过程 1.1.1.1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏
28、水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, , , , 准备准备准备准备2 2 2 2个干净的锥个干净的锥个干净的锥个干净的锥形瓶形瓶形瓶形瓶. . . .2.2.2.2.把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好. . . .固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板坏玻璃板坏玻璃板坏玻璃板. . . .3.3.3.3.按比例配好分离胶按比例配好分离胶按比例配好分离胶按比例配好分离胶, , , ,用移液管快速加入
29、用移液管快速加入用移液管快速加入用移液管快速加入, , , ,大约大约大约大约5 5 5 5厘厘厘厘米左右米左右米左右米左右, , , ,之后加少许蒸馏水之后加少许蒸馏水之后加少许蒸馏水之后加少许蒸馏水, , , ,静置静置静置静置40404040分钟分钟分钟分钟. . . .凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速, , , , 催化剂催化剂催化剂催化剂TEMEDTEMEDTEMEDTEMED要在注胶前要在注胶前要在注胶前要在注胶前再加入再加入再加入再加入, , , ,否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶. . . .注胶过程最好一
30、次性注胶过程最好一次性注胶过程最好一次性注胶过程最好一次性完成完成完成完成, , , ,避免产生气泡避免产生气泡避免产生气泡避免产生气泡. . . .分分子子生生物物学学2008实实验验 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气空气空气空气 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面界面界面界面. . . .4.4.4.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸
31、干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干, , , ,按比例配好按比例配好按比例配好按比例配好浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶, , , ,连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm5mm5mm5mm处处处处, , , ,迅速迅速迅速迅速插入样梳插入样梳插入样梳插入样梳, , , ,静置静置静置静置40404040分钟分钟分钟分钟. . . . 样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入, , , ,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡梳口处
32、不得有气泡, , , ,梳底梳底梳底梳底需水平需水平需水平需水平. . . .分分子子生生物物学学2008实实验验5.5.5.5. 在上槽内加入缓冲液后在上槽内加入缓冲液后在上槽内加入缓冲液后在上槽内加入缓冲液后, , , ,拔出样梳拔出样梳拔出样梳拔出样梳。 要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出, , , ,否则会影响加样效果否则会影响加样效果否则会影响加样效果否则会影响加样效果. . . .6 6 6 6、加样加样加样加样（1 1）取取取取10l10l标准蛋白溶解液于标准蛋白溶解液于标准蛋白溶解液于标准蛋白溶解液于EPEP
33、管内，再加入管内，再加入管内，再加入管内，再加入10l 10l 2 2倍样品缓冲液，上样量为倍样品缓冲液，上样量为倍样品缓冲液，上样量为倍样品缓冲液，上样量为10l10l。 （2 2）取取取取10l10l样品溶液，再加入样品溶液，再加入样品溶液，再加入样品溶液，再加入10l 210l 2倍样品缓冲液，上样量倍样品缓冲液，上样量倍样品缓冲液，上样量倍样品缓冲液，上样量分别为分别为分别为分别为5l5l和和和和3l3l。7.7.7.7.用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三分之一处进样, , , ,加样前加样前加样前加样前
34、, , , ,样品在样品在样品在样品在 沸水中加热沸水中加热沸水中加热沸水中加热3 3 3 3分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳态聚合。 注射器不可过低注射器不可过低注射器不可过低注射器不可过低, , , ,以防刺破胶体以防刺破胶体以防刺破胶体以防刺破胶体, , , ,也不可过高也不可过高也不可过高也不可过高, , , ,在样下在样下在样下在样下 沉时会发生扩散沉时会发生扩散沉时会发生扩散沉时会发生扩散. . . . 为避免边缘效应为避免边缘效应为避免边缘效应为避免边缘效应, , , ,最好选用中部的孔注样最好选用中部的孔注样最好选用中部的孔注样最
35、好选用中部的孔注样. . . .分分子子生生物物学学2008实实验验8.8.8.8.电泳槽中加入缓冲液电泳槽中加入缓冲液电泳槽中加入缓冲液电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳接通电源，进行电泳接通电源，进行电泳接通电源，进行电泳，开始电流恒，开始电流恒，开始电流恒，开始电流恒定在定在定在定在10mA10mA，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为20mA20mA，溴酚蓝距凝胶边缘，溴酚蓝距凝胶边缘，溴酚蓝距凝胶边缘，溴酚蓝距凝胶边缘约约约约5mm5mm时，停止电泳。时，停止电泳。时，停止电泳。时，停止电泳。 9.9.9.9.凝胶板剥离凝胶板剥离凝胶板剥
36、离凝胶板剥离与与与与染色染色染色染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1 1小时左右。小时左右。小时左右。小时左右。10.10.10.10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再
37、用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。色，直到蛋白质区带清晰。色，直到蛋白质区带清晰。色，直到蛋白质区带清晰。 剥胶时要小心剥胶时要小心剥胶时要小心剥胶时要小心, , , ,保持胶完好无损保持胶完好无损保持胶完好无损保持胶完好无损, , , ,染色要充分染色要充分染色要充分染色要充分. . .11.11.11.11.实验结果分析实验结果分析实验结果分析实验结果分析。分分子子生生物物学学2008实实验验五五. .分析计算分析计算绘制标准曲线：绘制标准曲线：绘制标准曲线：绘制标准曲线： 按下式计算相对迁移率：按下式计算相对迁移率：按下式计算相对迁移率：按下式计算相对迁移率： 以每个蛋白标准的分子量对数
38、对它的以每个蛋白标准的分子量对数对它的以每个蛋白标准的分子量对数对它的以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未相对迁移率作图得标准曲线，量出未相对迁移率作图得标准曲线，量出未相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，知蛋白的迁移率即可测出其分于量，知蛋白的迁移率即可测出其分于量，知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的这样的标难曲线只对同一块凝胶上的这样的标难曲线只对同一块凝胶上的这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。样品的分子量测定才具有可靠性。样品的分子量测定才具有可靠性。样品的分子量测定才具有可
39、靠性。分分子子生生物物学学2008实实验验六六. .思考题思考题在在不不连连续续体体系系SDS-PAGESDS-PAGE中中, ,当当分分离离胶胶加加完完后后, ,需在其上加一层水需在其上加一层水, ,为什么为什么? ?样品溶解液中各种试剂的作用是什么样品溶解液中各种试剂的作用是什么? ?在在不不连连续续体体系系SDS-PAGESDS-PAGE中中, ,分分离离胶胶与与浓浓缩缩胶中均含有胶中均含有TEMEDTEMED和和AP,AP,试述其作用试述其作用? ?分分子子生生物物学学2008实实验验注意事项注意事项丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的最大暴露量不超
40、过最大暴露量不超过0.5g/kg，皮肤接触可，皮肤接触可致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作机能失调、四肢无力等。机能失调、四肢无力等。丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤不要接触皮肤，戴手套、口罩操作不要接触皮肤，戴手套、口罩操作分分子子生生物物学学2008实实验验没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近一定要催化充分，使之完全聚合一定要催化充分，使之完全聚合集中处理，实验中全部的胶由专门受过训集中处理，实验中全部的胶由专门受过训练的人收集到一起，在一个特殊标明的容练的人收集到一起，在一个特殊标明
41、的容器中保存，并进一步催化使之反应完全，器中保存，并进一步催化使之反应完全，最后送交学校危险品仓库，统一处理。最后送交学校危险品仓库，统一处理。分分子子生生物物学学2008实实验验聚丙烯酰胺通常认为无毒，但是也要小心聚丙烯酰胺通常认为无毒，但是也要小心操作，因为其中可能留下少量没有聚合的操作，因为其中可能留下少量没有聚合的单体。单体。保护实验仪器，不得损坏。保护实验仪器，不得损坏。分分子子生生物物学学2008实实验验凝胶浓度的计算凝胶浓度的计算l l聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度
42、、粘度和孔聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数径大小均取决于两个重要参数径大小均取决于两个重要参数径大小均取决于两个重要参数T T和和和和C C，T T是丙烯酰胺和甲叉双是丙烯酰胺和甲叉双是丙烯酰胺和甲叉双是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C C是与是与是与是与T T有关的交联百分有关的交联百分有关的交联百分有关的交联百分浓度。浓度。浓度。浓度。T T与与与与C C的计算公式是：的计算公式是：的计算公式是：的计算公式是：l l上式中上式中上式中上式中a a为丙烯酰胺的克数，为丙烯酰胺的克数，为丙烯酰胺的克数，为丙烯酰胺的克数，b b为甲叉双丙烯酰胺的克数，为甲叉双丙烯酰胺的克数，为甲叉双丙烯酰胺的克数，为甲叉双丙烯酰胺的克数，mm为水或缓冲液体积（为水或缓冲液体积（为水或缓冲液体积（为水或缓冲液体积（mlml）。式中）。式中）。式中）。式中a a与与与与b b的比例很重要。富有的比例很重要。富有的比例很重要。富有的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，弹性，且完全透明的凝胶，弹性，且完全透明的凝胶，弹性，且完全透明的凝胶，a a与与与与b b的重量比应在的重量比应在的重量比应在的重量比应在3030左右。左右。左右。左右。）23
