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1、Genetic Engineering1fx基因工程基因工程指按照，进行，并通过和等技术，赋予生物以，从而创造出更符合人们需要的和。又叫。人们的愿望严格的设计体外DNA重组转基因新的遗传特性新的生物类型生物产品DNA重组技术【必修II】基因工程又叫或。通俗地说，就是按照，把一种生物的某种 提取出来，加以 ，然后放到另一种生物的 里，定向地改造生物的。基因拼接技术DNA重组技术人的意愿基因修饰改造细胞遗传性状2fx基因工程基因工程的探索之路1、基础理论的突破：（1）的证明1944，艾弗里，肺炎双球菌的转化实验（2）的确立1953，沃森和克里克，DNA双螺旋结构模型（3）的破译1963，尼伦伯格和
2、马太，破译编码氨基酸的遗传密码DNA是遗传物质DNA双螺旋结构和中心法则遗传密码3fx基因工程2、技术发明使其实施成为可能：（1）的发现1967，罗思和海林斯基，质粒能自我复制并可转移（2）的发明1970，阿尔伯、内森斯和史密斯，第一个限制性内切酶（3）技术的发明1965，桑格，氨基酸序列分析技术；1977，DNA序列分析（4）的实现1972，伯格，构建第一个体外重组DNA分子（5）实验的成功1973，博耶和科恩，质粒和DNA片段重组（6）动物问世1980，第一个转基因小鼠（7）技术的发明1988，穆里斯基因工程的探索之路基因转移载体工具酶DNA合成和测序DNA体外重组重组DNA表达第一例转基
3、因PCR4fx基因工程基因工程的探索之路1、基础理论的突破：（1）的证明（2）的确立（3）的破译DNA是遗传物质DNA双螺旋结构和中心法则遗传密码2、技术发明使其实施成为可能：（1）的发现（2）的发明（3）技术的发明（4）的实现（5）实验的成功（6）动物问世（7）技术的发明基因转移载体工具酶DNA合成和测序DNA体外重组重组DNA表达第一例转基因PCR5fx基因工程必修必修IIII：运载体DNA连接酶选修：选修：(限制性核酸内切酶)11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）分子手术刀分子缝合针分子运输车限制酶基因的剪刀基因的针线基因的运输工具6fx基因工程11DNA重组技术的基本工具（
4、基因工程的专用工具）1、限制性核酸内切酶（限制酶）、限制性核酸内切酶（限制酶）（1）主要从 中分离纯化出来。（2）能识别 ，大多数的识别序列有 个核苷酸（48）。（3）切割 。原核生物双链DNA的特定核苷酸序列6（两个核苷酸之间的）磷酸二酯键7fx基因工程8fx基因工程EcoRI限制酶9fx基因工程形成形成2 2个个“黏性末端黏性末端”（反向互补）。（反向互补）。10fx基因工程1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶GAATTCCTTAAG EcoRGCTTAAAATTC G黏性末端黏性末端11fx基因工程CCCGGGCCCGGGGGGCCCGGGCCC1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶平
5、末端平末端 Sma12fx基因工程限制酶的作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 回文结构回文结构(palindrome) GAATTCCTTAAG3，5-磷酸二酯键磷酸二酯键13fx基因工程特点：11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）1、限制性核酸内切酶（限制酶）、限制性核酸内切酶（限制酶）（1）主要从 中分离纯化出来。（2）能识别 ，大多数的识别序列有 个核苷酸（48）。（3）切割 。原核生物双链DNA的特定核苷酸序列6（两个核苷酸之间的）磷酸二酯键1、限制性（特异性）2、回文序列3、平末端和黏性末端识别，切割，一种限制酶只能作用。特定
6、核苷酸序列特定位点一种序列或位点14fx基因工程11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）2、DNA连接酶连接酶（1）连接部位：（2）结果：形成(两个核苷酸)脱氧核糖和磷酸之间磷酸二酯键15fx基因工程2、DNA连接酶连接酶E.coli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶黏性末端黏性末端、平末端来源连接的末端来源连接的末端大肠杆菌T4噬菌体16fx基因工程11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）2、DNA连接酶连接酶（1）连接部位：（2）结果：形成(两个核苷酸)脱氧核糖和磷酸之间磷酸二酯键（3）结果：DNA连接酶和DNA聚合酶的比较17fx基因工程DNADNA聚合酶聚
7、合酶：单个核苷酸加到已有核酸片段的单个核苷酸加到已有核酸片段的33末端的羟基上。末端的羟基上。以一条以一条DNADNA链为模板通过磷酸二酯键形成互补链。链为模板通过磷酸二酯键形成互补链。DNADNA连接酶：连接酶：两个两个DNADNA片段之间形成磷酸二酯键。将片段之间形成磷酸二酯键。将DNADNA双链上双链上的两个缺口同时连接，不需要模板。的两个缺口同时连接，不需要模板。差别：相同：1、连接部位2、有无模板链1、磷酸二酯键2、蛋白质18fx基因工程11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）2、DNA连接酶连接酶（1）连接部位：（2）结果：形成(两个核苷酸)脱氧核糖和磷酸之间磷酸二酯键（
8、3）结果：DNA连接酶和DNA聚合酶的比较DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶连接酶区别区别 1、连接；2、需要。1、连接；2、不需要。相同相同 1、2、单个的核苷酸两条DNA片段DNA模板模板都形成磷酸二酯键都是蛋白质19fx基因工程11DNA重组技术的基本工具（基因工程的专用工具）3、运载体、运载体（1）作用：将导入；利用其复制可使目的基因在受体细胞内。（2）特点：（运载体必备的条件）能在宿主细胞内并；具有多个，便于外源基因连接；具有某些，便于进行筛选。安全分子大小适宜（3）常用：目的基因受体细胞大量复制自我复制稳定保存限制酶切割位点(切点)标记基因质粒、噬菌体、动植物病毒。20fx基因工程质粒
9、：存在于细菌及酵母菌（细胞质）中，独立于染色体而自主复制的环状双链DNA分子。最常用的运载体（尤其是大肠杆菌质粒）。裸露、结构简单、独立，自我复制、双链环状，DNA分子21fx基因工程12基因工程的基本操作程序（基因工程的操作步骤）必修必修IIII：选修：选修：1、提取目的基因2、与运载体结合3、导入受体细胞4、目的基因表达与检测1、获取目的基因2、构建表达载体3、导入受体细胞4、目的基因检测与鉴定22fx基因工程1 1、提取目的基因的方法：、提取目的基因的方法：直接分离基因直接分离基因鸟枪法鸟枪法用限制酶切断用限制酶切断成许多片段成许多片段缺点：盲目性大，工作量大，成功率低。缺点：盲目性大，
10、工作量大，成功率低。人工合成基因法人工合成基因法逆转录法：逆转录法：mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链DNADNA直接合成法：直接合成法：蛋白质蛋白质的氨基酸顺序的氨基酸顺序mRNAmRNA核苷核苷酸顺序酸顺序基因基因的脱氧核苷酸顺序的脱氧核苷酸顺序目的基因目的基因限制酶载入限制酶载入供体细胞供体细胞DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体导入导入DNADNA扩增表达分离扩增表达分离受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状目的基因目的基因目前较广泛使用的目的基因有：目前较广泛使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白
11、基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等植物抗病基因等23fx基因工程目的基因获取方法目的基因获取方法第一步：获取目的基因（编码蛋白质的结构基因）含有所需要的完整的遗传信息的含有所需要的完整的遗传信息的DNADNA片段。片段。1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增12基因工程的基本操作程序24fx基因工程基因文库基因文库(gene library or gene bank)(gene library or gene bank)：从特定从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形生物个体中分离的全部基因，这些基因以
12、克隆的形式存在。（人工构建）式存在。（人工构建）根据构建方法的不同，基因文库分为：根据构建方法的不同，基因文库分为：基因库基因库(gene pool)(gene pool)：特定生物体全基因组的集合。特定生物体全基因组的集合。（天然存在）（天然存在） 基因组文库（包含一种生物所有的基因）cDNA文库（只含部分基因)1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取25fx基因工程基因组文库基因组文库c cDNA文库文库26fx基因工程组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌克克隆
13、隆载载体体: :为为使使插插入入的的外外源源DNADNA序序列列被被扩扩增增而而特意设计的载体。特意设计的载体。表表达达载载体体: :为为使使插插入入的的外外源源DNADNA序序列列可可转转录录翻翻译译成成多多肽肽链链而而特特意意设设计计的载体。的载体。(1)从基因组文库获取目的基因从基因组文库获取目的基因27fx基因工程mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制(2)从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合
14、酶碱水解碱水解 T T T T28fx基因工程2、利用PCR技术扩增(聚合酶链式反应聚合酶链式反应)变性变性复性复性( (退火退火) )延伸延伸氢键打开，形成氢键打开，形成模板链模板链引物与引物与DNADNA互补配对互补配对DNADNA聚合酶作用聚合酶作用使引物延伸使引物延伸29fx基因工程1234脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引引物物：人人工工合合成成的的, ,与与模模板板DNADNA上上所所要要扩扩增增的的DNADNA片片段段的的两两侧侧序序列列互互补补，长长度度为为20-2520-25碱碱基基的的寡寡核核苷苷酸单链。酸单链。30fx基因工程1、PCR技术的原理缓冲溶液DNA
15、复制原理DNA热变性原理2、条件模板双链DNA分子(目的基因)原料游离的4种脱氧核苷酸酶Taq DNA聚合酶2种引物（RNA）人工合成，与要扩增的DNA片段两侧序列互补，引导DNA子链形成。高温供能变性解旋31fx基因工程（1）变性（2）复性（3）延伸3、过程90，第一次10min，最后一次1min50，30sec在DNA聚合酶作用下配对延伸子链(目的基因)DNA受热变性解旋引物分别与两条DNA单链互补配对72，1min4、特点： 1、体外复制； 2、大量获取目的基因（指数式增长）； 3、原理和操作简单。32fx基因工程3、化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列根据蛋白质的
16、根据蛋白质的氨基酸氨基酸顺顺序推算出序推算出mRNAmRNA核苷酸顺序，核苷酸顺序，再据此推算出再据此推算出基因基因DNADNA的脱氧的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸苷酸直接合成直接合成相应的基因。相应的基因。DNADNA合成仪合成仪33fx基因工程 非编码区非编码区 非编码区非编码区 编码区编码区编码区下游编码区下游编码区上游编码区上游 RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点 调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达基因的结构（原核细胞）非编码区：不能转录为信使不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质，不能编码蛋白质 。编码区：能够转录为相应的信使能够转录为相应的信使RNA，进
17、而指导，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质 。34fx基因工程编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNA聚酶聚酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区上游编码区上游 内含子内含子: :不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使内含子能转录为信使RNA 。 外显子外显子: :能够编码蛋白质的序列能够编码蛋白质的序列。 基因的结构（真核细胞）35fx基因工程真核细胞和原核细胞的基因结构比较真核细胞和原核细胞的基因结构比较1 1）相同点：）相
18、同点：2 2）不同点）不同点：原核的编码区是连续的，而真核的是间隔不连续的。都是由编码区（编码蛋白质）和非编码区（调控作用）组成。36fx基因工程2 2、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合构建表达载体构建表达载体DNA质粒质粒重组质粒（表达载体）（表达载体）目的基因(2个切口/4个黏性末端)DNA连接酶连接酶运载体(1个切口/2个黏性末端)同种限制酶处理37fx基因工程第二步：基因表达载体的构建（使目的基因能稳定遗传、表达发挥作用）启动子启动子：一段特殊结构的：一段特殊结构的DNADNA片段，片段，位于基因首端，是位于基因首端，是RNARNA聚合酶识别和聚合酶识别和结合的部位。结合的部
19、位。终止子终止子：使转录停止。：使转录停止。标记基因标记基因：鉴定受体细胞是否含有：鉴定受体细胞是否含有目的基因，进行细胞筛选。目的基因，进行细胞筛选。是指已知功能或已知座位的基因。是指已知功能或已知座位的基因。在基因工程中使用与选择重组体在基因工程中使用与选择重组体DNA转化细胞的基因；转化细胞的基因；在基因定位中是指定位在染色体或其它载体上的基因以在基因定位中是指定位在染色体或其它载体上的基因以作为其它基因定位的标记。作为其它基因定位的标记。 12基因工程的基本操作程序38fx基因工程体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效
20、果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基标记基因因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记标记基因基因（新霉素抗性基因），3只带有
21、标记基因标记基因，目的外源基因整合率高达50。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 39fx基因工程目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连40fx基因工程3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞借鉴了细菌或病毒侵染细胞的方法。受体细胞受体细胞（如，细菌）（如，细菌）氯化钙氯化钙细胞壁通透性增大细胞壁通透性增大重组质粒
22、进入受体细胞重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞繁殖而复制目的基因随受体细胞繁殖而复制41fx基因工程第三步：导入受体细胞导入方式：导入方式：转化转化 (transformation) 转染转染 (transfection) 感染感染 (infection)转化：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。细胞内维持稳定和表达的过程。（将质粒或其他外源 DNA 导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。）感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组 DNA 分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，感染适当
23、的细胞并在细胞内扩增。转染：真核细胞主动摄取或被动导入外源 DNA 片段而获得新的表型的过程。12基因工程的基本操作程序42fx基因工程转化的方法：转化的方法：导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件1 1、限制性缺陷型、限制性缺陷型（外切酶和内切酶活性缺陷（外切酶和内切酶活性缺陷（recB-recB-，recC-recC-，hsdR-hsdR-） 2 2、重组整合缺陷型、重组整合缺陷型（用于基因扩增或高效表达的受体细胞（用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-recA-）3 3、具有较高的转化效率、具有较高的转化
24、效率4 4、具有与载体选择标记互补的表型、具有与载体选择标记互补的表型5 5、感染寄生缺陷型、感染寄生缺陷型（防止重组细菌扩散污染，生物武器除外（防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 ）43fx基因工程1 1）导入植物细胞）导入植物细胞）导入植物细胞）导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法特点：特点：易感染易感染双子叶双子叶植物和植物和裸子裸子植物植物, ,可把可把TiTi质粒质粒上的上的T-DNAT-DNA转移到受体细胞，并转移到受体细胞，并整合整合到受体细胞染到受体细胞染色体的色体的DNADNA上上. .44fx基因工程45fx基因工程2) 2) 导入动物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入动物细
25、胞显微注射技术显微注射技术用口径为用口径为1 m1 m的的DNADNA注射器，将大量的目注射器，将大量的目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一雌性动物的经过注射的受精卵移植到另一雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。子宫内，使受精卵发育为转基因动物。目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯取卵取卵( (受精卵受精卵) )显微注射显微注射( (利用显微注射仪利用显微注射仪) )注射目的基因受精卵移植注射目的基因受精卵移植新性状动物新性状动物46fx基因工程原核生物的特点原核生物的特点:繁殖快、单细胞、遗传物质繁殖快、单细胞、遗传
26、物质少少2) 2) 导入微生物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞大肠杆菌转化过程大肠杆菌转化过程将细菌用将细菌用CaClCaCl2 2处理，处理，以增大细菌细胞壁的通透以增大细菌细胞壁的通透性。性。使含有目的基因的重组使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。质粒进入受体细胞。目的基因在受体细胞内，目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大很短的时间内就能获得大量的目的基因。量的目的基因。Ca 2+Ca 2+处理细胞处理细胞（感受态细胞）（感受态细胞） 表达载体与感受态细表达载体与感受态细胞混合胞
27、混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子完成转化完成转化47fx基因工程常用的受体细胞：常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。48fx基因工程4 4、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物(1)(1)细菌的检测：将每个细菌的检测：将每个受体细胞单独培养形成菌落，受体细胞单独培养形成菌落，检测检测菌落中是否有菌落中是否有目的基因的表达产物目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达
28、产物的进一淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。步培养、研究。49fx基因工程50fx基因工程4 4、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达(2)(2)多细胞生物的检测：将每个多细胞生物的检测：将每个受体细胞单独培养并受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基这些个体是否摄入目的基因，因，摄入的基因是否表达出相应的性状摄入的基因是否表达出相应的性状。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。步培养、研究。例：例：用棉铃饲喂棉铃虫用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后如虫吃后不出现中毒
29、不出现中毒症状，症状，说明说明未摄入未摄入目的基因或摄目的基因或摄入目的基因入目的基因未表达未表达；如虫；如虫吃后吃后中毒死亡中毒死亡，则说明，则说明摄摄入入了抗虫了抗虫基因并基因并得到得到表达表达。51fx基因工程4 4、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达检测目的检测目的检测依据检测依据结果确认结果确认(标志标志)目的基因目的基因的的检测检测目的基因目的基因是否已是否已被被导入导入受体受体细胞。细胞。受体细胞是否表受体细胞是否表现出现出运载体特有运载体特有的的“标记基因标记基因”所所控制的性状控制的性状。如表现即可确认如表现即可确认目的基因已被导目的基因已被导入受体细胞。入受体细胞。
30、目的基因目的基因的的表达表达目的基因目的基因是否已完是否已完成成表达表达过过程。程。受体细胞是否表受体细胞是否表现出现出“目的基因目的基因”所所控制的性状控制的性状。如表现则说明已如表现则说明已合成相应的蛋白合成相应的蛋白质，即可确认目质，即可确认目的基因已正常表的基因已正常表达。达。检测：根据受体细胞是否具有标记基因。表达：受体细胞表现出特定的性状。52fx基因工程第四步：目的基因的检测与鉴定DNADNA分子杂交技术分子杂交技术12基因工程的基本操作程序53fx基因工程探针 (probe)：一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在膜上的核苷酸结合，判断
31、是否有同源的核酸分子存在。 标记物同位素标记：32P非放射性标记：荧光标记，生物素，dig(地高辛）等54fx基因工程1 1、检测转基因生物的染色体、检测转基因生物的染色体DNADNA上的上的目的基因目的基因2 2、检测目的基因是否转录、检测目的基因是否转录mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译、检测目的基因是否翻译蛋白质蛋白质检测检测鉴定鉴定个体生物学水平鉴定个体生物学水平鉴定（如抗虫、抗病鉴定，基（如抗虫、抗病鉴定，基因工程产品与天然产品功因工程产品与天然产品功能进行活性比较等）能进行活性比较等）55fx基因工程基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切接接转转增增检检56fx基因工程
32、重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切割目的基因与载体限制酶切割目的基因与载体接接连接重组体连接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 57fx基因工程 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程58fx基因工程克隆克隆(clone)通过无性繁殖获得来自同一始祖的相同副本通过无性繁殖获得来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。而获取此同一拷贝的过程称或拷贝的集合。而获取此同一拷贝的过程称为为克隆化克隆化(cloning)。DNA克隆克隆技术水平：技术水平：分子克隆分子
33、克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）59fx基因工程DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得
34、大大量量同同一一DNA分分子子 ， 也也 称称 基基 因因 克克 隆隆 或或 重重 组组 DNA (recombinant DNA) 。 60fx基因工程Transform+report gene substrates61fx基因工程基因工程成果及发展前景基因工程成果及发展前景1 1、医药卫生、医药卫生2 2、农、牧业及食品工业、农、牧业及食品工业3 3、环境保护、环境保护基因工程药品的生产基因诊断基因治疗培育转基因作物培育转基因动物开发新食品来源环境监测环境净化62fx基因工程 基因工程药品的生产许多药品的生产是从生物组许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量织中提取的。受材料
35、来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。还能大大降低生产成本。1、医药卫生胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，取，100Kg胰腺只能提取胰腺只能提取4-5g的胰岛素，的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。其产量之低和价格之高可想而知。将合成的将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每，每2000L培养液
36、就能产生培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了胰岛素！使其价格降低了30%-50%!我国生产的部分基因我国生产的部分基因工程疫苗和药物工程疫苗和药物人工合成胰岛素人工合成胰岛素63fx基因工程从人血中提取干扰素，从人血中提取干扰素，300L血才提取血才提取1mg！通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每，每1Kg的培养液可的培养液可提取提取204mg干扰素。干扰素。人工合成干扰素人工合成干扰素人造血液及其生产人造血液及其生产64fx基因工程 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗
37、粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因巨噬细胞集落剌激因子子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,
38、酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌亚单位菌体霍乱菌苗苗预防霍乱预防霍乱65fx基因工程 基因诊断与基因治疗运用基因工程设计制造的运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。通过基因工程给患通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可可“一次性一次性”解除病人的疾苦。解除病人的疾苦。1、医药卫生66fx基因工程生物芯片从正常人的基因组中分离出从正常人的基因组中分离出DNADNA与与DNADNA芯片杂交就可以得出芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出标准图谱。从病人的基因组中
39、分离出DNADNA与与DNADNA芯片杂交就可以芯片杂交就可以得出病变图谱。得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNADNA信息。信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。等特点，将成为一项现代化诊断新技术。 67fx基因工程基因芯片扫描仪基因芯片扫描仪芯片数据处理芯片数据处理68fx基因工程转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因转鱼抗寒基因的番茄的番茄转黄瓜抗青枯病基因的马铃转黄瓜抗青枯病基因的
40、马铃薯薯不会引起过敏的转基因大豆不会引起过敏的转基因大豆2、农、牧业及食品工业69fx基因工程生长快、耐不良环境、肉生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼质好的转基因鱼( (中国中国) )乳汁中含有人生长激素的乳汁中含有人生长激素的转基因牛转基因牛( (阿根廷阿根廷) )乳铁蛋白转基因山羊乳铁蛋白转基因山羊 携带人血清白蛋白基因携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛的转基因试管牛70fx基因工程3、环境保护1t1t水中只有水中只有1010个病毒也能被个病毒也能被DNA探针检测出来检测出来培育“指示生物”用基因工程用基因工程培育“超级细菌”分解石油中的多种烃类化分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食
41、转化汞、镉等重金属，分解合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDTDDT等毒害等毒害物质。物质。71fx基因工程基因工程成果及发展前景基因工程成果及发展前景1 1、医药卫生、医药卫生2 2、农、牧业及食品工业、农、牧业及食品工业3 3、环境保护、环境保护基因工程药品的生产基因诊断基因治疗：胰岛素、干扰素、疫苗：用基因探针检测肝类病毒，诊断遗传病 ：把健康外源基因导入有基因缺陷的细胞中培育转基因作物培育转基因动物开发新食品来源环境监测环境净化：具优良品质农作物，具抗逆性新品种。如高产稳产、抗虫棉、耐贮存番茄，抗除草剂玉米。：人们所需具优良品质的动物，乳房发生器。如转基因奶牛、超级绵羊。：生
42、产转基因超级细菌（分解四种烃类的“超级菌”，吞噬汞和降解土壤中DDT的细菌）。 单细胞蛋白：利用DNA探针检测水中细菌或病毒的含量。72fx基因工程转基因生物和转基因食品的安全性转基因生物和转基因食品的安全性转基因生物的优缺点：优点可实现人类对基因的定向转移，有利研究生物制药等。缺点可能带来生态灾难或战争狂人的“基因武器”。73fx基因工程转基因生物和转基因食品的安全性转基因生物和转基因食品的安全性对转基因食品对转基因食品无害性的评估无害性的评估主要有以下几方面：主要有以下几方面：是否有毒性、引起过敏反应、营养或毒性蛋白质的特性、注入基因的稳定性、基因改变引起的营养效果及其他不必要的功能等。对人类健康而言，我们主要应审查转基因食品有无毒性及对环境的影响。 欧盟对转基因食品的生产和销售制定了一系欧盟对转基因食品的生产和销售制定了一系列法规，要求基因改变不得超过基因总量的列法规，要求基因改变不得超过基因总量的1 1，市场上出售的转基因食品必须贴标签。市场上出售的转基因食品必须贴标签。转基因食品的安全性要求：74fx基因工程75fx基因工程
