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1、实验八实验八 土壤微生物的分离与计数土壤微生物的分离与计数 涂布平板法涂布平板法 一、实验目的一、实验目的 1、学习利用平板分离法从土壤分离微生物的基、学习利用平板分离法从土壤分离微生物的基 本操作。本操作。2、掌握微生物平板计数的方法。、掌握微生物平板计数的方法。二、实验原理二、实验原理 n n土壤是微生物生活的大本营土壤是微生物生活的大本营土壤是微生物生活的大本营土壤是微生物生活的大本营 根据某微生物的生长条件（营养，酸碱度，温度，氧根据某微生物的生长条件（营养，酸碱度，温度，氧根据某微生物的生长条件（营养，酸碱度，温度，氧根据某微生物的生长条件（营养，酸碱度，温度，氧气等）而供给它适宜的
2、培养条件，或加入某种抑制剂造成气等）而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成气等）而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成气等）而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌生长，而抑制其他菌生长；用稀释涂布平板法只利于该菌生长，而抑制其他菌生长；用稀释涂布平板法只利于该菌生长，而抑制其他菌生长；用稀释涂布平板法只利于该菌生长，而抑制其他菌生长；用稀释涂布平板法获得单菌落（并不能绝对保证是纯培养，需要结合观察其获得单菌落（并不能绝对保证是纯培养，需要结合观察其获得单菌落（并不能绝对保证是纯培养，需要结合观察其获得单菌落（并不能绝对保证是纯培养，需要结合观察其菌落特征、个体特征，
3、进一步分离纯化）。菌落特征、个体特征，进一步分离纯化）。菌落特征、个体特征，进一步分离纯化）。菌落特征、个体特征，进一步分离纯化）。稀释到适量浓度稀释到适量浓度 倾注或涂布平板倾注或涂布平板 培养培养 菌落计数菌落计数 将待测样品适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细将待测样品适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到培养基上，经过繁殖每个单细菌胞，取一定量的稀释液接种到培养基上，经过繁殖每个单细菌长成肉眼可见的菌落，即一个菌落代表样品中的一个单细胞。长成肉眼可见的菌落，即一个菌落代表样品中的一个单细胞。 根据菌落数，稀释倍数，接种量可推算出原样品中的含菌数。根据菌落
4、数，稀释倍数，接种量可推算出原样品中的含菌数。样品充分混匀；样品充分混匀；同一稀释度三个以上重复，同一稀释度三个以上重复，取平均值；取平均值；每个平板上的菌落数目合适，每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数。便于准确计数。一般用菌落形成单位（一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示）来表示原样品中的细胞数。原样品中的细胞数。三、实验材料三、实验材料1 1、土样：选择某一生境土壤，去表层土，挖、土样：选择某一生境土壤，去表层土，挖、土样：选择某一生境土壤，去表层土，挖、土样：选择某一生境土壤，去表层土，挖520cm520cm深度深度深度深度 的土壤数的土壤数
5、的土壤数的土壤数10g10g，装入已灭菌的牛皮纸袋。，装入已灭菌的牛皮纸袋。，装入已灭菌的牛皮纸袋。，装入已灭菌的牛皮纸袋。2 2、培养基、培养基、培养基、培养基: :n n牛肉膏蛋白胨培养基：细菌牛肉膏蛋白胨培养基：细菌牛肉膏蛋白胨培养基：细菌牛肉膏蛋白胨培养基：细菌n n淀粉琼脂培养基（高氏淀粉琼脂培养基（高氏淀粉琼脂培养基（高氏淀粉琼脂培养基（高氏1 1号）：放线菌号）：放线菌号）：放线菌号）：放线菌每每每每300ml300ml培培培培养基加入养基加入养基加入养基加入1ml3%1ml3%的重铬酸钾抑制细菌和霉菌生长的重铬酸钾抑制细菌和霉菌生长的重铬酸钾抑制细菌和霉菌生长的重铬酸钾抑制细菌
6、和霉菌生长n n马丁氏培养基：真菌马丁氏培养基：真菌马丁氏培养基：真菌马丁氏培养基：真菌孟加拉红抑制细菌和放线菌孟加拉红抑制细菌和放线菌孟加拉红抑制细菌和放线菌孟加拉红抑制细菌和放线菌1、倒平板、倒平板2、土壤菌悬液的制备、土壤菌悬液的制备 四、实验方法四、实验方法 10g土样土样 + 90ml无菌水无菌水 振荡振荡20min3、梯度稀释、梯度稀释 取取1ml土壤菌悬液土壤菌悬液移入含移入含9ml无菌水的试管中，吹吸均匀，无菌水的试管中，吹吸均匀，为稀释为稀释10倍的样品，依次进行梯度稀释倍的样品，依次进行梯度稀释10-110-6分离对象分离对象分离对象分离对象 稀释度稀释度稀释度稀释度 分离
7、方法分离方法分离方法分离方法 细菌细菌细菌细菌 1010-4-4 、1010-5-5、 10 10-6-6 0.1ml0.1ml菌悬液，涂布法分菌悬液，涂布法分菌悬液，涂布法分菌悬液，涂布法分离离离离 放线菌放线菌放线菌放线菌 1010-3 -3 、1010-4-4、 10 10-5-50.1ml0.1ml菌悬液，涂布法分菌悬液，涂布法分菌悬液，涂布法分菌悬液，涂布法分离离离离 霉菌霉菌霉菌霉菌 1010-2-2、 10 10-3-3、 10 10-4-4 0.1ml0.1ml菌悬液，涂布法分菌悬液，涂布法分菌悬液，涂布法分菌悬液，涂布法分离离离离 4、涂布：取、涂布：取适当浓度的稀释液涂布于
8、相应平板，每个适当浓度的稀释液涂布于相应平板，每个 稀释度做稀释度做3个平行，个平行，每种菌需要做每种菌需要做每种菌需要做每种菌需要做9 9块平板，及时块平板，及时块平板，及时块平板，及时 标记，涂布后标记，涂布后标记，涂布后标记，涂布后静置静置10分钟。分钟。5、培养、培养 将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于30培养箱中培养箱中培养培养3-5d。6、计数、计数7、挑菌（纯化）挑菌（纯化） 将培养后长出的单菌落数量、形态、培养特征进行将培养后长出的单菌落数量、形态、培养特征进行观察，分别挑取单菌落于相应平板上划线、分离，观察，分别挑取单菌落于相应平板上划线、分离，
9、 培养，培养，检查菌落是否一致、单纯（也可以用显微镜涂片染色镜检查菌落是否一致、单纯（也可以用显微镜涂片染色镜检是否是单一的微生物），如有杂菌需进一步纯化、分检是否是单一的微生物），如有杂菌需进一步纯化、分离。离。每毫升菌落形成单位同一稀释度的三次重复平均数每毫升菌落形成单位同一稀释度的三次重复平均数稀释倍数稀释倍数 5平板平板计数数五、思考题五、思考题1 1、记录利用稀释涂布法对土壤样品进行活菌计数的结果。、记录利用稀释涂布法对土壤样品进行活菌计数的结果。、记录利用稀释涂布法对土壤样品进行活菌计数的结果。、记录利用稀释涂布法对土壤样品进行活菌计数的结果。平板平板中的中的CFUCFU数数重复重
10、复1 12 23 3平平均均1 12 23 3平平均均1 12 23 3平平均均稀释度稀释度细菌细菌10-410-410-510-510-610-6稀释度稀释度放线菌放线菌10-210-210-310-310-410-4稀释度稀释度真菌真菌10-210-210-310-310-410-4 每克含菌样品中细菌每克含菌样品中细菌每克含菌样品中细菌每克含菌样品中细菌/ /放线菌放线菌放线菌放线菌/ /真菌真菌真菌真菌 活细胞数活细胞数活细胞数活细胞数 （同一稀释度平板上菌落平均数（同一稀释度平板上菌落平均数（同一稀释度平板上菌落平均数（同一稀释度平板上菌落平均数 10 10稀释倍数）稀释倍数）稀释倍数）稀释倍数） 含菌样品克数含菌样品克数含菌样品克数含菌样品克数
