ELISA从基础知识到实操

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1、ELISAELISA从基从基础知知识到到实操操抗体抗体生物体最奇妙的分子生物体最奇妙的分子无限的多样性（无限的多样性（diversity)功能与结构的双重性功能与结构的双重性 可变区可变区抗原结合抗原结合 恒定区恒定区生物学效应功能生物学效应功能分泌型和膜型表达分泌型和膜型表达 免疫球蛋白的分子结构及分类免疫球蛋白的分子结构及分类 免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能 免疫球蛋白基因结构及多样性产生的机制免疫球蛋白基因结构及多样性产生的机制免疫球蛋白基因结构及多样性产生的机制免疫球蛋白基因结构及多样性产生的机制 免疫球蛋白的来源免疫球蛋白的来源免疫球蛋白的来源免疫球蛋白的来源 抗体分子的应用抗体分

2、子的应用抗体分子的应用抗体分子的应用免疫球蛋白的分子结构及分类免疫球蛋白的分子结构及分类免疫球蛋白的分子结构及分类免疫球蛋白的分子结构及分类一、免疫球蛋白的基本结构一、免疫球蛋白的基本结构CLCLCH1CH1VLVLVHVHCH2CH2CH3CH3C端N端恒定区可变区FC 段Fab段铰链区1 1、重链和轻链、重链和轻链、重链和轻链、重链和轻链 重链可分为重链可分为 、 、 、 、 链；轻链可链；轻链可分为分为 、 型。型。2 2、可变区、可变区、可变区、可变区 （1 1）重链和轻链重链和轻链NN端约端约110110个氨基酸为个氨基酸为可变区（可变区（variable region,Vvaria

3、ble region,V区区) )，VV区存在区存在3 3个高变区（个高变区（hypervariable hypervariable region,HVR13)region,HVR13)及及4 4个骨架区个骨架区（framework region, FR14).framework region, FR14).三个高变区三个高变区共同组成共同组成Ig Ig 的抗原识别部位，形成与抗的抗原识别部位，形成与抗原决定基互补的表位。高变区也称互补原决定基互补的表位。高变区也称互补决定区（决定区（complementarity-determining complementarity-determining

4、 region, CD13)region, CD13)。 3、恒定区、恒定区 重链和轻链重链和轻链C端为恒定区，不同端为恒定区，不同Ig重链其不同重链其不同长度，有的只有长度，有的只有CH13,有的则由有的则由CH14，CH2（IgG)或或CH3（IgM)有补体结合位点。有补体结合位点。相同种属、同一类别的相同种属、同一类别的Ig 氨基酸序列基本恒定。氨基酸序列基本恒定。4、铰链区、铰链区 铰链区位于铰链区位于CH1和和CH2之间，含有丰富的脯之间，含有丰富的脯氨酸。氨酸。 IgG1,IgG2,IgG4和和IgA的铰链区较短，而的铰链区较短，而IgG3和和IgD的的 铰链区较长；铰链区较长；I

5、gM和和IgE无铰链区。无铰链区。 有木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的酶切位点。有木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的酶切位点。木瓜蛋白酶胃蛋白酶FabFabFcF(ab)pFc木瓜蛋白酶胃蛋白酶二、免疫球蛋白水解片段二、免疫球蛋白水解片段免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能一、一、V区功能区功能 识别并特异性结合抗原，这种特异性是识别并特异性结合抗原，这种特异性是由由IgV区，特别是区，特别是HVR（ CDR3）的空间构的空间构象决定的。象决定的。 抗原结合价：单体为两价；双体为四价；抗原结合价：单体为两价；双体为四价；五聚体理论上为十价，但实际为五价。五聚体理论上为十价，但实际为五价。免疫效应免疫效应（1）可溶性）可

6、溶性Ig可通过可通过V区与抗原性物质发区与抗原性物质发生特异性结合，发挥中和或生特异性结合，发挥中和或催化作用。催化作用。（2）做为信号抗体。）做为信号抗体。二、二、C区功能区功能1、激活补体、激活补体 主要是主要是IgM、IgG13与抗原结合后通过经与抗原结合后通过经典途径激活补体活化。典途径激活补体活化。 聚合的聚合的IgA可通过旁路途径激活补体。可通过旁路途径激活补体。 IgD 、IgE及及IgG4不能激活补体不能激活补体2、结合细胞表面的、结合细胞表面的Fc受体受体 （1）调理作用）调理作用 是指抗体及补体促进吞噬细胞吞噬细菌等颗是指抗体及补体促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用。粒

7、性抗原的作用。IgG型抗体可通过型抗体可通过Fc段与中段与中性粒细胞及巨噬细胞上的性粒细胞及巨噬细胞上的Fc受体结合，增强其受体结合，增强其吞噬作用。吞噬作用。 （2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC).是指表达是指表达Fc受体的细胞，受体的细胞，通过识别抗体的通过识别抗体的Fc直接杀伤被抗体包被的靶细直接杀伤被抗体包被的靶细胞。如胞。如NK细胞，巨噬细胞等。细胞，巨噬细胞等。（3）介导）介导型超敏反应型超敏反应3、通过胎盘 IgG是唯一通过胎盘的抗体，是一种重

8、要的自然被动免疫机制。三、膜型三、膜型Ig为为B细胞抗原识别受体细胞抗原识别受体维持维持B细胞的生存与增殖细胞的生存与增殖维持维持B细胞的记忆细胞的记忆 抗体的抗原性抗体的抗原性vIg具有双重性： 做为抗体能结合抗原 做为大分子蛋白质能被其它抗体结合Ag1Ab1（Ag2）Ab215vIg的抗原性可分为3种：1. 1. 同种型抗原（同种型抗原（IsotypeIsotype） 同一种属每个个体都具有的免疫球蛋白的抗原特异性，其抗原决定簇主要存在于Ig的C区。 16 （1 1 1 1）类和亚类（根据重链）类和亚类（根据重链）类和亚类（根据重链）类和亚类（根据重链C C C C区抗原性的不同）区抗原性

9、的不同）区抗原性的不同）区抗原性的不同） IgG IgG (gamma)(gamma) IgA IgA (alpha)(alpha) IgM IgM (mu)(mu) IgD IgD (delta)(delta) IgE IgE (epsilon) (epsilon) 类类亚类亚类亚类亚类IgGIgG：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgAIgA：IgA1, IgAIgA1, IgA17（2 2 2 2）型和亚型）型和亚型）型和亚型）型和亚型( ( ( (根据轻链根据轻链根据轻链根据轻链C C区抗原的差异区抗原的差异区抗原的差异区抗原

10、的差异) ) ) ) 亚型亚型亚型亚型( ( ( (链链链链) ) ) )(kappakappa) ) ) )型型型型(lambdalambda) ) ) )型型型型 型型型型1 1 1 1：第：第：第：第190190190190位位位位( ( ( (亮氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸) ) ) )2 2 2 2：第：第：第：第190190190190位位位位( ( ( (精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸) ) ) )3 3 3 3：第第第第154154154154位位位位( ( ( (甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸) ) ) )4 4 4 4：第第第第154154154154位位位位( ( ( (丝氨酸丝氨酸丝氨酸

11、丝氨酸) ) ) )182 2、同种异型抗原（、同种异型抗原（AllotypeAllotype） 同一种属不同个体所具有的Ig在抗原性上的差异，主要存在于重链和轻链的稳定区特定部位的某个或数个氨基酸的不同中。 193 3）独特型抗原（）独特型抗原（IdiotypeIdiotype） 同一个体不同Ig的抗原性各不相同，主要存在于Ig 的V区。 20同一物种同一物种Ig共有共有的抗原性，存在的抗原性，存在于于C区。区。同一物种不同个体同一物种不同个体Ig抗原性差异，差抗原性差异，差异在于异在于C区某些区某些AA不同。不同。同一个体内各同一个体内各Ig抗原性差异，存抗原性差异，存在于在于V区。区。同

12、一个体内各同一个体内各Ig抗原性差异，存抗原性差异，存在于在于V区。区。（个体型标志）（个体型标志）（种属型标志）（种属型标志）（细胞型标志）（细胞型标志）212 2ELISAELISA的类型的类型 ELISA ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：测定方法中有三个必要的试剂：（1 1）固相的抗原或抗体，即）固相的抗原或抗体，即 免疫吸附剂免疫吸附剂 （immunosorbentimmunosorbent）；（2 2）酶标记的抗原或抗体，称为）酶标记的抗原或抗体，称为 结合物结合物 （conjugateconjug

13、ate）；（3 3）酶反应的底物。）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。 2.2.12.2.1双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于就可用于包被固相载体包被固相载体和制备和制备酶结合物酶结合物而建立此法。而建立此法。2.2.2 2.2.2 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中用特异性抗原进行包

14、被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAgHBsAg的检测常采用的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。构的不同，寻找合适的标记方法。2.2.3 2.2.3 间接法测抗体间接法测抗体 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用利用同一酶标抗抗体同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。建立检测相应抗体的方法

15、。2.2.4 2.2.4 竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。 2.2.5 2.2.5 竞争法测抗原竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，抗原竞争与

16、固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等小分子激素、药物等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。2.2.6 2.2.6 捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体IgMIgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgMIgM抗体包被抗体包被固相，以捕获血清标本中的固相，以捕获血清标本中的IgMIgM（其中包括针对抗原的（其中包括针对抗原的特异性特异性IgMIgM抗体和非特异性的抗体和非特异性的IgMIgM）。）。此法常用于病毒此法常用于病毒性感染的早期诊断。性感染

17、的早期诊断。2.2.7 ABS-ELISA2.2.7 ABS-ELISA法法 ：固相支持物；：固相支持物；：样品；：样品；：特异性：特异性IgGIgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG （BiotinBiotin）；）；：辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素（酶标链亲和素（AvidinAvidin）；）；：DABDAB显色液；显色液；：显色；：显色；3. ELISA3. ELISA的试剂的试剂(A(A、B B、C C三部分三部分) )ELISAELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。酶的底物。（1

18、1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；（5 5）洗涤液；）洗涤液；（6 6）酶反应终止液）酶反应终止液ELISAELISA的试剂准备的试剂准备A A 固相载体固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯

19、聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。高，但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板应该是板应该是吸附性能好吸附性能好，空白值低空白值低，孔底孔底透明度高透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间间性能相近性能相近。包被的方式包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。 蛋白质蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固

20、相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团疏水基团，故更易吸附，故更易吸附到固相载体表面。到固相载体表面。不易吸附不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。此含杂质较多的抗原也可采用捕获

21、包被法。亲和素生物素亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的即用亲和素先包被载体，加入生物素化的抗原，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原抗原，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。物质的定量测定。脂类物质脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复优点：试验

22、的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载

23、体表面。偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。包被用抗体包被用抗体IgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在FcFc段上，抗体段上，抗体结合点暴露于外。结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液. .须除去杂抗体后须除去杂抗体后才能用于才能用于ELISAELISA，以保证试验的特异性。，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被

24、，可取得更好的效果。混合包被，可取得更好的效果。包被的条件包被的条件pH9.6pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液。缓冲液。 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置过夜，冰箱中放置过夜，3737中保中保温温2 2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml1

25、0ng/ml-20ug/ml。封闭封闭封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥充填这些空隙，从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质后的步骤中干扰物质的再吸附。的再吸附。常用封闭剂：常用封闭剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶; ;脱脂奶粉脱脂奶粉, ,比较价廉，可以高浓度使用（比较价廉，可以高浓度使用（5%5%）。）。

26、洗涤液洗涤液在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀释液为含中，常用的稀释液为含0.05%0.05%吐温吐温2020磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液。ELISA的试剂准备的试剂准备B 结合物结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是即酶标记的抗体（或抗原）是ELISAELISA中关键的试中关键的试剂剂 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2抗体（或抗原）的免疫活性抗体（或抗原）的免疫活性 3 3含有或少含有游离的抗体（或抗原）含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4 4结合物尚要有良好的稳定性。结合物尚要有良好的稳定性。结合物用的抗原和抗体结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的制备结合物时所用纯

27、度较高的IgGIgG，以免在与酶联结，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISAELISA中用酶标抗中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。酶酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。来源丰富，价格不贵，受检标

28、本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。存，价格低廉，有色产物易于测定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷半乳糖苷酶和脲酶等。酶和脲酶等。HRPHRP是一种糖蛋白，含糖量约为是一种糖蛋白，含糖量约为18%18%，分子量为，分子量为4400044000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。结合而成，是一种卟啉蛋白质。3.2.3

29、3.2.3 结合物的制备结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。碘酸盐氧化法。（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-60%-70%70%）和重复性好。）和重复性好。 交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。（2 2）过碘酸氧化法：

30、适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRPHRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成氨基形成chiffchiff氏碱而结合。简便有效氏碱而结合。简便有效. . 结合物中混有的游离酶一般不影响结合物中混有的游离酶一般不影响ELISAELISA中最后的酶活中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。抗体后用于检测

31、，效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。结合物的保存结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例

32、如庆大霉素）和防腐剂（再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRPHRP结合结合物加硫柳泵，物加硫柳泵，APAP结合物可加叠氮钠）。结合物可加叠氮钠）。结合物的稀释液结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%0.1%牛血清白蛋牛血清白蛋白，白， 0.05%0.05%吐温吐温20 20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在工作液，使用时不需再行稀释，在4-84-8保存期可达保存期可达6 6个月。个月。试剂准

33、备试剂准备 C 酶的底物酶的底物酶的底物酶的底物HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结结合物最常用的底物。合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2为供氧体，为供氧体， H2O2为受氢体。为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺四甲基联苯胺(

34、TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。ETMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显蓝色。作用后共产物显蓝色。TMBTMB性质较稳定，可配成性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与溶液试剂，只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成应用液。酶反应终止溶液混和即成应用液。酶反应终止后，后，TMBTMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为收波长为450nm450nm。ABTSABTS虽不如虽不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值极低，也为一些试敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。剂盒所采用。HRPHRP对氢受体的专一性很高，仅作用

35、于对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2H2O2、小分醇的过、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 APAP的底物为磷酸酯酶，一般采用对的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm405nm波长波长处有吸收峰。用处有吸收峰。用NaOHNaOH终止酶反应后，黄色可稳定终止酶反应后，黄色可稳定一时间。一时间。APAP也有发荧光底物（磷酸也有发荧光底物（磷酸4-4-甲基伞酮），甲基伞酮），可用于可用于ELISAELISA作荧光测定，敏感度较

36、高于用显色底作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。物的比色法。酶反应终止液酶反应终止液常用的常用的HRPHRP反应终止液为硫酸，其浓反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板度按加量及比色液的最终体积而异，在板式式ELISAELISA中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。加样加样: : 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，即加标本，加酶次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔的板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产底部，避免加在孔壁上部，并注意不可

37、溅出，不可产生气泡。生气泡。基本操作注意事项基本操作注意事项保温保温抗原抗体完成反应的保温过程称为温育抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)(incubation)。ELISAELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么上发生。为什么ELISAELISA反应总是需要一定时间的温育？反应总是需要一定时间的温育？温育常采用的温度有温育常采用的温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度）（冰箱温度）等。等。3737是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合

38、的合适温度。抗体结合的合适温度。洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。实验的成败。ELSIAELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在可以说在EL

39、ISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式除某些洗涤的方式除某些ELISAELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有手工操作有流水冲洗式和流水冲洗式和浸泡式两种：浸泡式两种：（1 1）流水冲洗式）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。滴

40、定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗非离子型洗涤剂涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏疏水性水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。显色显色显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，应的温度和时间仍是

41、影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。强。适当提高温度有助于加速显色进行。TMBTMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。适当时间阅读结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，约作用后，约4040分钟显色达分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至顶峰，随即逐渐减弱，至2 2小时后即可完全消退至无色。小时后即可完全消退至无色。结束结束