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1、第八章第八章发酵工艺控制发酵工艺控制1.温度控制温度控制2.pH控制控制4.泡沫控制泡沫控制5.补料控制补料控制3.溶氧控制溶氧控制6.发酵终点的判断发酵终点的判断发酵过程的主要控制参数发酵过程的主要控制参数温度：不同的菌种，不同产品，发酵不同阶段所维持的温度：不同的菌种，不同产品，发酵不同阶段所维持的温度亦不同。温度亦不同。pH值：值：显示发酵过程中各种生化反应的综合结果。显示发酵过程中各种生化反应的综合结果。溶氧浓度（溶氧浓度（DO值，简称溶氧）：一般用绝对含量值，简称溶氧）：一般用绝对含量(mgL)来表示，有时也用在相同条件下氧在培养液中饱和度的来表示，有时也用在相同条件下氧在培养液中饱
2、和度的百分数百分数()来表示。来表示。基质含量：定时测定糖基质含量：定时测定糖(还原糖和总糖还原糖和总糖)、氮、氮(氨基氮或铵氨基氮或铵氮氮)等基质的浓度。等基质的浓度。空气流量：每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，空气流量：每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，也叫通风比。一般控制在也叫通风比。一般控制在0.51.0L(Lmin)。压力：罐压一般维持在压力：罐压一般维持在0.020.05MPa。搅拌转速：控制搅拌转速以调节溶氧。以每分钟的转数搅拌转速：控制搅拌转速以调节溶氧。以每分钟的转数表示。表示。搅拌功率：常指每立方米发酵液所消耗的功率搅拌功率：常指每立方米发酵液所消耗的功率(kW
3、m3)。黏度：细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵黏度：细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况，通常用表观黏度表示之。罐中菌丝分裂过程的情况，通常用表观黏度表示之。浊度：澄清培养液中低浓度非丝状菌的浊度：澄清培养液中低浓度非丝状菌的OD值与细胞浓值与细胞浓度成线性关系。一般采用分光光度计的波长度成线性关系。一般采用分光光度计的波长420660nm测测量，要求吸光率量，要求吸光率0.30.5。波长。波长600700nm间，一个吸光间，一个吸光率单位大约相当于率单位大约相当于1.5g细胞干重细胞干重L。浊度对氨基酸、核苷。浊度对氨基酸、核苷酸等产品的生产是极其重要的
4、。酸等产品的生产是极其重要的。(11)料液流量料液流量(12)产物的浓度：产物的浓度：(13)氧化还原电位：限氧条件发酵用氧化还原电位参数控氧化还原电位：限氧条件发酵用氧化还原电位参数控制则较理想。制则较理想。(14)废气中的氧含量：从废气中的氧和废气中的氧含量：从废气中的氧和CO2的含量可以算的含量可以算出产生菌的摄氧率、呼吸熵和发酵罐的供氧能力。出产生菌的摄氧率、呼吸熵和发酵罐的供氧能力。(15)废气中的废气中的CO2含量：揭示产生菌的呼吸代谢规律。含量：揭示产生菌的呼吸代谢规律。(16)菌丝形态：衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵菌丝形态：衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢
5、变化和决定发酵周期长短的依据之一。过程的代谢变化和决定发酵周期长短的依据之一。(17)菌体浓度：是控制微生物发酵的重要参数之一，特别菌体浓度：是控制微生物发酵的重要参数之一，特别是对抗生素次级代谢产物的发酵。常根据菌浓来决定适合是对抗生素次级代谢产物的发酵。常根据菌浓来决定适合的补料量和供氧量。的补料量和供氧量。由以上参数计算得出的菌体生长比速、氧比消耗速率、由以上参数计算得出的菌体生长比速、氧比消耗速率、糖比消耗速率、氮比消耗速率和产物比生成速率也是控制糖比消耗速率、氮比消耗速率和产物比生成速率也是控制产生菌的代谢、决定补料和供氧工艺条件的主要依据，多产生菌的代谢、决定补料和供氧工艺条件的主
6、要依据，多用于发酵动力学的研究。用于发酵动力学的研究。第一节第一节温度控制温度控制 发酵过程中，伴随着细胞的生长代谢、机械搅拌会产生一定发酵过程中，伴随着细胞的生长代谢、机械搅拌会产生一定的热量，而由于发酵罐壁散热和水分蒸发，又会带走部分热量，的热量，而由于发酵罐壁散热和水分蒸发，又会带走部分热量，因此，发酵罐的温度是不断变化的，必须加以控制，才能满足微因此，发酵罐的温度是不断变化的，必须加以控制，才能满足微生物生长代谢的需要，从而达到高效生产的目的生物生长代谢的需要，从而达到高效生产的目的。一一.发酵热及其测定发酵热及其测定二二.温度对微生物生长的影响温度对微生物生长的影响三三.温度对发酵的
7、影响温度对发酵的影响四四.最适温度的控制最适温度的控制一一.发酵热及其测定发酵热及其测定 微生物在发酵过程中，由于生物氧化作用和机械搅拌微生物在发酵过程中，由于生物氧化作用和机械搅拌作用等产生的热量，称为发酵热。作用等产生的热量，称为发酵热。1.发酵热发酵热发酵罐温的变化主要受以下几个因素的影响发酵罐温的变化主要受以下几个因素的影响。生物热生物热搅拌热搅拌热蒸发热蒸发热辐射热辐射热Q发酵发酵=Q生物生物+Q搅拌搅拌-Q蒸发蒸发-Q辐射辐射则则:产热产热散热散热净热量堆积净热量堆积发酵液的温度上升；发酵液的温度上升；相反，产热小于耗热，温度下降。相反，产热小于耗热，温度下降。（1）生物热（）生物
8、热（Q生物生物） 在微生物生长代谢过程中，由于生物氧化作用而释放出在微生物生长代谢过程中，由于生物氧化作用而释放出的热量称为生物热。的热量称为生物热。 营养物氧化分解释放出的能量，部分用于合成高能化合物，营养物氧化分解释放出的能量，部分用于合成高能化合物，并被消耗在各种代谢途径中，如合成新细胞组分，膜运输，鞭并被消耗在各种代谢途径中，如合成新细胞组分，膜运输，鞭毛运动，合成代谢产物等，其余部分则以热的形式散发出来。毛运动，合成代谢产物等，其余部分则以热的形式散发出来。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。产热的情况产热的情况：具有时间性
9、。具有时间性。发酵初期发酵初期对数生长期对数生长期发酵后期发酵后期如四环素发酵的发酵热最大是在如四环素发酵的发酵热最大是在2050h,最高可达最高可达29330KJ/(m3.h)，其它时段最低约为其它时段最低约为8380生物特异性。生物特异性。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，与营养有关。与营养有关。培养基成分愈丰富，营养被利用速度愈快，产生的生物热就培养基成分愈丰富，营养被利用速度愈快，产生的生物热就愈多。愈多。（2）搅拌热（）搅拌热（Q搅
10、拌搅拌） 机械搅拌通气发酵罐，发酵液体之间，液体与搅拌器等设机械搅拌通气发酵罐，发酵液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：可用下式计算：Q搅拌搅拌=P3601（kJ/h）式中式中:P为搅拌功率，（为搅拌功率，（kW）3601是机械能转变为热能的热功当量，是机械能转变为热能的热功当量，kJ/(kWh)（3）蒸发热（）蒸发热（Q蒸发蒸发） 通气时，引起发酵液水分的蒸发，被空气和蒸发水分带走通气时，引起发酵液水分的蒸发，被空气和蒸发水分带走的热量叫做蒸发热或汽化热。的热量叫做蒸发热或汽化热。
11、蒸发热可按下式计算：蒸发热可按下式计算：Q蒸发蒸发=qm(H出出-H进进)式中式中:qm为干空气的重量流量，（为干空气的重量流量，（kg空气空气/h）H出出、H进进为发酵罐排气和进气的热焓，（为发酵罐排气和进气的热焓，（kJ/kg干空气干空气）散热的情况散热的情况：（4）辐射热（）辐射热（Q辐射）辐射） 通过罐体表面向环境中发射红外线而散失的热量。热量通过罐体表面向环境中发射红外线而散失的热量。热量的大小决定于罐内外温度差大小、罐的表面积等。的大小决定于罐内外温度差大小、罐的表面积等。辐射热的大小，取决于罐内外温差的大小。辐射热的大小，取决于罐内外温差的大小。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过
12、发酵热的冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5。在发酵过程中，在发酵过程中，Q生物生物和和Q蒸发蒸发随时间而变化，因此，发酵热随时间而变化，因此，发酵热在整个发酵过程中，也随着时间而变化。为了使发酵维持在适在整个发酵过程中，也随着时间而变化。为了使发酵维持在适当的温度下进行，必须采取一定的保温措施：在夹套或蛇形管当的温度下进行，必须采取一定的保温措施：在夹套或蛇形管内通入冷热水来控制发酵罐的温度。内通入冷热水来控制发酵罐的温度。2.发酵热的测定发酵热的测定三种测算方法：三种测算方法：（1）利用热交换原理：利用热交换原理：通过测量一定时间内冷却水的流量通过测量一定时间内冷却水的流量和冷却水
13、进出口的温度，用下式计算：和冷却水进出口的温度，用下式计算：如果需要求生物热时：如果需要求生物热时：Q发酵发酵=qvC(t2-t1)/Vqv为冷却水的流量，（为冷却水的流量，（L/h）C为水的比热，为水的比热，kJ/（kg）t1、t2为进、出的冷却水温度为进、出的冷却水温度，（，（）V为发酵罐体积，（为发酵罐体积，（m3）式中式中:Q生物生物=Q发酵发酵-Q搅拌搅拌+Q蒸发蒸发+Q辐射辐射（2）利用温度变化率利用温度变化率S S（/h/h）：）：通过罐温的自动控制，通过罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自控装置，测量温度随时间上升的速先使罐温达到恒定，再关闭自控装置，测量温度随时间上升的
14、速率，按下式求出发酵热：率，按下式求出发酵热：经实测，抗生素发酵的最大发酵热均为经实测，抗生素发酵的最大发酵热均为300050000kJ(m3h)；谷氨谷氨酸发酵的最大发酵热约为酸发酵的最大发酵热约为70008000kJ(m3h)。Q发酵发酵=（m1c1+m2c2）u式中式中:m1、m2为发酵液、罐的质量，为发酵液、罐的质量，（kg）c1为发酵液的比热为发酵液的比热，kJ/（kg）C2为发酵罐材料的比热为发酵罐材料的比热，kJ/（kg）u为温度上升速率，（为温度上升速率，（h）（3）热力学方法：热力学方法：根据盖斯定律：根据盖斯定律：“在恒压和恒容条件下，一个反应不论是一步完在恒压和恒容条件下
15、，一个反应不论是一步完成或几步完成，其反应热是相同的成或几步完成，其反应热是相同的”。这实际上是热力学第一定。这实际上是热力学第一定律的必然推论，因为焓（律的必然推论，因为焓（H）是状态函数，过程的焓变与途径无）是状态函数，过程的焓变与途径无关，只决定于过程的始态和终态。发酵热可根据标准燃烧热或标关，只决定于过程的始态和终态。发酵热可根据标准燃烧热或标准生成热来计算。准生成热来计算。H=(H)反应物反应物-(H)产物产物二二.温度对微生物生长的影温度对微生物生长的影响响最低、最适和最高生长温度。最低、最适和最高生长温度。温度影响微生物生长的机理温度影响微生物生长的机理(1)影响酶活性。影响酶活
16、性。(2)影响细胞膜的流动性。影响细胞膜的流动性。(3)影响物质的溶解度。影响物质的溶解度。从最低生长温度到最适生长温度，通常温度每升高从最低生长温度到最适生长温度，通常温度每升高10，生生长速度就加快一倍。长速度就加快一倍。(1)(1)影响产物生成速度影响产物生成速度(2)(2)影响发酵液的物理性质影响发酵液的物理性质(3)(3)影响产物合成的方向影响产物合成的方向a.a.改变体内酶系改变体内酶系中间产物种类中间产物种类产物种类产物种类; ;b.b.使代谢比例失调；使代谢比例失调；(4)(4)影响产物特性影响产物特性三三.温度对发酵的影响温度对发酵的影响影响合成方向：用米曲霉制曲时，如温度在
17、低限时，得影响合成方向：用米曲霉制曲时，如温度在低限时，得到蛋白酶，此时到蛋白酶，此时-淀粉酶的合成受到抑制。金色链霉菌淀粉酶的合成受到抑制。金色链霉菌在低于在低于30C30C时合成链霉素，温度到达时合成链霉素，温度到达35C35C时，只产四环素时，只产四环素影响产物生成量：黑曲霉生长最适温度影响产物生成量：黑曲霉生长最适温度33-37C33-37C，积累柠，积累柠檬酸的最适温度在檬酸的最适温度在32C32C影响产物质量：凝结芽孢杆菌合成影响产物质量：凝结芽孢杆菌合成-淀粉酶时，发酵温淀粉酶时，发酵温度控制在度控制在5555时，合成的时，合成的-淀粉酶较耐高温，在淀粉酶较耐高温，在9090、6
18、0min60min条件下，其活性丧失仅条件下，其活性丧失仅1010左右，而发酵温度控制左右，而发酵温度控制在在3535时，合成的时，合成的-淀粉酶在相同条件下丧失淀粉酶在相同条件下丧失9090。青霉素产生菌的生长温度为青霉素产生菌的生长温度为30，产青霉素最适温度为产青霉素最适温度为25；乳酸链球菌最适生长温度乳酸链球菌最适生长温度34，而发酵产乳酸最适不超过，而发酵产乳酸最适不超过30谷氨酸产生菌的生长最适温度谷氨酸产生菌的生长最适温度3032，产生谷氨酸的温度一般比产生谷氨酸的温度一般比生长温度高，约为生长温度高，约为3437。同一种生产菌，菌体生长和积累代谢产物的最适温度同一种生产菌，菌
19、体生长和积累代谢产物的最适温度也往往不同。也往往不同。多数发酵情况是：多数发酵情况是：接种后的发酵液温度会下降，应适当提高接种后的发酵液温度会下降，应适当提高培养温度以利于孢子萌发或加速菌体生长；培养温度以利于孢子萌发或加速菌体生长；当发酵液温度上升后，应控制在菌体的最适生长温度；当发酵液温度上升后，应控制在菌体的最适生长温度；到主发酵旺盛阶段，温度应控制在代谢产物合成的最适温度；到主发酵旺盛阶段，温度应控制在代谢产物合成的最适温度；到发酵后期，温度出现下降趋势，直至发酵成熟即可放罐。到发酵后期，温度出现下降趋势，直至发酵成熟即可放罐。四四.最适温度的控制最适温度的控制在整个发酵过程中不能只选
20、一个最适培养温度在整个发酵过程中不能只选一个最适培养温度，最适于菌，最适于菌体生长的温度不一定最适于发酵产物的生成体生长的温度不一定最适于发酵产物的生成看生长和生物合成哪一个是主要方面看生长和生物合成哪一个是主要方面。前期前期:菌量少，取稍高的温度，使菌生长迅速；菌量少，取稍高的温度，使菌生长迅速；中期中期:菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在从而提高产量，因此温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正
21、常途径关闭得比较严密有利于产物合成。密有利于产物合成。后期后期:产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。高温度，刺激产物合成到放罐。温度的选择还要参考其他发酵条件。温度的选择还要参考其他发酵条件。通气条件较差可适当降低温度。通气条件较差可适当降低温度。这是由于在较低的温度下，这是由于在较低的温度下，氧溶解度相应较大，而菌体的生长速率相应较小，从而弥补了因氧溶解度相应较大，而菌体的生长速率相应较小，从而弥补了因通气不足而造成代谢异常。通气不足而造成代谢异常。培养基稀薄时培养基稀薄时,适应采用较低温度适应采用较低温度，
22、培养温度高则养料往往，培养温度高则养料往往过早耗竭，菌丝过早自溶。过早耗竭，菌丝过早自溶。例如，提高红霉素发酵温度在玉米浆培养基中的效果就不例如，提高红霉素发酵温度在玉米浆培养基中的效果就不如在黄豆粉培养基中好，因后者相对难利用，这时提高温度则如在黄豆粉培养基中好，因后者相对难利用，这时提高温度则有利于菌的同化。有利于菌的同化。各个发酵阶段的最适温度的选择应从各方面综合考各个发酵阶段的最适温度的选择应从各方面综合考虑。虑。又：青霉素发酵：最初又：青霉素发酵：最初5h维持在维持在30，635h为为25，3685h为为20，最后最后40h再升到再升到25。采用这种变温培养比。采用这种变温培养比25
23、恒温培养所得青霉素产量高恒温培养所得青霉素产量高14.7。eg:在四环素发酵中，采用变温控制，中后期保持较的温度，在四环素发酵中，采用变温控制，中后期保持较的温度，以延长抗生素分泌期，放罐前以延长抗生素分泌期，放罐前24h提高提高23。能使最后。能使最后24h的发的发酵单位提高酵单位提高50%以上。以上。如何选择最适发酵温度？1、根据菌种及生长阶段选择。微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温
24、度要稍低一些，可以推迟衰老。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。2、根据培养条件选择。温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。3、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。第二节第二节PH值控制值控制一一.PH值对
25、菌体生长和代谢产物形成的影响值对菌体生长和代谢产物形成的影响二二.影响影响PH值变化的因素值变化的因素三三.发酵过程发酵过程PH值的调节及控制值的调节及控制不仅影响微生物的生长，而且也影响着代谢产物的形成。不仅影响微生物的生长，而且也影响着代谢产物的形成。主要影响：主要影响：（1）导致微生物细胞原生质膜的电荷发生改变。导致微生物细胞原生质膜的电荷发生改变。（3）影响培养基某些重要的营养物质和中间代谢产）影响培养基某些重要的营养物质和中间代谢产物的解离，进而影响该物质的利用。物的解离，进而影响该物质的利用。（2）影响酶的活性。）影响酶的活性。一一.PH值对菌体生长和代谢产物形成的影值对菌体生长和
26、代谢产物形成的影响响此外：此外：pHpH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。使代谢产物的质量和比例发生改变。影响氧的溶解和氧化还原电势的高低；影响氧的溶解和氧化还原电势的高低；pHpH值影响孢子发芽；值影响孢子发芽；举例：举例：影响菌体的生长：产黄曲霉的细胞壁的厚度就随影响菌体的生长：产黄曲霉的细胞壁的厚度就随pH值的增加而减小：其菌丝直径在值的增加而减小：其菌丝直径在pH6.0时为时为23m；pH7.4时为时为218m，并呈膨胀酵母状；，并呈膨胀酵母状；pH值下降后菌丝形态又会恢复正常。值下降后菌丝形态又会恢复正常。影响产物
27、合成：合成青霉素的最适影响产物合成：合成青霉素的最适pH值范围为值范围为6.56.8。影响产物稳定性：影响产物稳定性：-内酰胺抗生素沙纳霉素的发酵内酰胺抗生素沙纳霉素的发酵中，中，pH在在6.77.5之间时抗生素的产量相近，高于之间时抗生素的产量相近，高于或低于这个范围，合成受到抑制。在这个或低于这个范围，合成受到抑制。在这个pH值范值范围内，沙纳霉素的稳定性未受到严重影响；但围内，沙纳霉素的稳定性未受到严重影响；但pH7.5时，稳定性下降，半衰期缩短，发酵单位也时，稳定性下降，半衰期缩短，发酵单位也下降。青霉素在碱性条件下发酵单位低，也与青霉下降。青霉素在碱性条件下发酵单位低，也与青霉素的稳
28、定性有关。素的稳定性有关。不同种类的微生物，对不同种类的微生物，对pHpH要求不同；要求不同；酵酵 母：母：pH 3.8pH 3.86.06.0细细 菌：菌：pH 6.5pH 6.57.57.5霉霉 菌：菌：pH 4.0pH 4.05.85.8放线菌：放线菌：pH 6.5pH 6.58.08.0同种微生物对同种微生物对pHpH变化的反映不同。变化的反映不同。如，石油代蜡酵母如，石油代蜡酵母pH 3.5pH 3.55.0 5.0 生长良好，不易染菌；生长良好，不易染菌；pH 5.0pH 5.0时，易染细菌；时，易染细菌；pH 3.0pH 花生饼粉黄豆饼粉发酵过程中污染杂菌使发酵液粘度增加，也会产
29、生大量泡沫。发酵过程中污染杂菌使发酵液粘度增加，也会产生大量泡沫。糖类物质本身起泡能力很差，但在丰富培养基中较高浓度糖糖类物质本身起泡能力很差，但在丰富培养基中较高浓度糖类物质增加培养基的黏度，而有利于泡沫的稳定类物质增加培养基的黏度，而有利于泡沫的稳定（3）菌种、种子质量和接种量）菌种、种子质量和接种量菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量。以加大接种量。（4）灭菌质量）灭菌质量培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微
30、生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。无效。泡沫的控制，可以采用三种途径：泡沫的控制，可以采用三种途径： 调整培养基中的成分调整培养基中的成分( (如少加或缓加易起泡的原如少加或缓加易起泡的原材料材料) )或改变某些物理化学参数或改变某些物理化学参数( (如如pHpH值、温度、值、温度、通气和搅拌通气和搅拌) )或者改变发酵工艺或者改变发酵工艺( (如采用分次投料如采用分次投料) )来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度。效果有一定的限度。 泡沫的控制泡沫的控制 采用机械
31、消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫：通过化学方法，降低泡沫液膜的表面形成的泡沫：通过化学方法，降低泡沫液膜的表面张力，使泡沫破灭；利用物理方法，使泡沫液膜的张力，使泡沫破灭；利用物理方法，使泡沫液膜的局部受力，打破液膜原来受力平衡而破裂。局部受力，打破液膜原来受力平衡而破裂。 采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素菌种，来消除起泡的内在因素如：杂交选育不产流态泡沫的土霉素生产菌株如：杂交选育不产流态泡沫的土霉素生产菌株 对于已形成的泡沫，工业上可以采用机械消泡对于已形成的泡沫
32、，工业上可以采用机械消泡和化学消泡剂消泡或两者同时使用消泡。和化学消泡剂消泡或两者同时使用消泡。是目前应用最广的一种消泡方法。是目前应用最广的一种消泡方法。三三.化学消泡化学消泡来源广泛来源广泛消泡效果好消泡效果好作用迅速可靠作用迅速可靠用量少用量少不需改造现有设备不需改造现有设备优点优点容易实现自动控制容易实现自动控制常用的一些消泡剂：常用的一些消泡剂：天然油脂：天然油脂：高碳醇、脂肪酸和酯类：十八醇是常用的一种，它可以单高碳醇、脂肪酸和酯类：十八醇是常用的一种，它可以单独或与载体一起使用。独或与载体一起使用。 聚醚类；聚醚类；硅酮类硅酮类(聚硅油类聚硅油类)；主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物，
33、无；主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物，无色液体，不溶于水，表面张力低达色液体，不溶于水，表面张力低达21dyn/cm（泡敌为（泡敌为33，向，向日葵油日葵油40，青霉素发酵液，青霉素发酵液60-68dyn/cm）。纯聚二甲基硅氧）。纯聚二甲基硅氧烷的消泡能力低，常加分散剂来提高消泡活性，或乳化剂成烷的消泡能力低，常加分散剂来提高消泡活性，或乳化剂成乳状液。适用于微碱性发酵，对于微酸性发酵较差。乳状液。适用于微碱性发酵，对于微酸性发酵较差。 （1）天然油脂）天然油脂最早消泡剂，来源容易，价格低，使用简单，一般来说最早消泡剂，来源容易，价格低，使用简单，一般来说没有明显副作用，如豆油、菜油、鱼油等。没
34、有明显副作用，如豆油、菜油、鱼油等。有些油是发酵产物的前体，如豆油是红霉素的前体，鱼有些油是发酵产物的前体，如豆油是红霉素的前体，鱼油是螺旋霉素的前体。油是螺旋霉素的前体。分子中无亲水基团，在发酵液中难铺展，所以消泡活性分子中无亲水基团，在发酵液中难铺展，所以消泡活性差，用量大，一般为发酵液的差，用量大，一般为发酵液的0.1-0.2%近年来出于对环境保护的重视，天然产物消泡剂的地位近年来出于对环境保护的重视，天然产物消泡剂的地位又有些提高，而且还在研究新的天然消泡剂又有些提高，而且还在研究新的天然消泡剂 （2）聚醚类消泡剂）聚醚类消泡剂我国常用甘油三羟基聚醚我国常用甘油三羟基聚醚。六十年代发明
35、此类消泡剂，美国道。六十年代发明此类消泡剂，美国道康宁化学公司首先投产。康宁化学公司首先投产。它是以甘油为起始剂，由环氧丙烷，或环氧乙烷与环氧丙烷的它是以甘油为起始剂，由环氧丙烷，或环氧乙烷与环氧丙烷的混合物进行加成聚合而制成的。只在甘油分子上加成聚合环氧混合物进行加成聚合而制成的。只在甘油分子上加成聚合环氧丙烷的产物叫丙烷的产物叫聚氧丙烯甘油定名为聚氧丙烯甘油定名为GP型消泡剂型消泡剂；在在GP型消泡剂的聚丙二醇链节末端再加成环氧乙烷，成为链型消泡剂的聚丙二醇链节末端再加成环氧乙烷，成为链端是亲水基的聚氧乙烯氧丙烯甘油，也叫端是亲水基的聚氧乙烯氧丙烯甘油，也叫GPE型消泡剂（泡型消泡剂（泡敌
36、）敌）。按照环氧乙烷加成量为。按照环氧乙烷加成量为10%，20%，50%分别称为分别称为GPE10，GPE20，GPE50。其他的消泡剂其他的消泡剂，如：聚乙二醇等高碳醇消泡剂多，如：聚乙二醇等高碳醇消泡剂多适用于霉菌发酵，硅酮类较适用于微碱性的细菌适用于霉菌发酵，硅酮类较适用于微碱性的细菌发酵。所以，应结合具体产品发酵，试验上述各发酵。所以，应结合具体产品发酵，试验上述各种消泡剂的消泡效果，以获得良好的消泡作用。种消泡剂的消泡效果，以获得良好的消泡作用。值得注意的是：消泡剂有选择性。消泡剂用多了值得注意的是：消泡剂有选择性。消泡剂用多了有毒性，而且还影响通气和气体分散，因此要少有毒性，而且还
37、影响通气和气体分散，因此要少量地加。量地加。 消泡剂的使用有以下几种形式（增效作用）：消泡剂的使用有以下几种形式（增效作用）： 消泡剂消泡剂 + + 载体：惰性载体载体：惰性载体( (如矿物油、植物油等如矿物油、植物油等) ) 复合消泡剂：如复合消泡剂：如GPGP和和GPEGPE以以l:1l:1混合使用于土霉素发混合使用于土霉素发酵，结果比单独使用酵，结果比单独使用GPGP的效力提高的效力提高2 2倍；倍； 消泡剂消泡剂 + + 乳化剂：适用于亲水性差的消泡剂。如用乳化剂：适用于亲水性差的消泡剂。如用吐温吐温8080制成的乳剂，用于庆大霉素发酵，效力提高制成的乳剂，用于庆大霉素发酵，效力提高1
38、 12 2倍。倍。使用要考虑的因素：使用要考虑的因素：(1)(1)种类的选择：种类的选择： 不影响发酵和提取，能力持久。不影响发酵和提取，能力持久。(2)(2)用量的选择：用量的选择：0.003-0.025%0.003-0.025%(3)(3)方法的选择：方法的选择： 应用之前作比较性试验，找出消沫剂对应用之前作比较性试验，找出消沫剂对微生物生理特征影响最小、消沫效率最大的微生物生理特征影响最小、消沫效率最大的条件；成本。条件；成本。四四.机械消泡机械消泡 物理作用，靠机械强烈振动，压力的变化，促使气泡破裂，物理作用，靠机械强烈振动，压力的变化，促使气泡破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分
39、离回收。或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。 化学消泡最显著的缺点是影响氧气的溶解，化学消泡最显著的缺点是影响氧气的溶解，使其减少使其减少1/31/31/51/5，这对微生物供氧极为不利；，这对微生物供氧极为不利；机械消泡能克服这一缺点，但其应用效果不如化机械消泡能克服这一缺点，但其应用效果不如化学消泡迅速可靠，不能从根本上消除引起稳定泡学消泡迅速可靠，不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素。沫的因素。 消泡装置设计依据：消泡装置设计依据：动力小；动力小；结构简单；结构简单；易清洁；易清洁；运行可靠；运行可靠；维护费用低；维护费用低；机械消泡的特点：机械消泡的特点：优点优点不需外加其他物质不
40、需外加其他物质节省原料（消泡剂）节省原料（消泡剂）减少因加入消泡剂而引起的污染减少因加入消泡剂而引起的污染对提取工艺无任何副作用对提取工艺无任何副作用缺点缺点不如化学消泡迅速可靠不如化学消泡迅速可靠需要一定的设备需要一定的设备需消耗一定的动力需消耗一定的动力不能彻底消除引起稳定泡沫的因素不能彻底消除引起稳定泡沫的因素方法方法 罐外罐外旋转叶片式旋转叶片式喷雾式喷雾式离心式离心式转向板式转向板式 罐内罐内耙式耙式旋转圆盘式旋转圆盘式流体吹入式流体吹入式冲击反射板式冲击反射板式碟片式碟片式超声波超声波吸引消泡吸引消泡产品型号：ADF全自动机械消泡器， 利用离心力来破碎利用离心力来破碎发酵酵过程程产
41、生的泡沫，使气液分生的泡沫，使气液分离离，分离出的泡沫液可以重新回到发酵罐中，减少逃液损失，结合尾气冷凝系统，可以更有效地减少大通 气量条件下发酵液损失。泡沫通过消泡器进口进入转子的工作区，高速高速转子提供子提供的剪切力撕碎气泡的剪切力撕碎气泡，气泡释放出的液体立即被离心力摔向器壁，并压缩为液流，部分 回流到发酵罐中，部分通过器壁的多孔结构流向涡壳收集器中，由管道返回发酵罐中。 机械消泡器机械消泡器 离心力消泡离心力消泡补料分批发酵补料分批发酵(fed-batchculture，FBC)：又称半连续培养或半连续发酵，是指在又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或
42、分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法，是分批多种成分的新鲜培养基的培养方法，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。酵工业。第五节第五节补料控制补料控制二二.补料的内容补料的内容三三.补料的原则补料的原则四四.补糖的控制补糖的控制五五.补氮和无机盐补氮和无机盐一一.FBC的作用的作用1 1） 可以控制抑制性底物的浓度可以控制抑制性底物的浓度高浓度营养物抑制微生物生长：高浓度营养物抑制微生物生长： 基质过浓使渗透压过高，细胞因脱水而死亡；基
43、质过浓使渗透压过高，细胞因脱水而死亡； 高浓度基质能使微生物细胞热致死高浓度基质能使微生物细胞热致死(themal death)(themal death)，如乙，如乙醇浓度达醇浓度达1010时，就可使酵母细胞热致死；时，就可使酵母细胞热致死； 有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用，如高浓度苯酚制作用，如高浓度苯酚(3(35 5) )可凝固蛋白；可凝固蛋白； 高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。一一.FBC的作用的作用有的基质是合成产物必需的前体物质，浓有的基质是合成产
44、物必需的前体物质，浓度过高，就会影响菌体代谢或产生毒性，度过高，就会影响菌体代谢或产生毒性，使产物产量降低。使产物产量降低。如苯乙酸、丙醇如苯乙酸、丙醇(或丙酸或丙酸)分分别是青霉素、红霉素的前体物质，浓度过大，就别是青霉素、红霉素的前体物质，浓度过大，就会产生毒性，使抗生素产量减少。会产生毒性，使抗生素产量减少。采用采用FBC方式，可以控制适当的基质浓度，使菌方式，可以控制适当的基质浓度，使菌处于处于“半饥饿半饥饿”状态。状态。2 2） 解除或减弱分解代谢物的阻遏解除或减弱分解代谢物的阻遏有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏，如葡萄糖阻抑，如葡萄糖
45、阻抑纤维素酶、赤霉素、青霉素等多种酶或产物的合成。通过补料纤维素酶、赤霉素、青霉素等多种酶或产物的合成。通过补料来限制基质葡萄糖的浓度，就可解除酶或其产物的阻遏，提高来限制基质葡萄糖的浓度，就可解除酶或其产物的阻遏，提高产物产量。产物产量。缓慢流加葡萄糖，纤维素酶的产量几乎增加缓慢流加葡萄糖，纤维素酶的产量几乎增加200200倍；将葡萄糖倍；将葡萄糖浓度控制在浓度控制在0.020.02水平，赤霉素浓度可达水平，赤霉素浓度可达905 mg905 mgL L；采用滴加；采用滴加葡萄糖的技术，可明显提高青霉素的发酵单位等。这都是利用葡萄糖的技术，可明显提高青霉素的发酵单位等。这都是利用发酵技术解决分
46、解代谢物阻遏的实际应用。在植物细胞培养中，发酵技术解决分解代谢物阻遏的实际应用。在植物细胞培养中，也采用该技术来提高产量。也采用该技术来提高产量。葡萄糖效应葡萄糖效应3）可以使发酵过程最佳化）可以使发酵过程最佳化分批发酵动力学的研究，阐明了各个参数之间的分批发酵动力学的研究，阐明了各个参数之间的相互关系。利用相互关系。利用FBC技术，就可以使菌种保持在技术，就可以使菌种保持在最大生产力的状态。最大生产力的状态。随着随着FBC补料方式的不断改进，为发酵过程的优补料方式的不断改进，为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础。化和反馈控制奠定了基础。随着计算机、传感器等的发展和应用，已有可能随着计算机、传
47、感器等的发展和应用，已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的数学模型在线方用离线方式计算或用模拟复杂的数学模型在线方式实现最优化控制。式实现最优化控制。二二.补料的内容补料的内容能源和碳源；能源和碳源；氮源；氮源；微量元素或无机盐；微量元素或无机盐；诱导物；诱导物；对于产诱导酶的微生物，是提高酶产量的重要措施。原则原则：控制微生物的中间代谢，使之向着有利于控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。产物积累的方向发展。 根据菌体生长代谢规律；根据菌体生长代谢规律； 生产需要；生产需要； 环境条件环境条件方法：充足而不过量（少量多次或分批流加）方法：充足而不过量（少量多次或分批流加）三三
48、.补料的原则补料的原则 补糖时机补糖时机过早，刺激生长，加速糖利用；过早，刺激生长，加速糖利用；过迟，所需能量跟不上。如谷氨酸发酵在对数生过迟，所需能量跟不上。如谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料。长期的末期补料。判断：培养基条件，菌种，发酵状况（残糖，判断：培养基条件，菌种，发酵状况（残糖，pHpH，菌，菌形态等），在需要时加入；形态等），在需要时加入；四四.补糖的控制补糖的控制补糖方式补糖方式连续流加：连续流加：每次流加又可分为快速流加、恒速流加、指数速率流加和变速流加。少量多次间歇补入少量多次间歇补入大量少次补入 可与其他组分一起进行多组分补料。可与其他组分一起进行多组分补料。以不引起发酵
49、液成分剧烈波动为前提；以不引起发酵液成分剧烈波动为前提； 补糖量补糖量加入与消耗平衡，维持稳定的糖浓度加入与消耗平衡，维持稳定的糖浓度；例：例：a四环素发酵还原糖维持在四环素发酵还原糖维持在0.8-1.5%b谷氨酸追加糖液发酵：在原工艺基础上，加大接种量到谷氨酸追加糖液发酵：在原工艺基础上，加大接种量到10%，增加生物素用量达，增加生物素用量达5g/L，减少初糖浓度（，减少初糖浓度（12%7-8%）尽快获得大量的生产型菌体，当菌体处在生长对数）尽快获得大量的生产型菌体，当菌体处在生长对数期后进入产酸期，糖浓度在期后进入产酸期，糖浓度在2%左右时，连续流加糖液，维左右时，连续流加糖液，维持持2%
50、左右的糖浓度。左右的糖浓度。优点：低浓度发酵，以利于生长和发酵；优点：低浓度发酵，以利于生长和发酵；总糖浓度达总糖浓度达20%，产酸高。，产酸高。补糖开始时，不但补糖开始时，不但CRR（CO2的释放率）的释放率） 、OUR（氧摄取速率氧摄取速率 ）大幅度提高，连大幅度提高，连RQ（呼吸熵）呼吸熵） 也提高约也提高约10，表明通过补糖不但提供了更多的，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。相关酶活力也提高，产能增加。发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使
51、菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。持产生次级代谢产物的速率在较高水平。五五.补氮和无机盐补氮和无机盐 通氨是某些发酵生产补料工艺的有效措施，主要通氨是某些发酵生产补料工艺的有效措施，主要起补充无机氮源和调节起补充无机氮源和调节pH值的作用。但应注意通氨时值的作用。但应注意通氨时避免局部过量和泡沫情况。避免局部过量和泡沫情况。 也可以根据发酵代谢的具体情况，中间添加某些也可以根据发酵代谢的具体情况，中间添加某些具有调节生长代谢作用的物料，如磷酸盐、具有调节生长代谢作用的物料，如磷酸盐、尿素尿素、硝酸、硝酸盐、盐
52、、Na2SO4、酵母粉或玉米浆等。酵母粉或玉米浆等。如遇生长迟慢、耗糖低，一般可补充适量的磷酸盐，以促进糖如遇生长迟慢、耗糖低，一般可补充适量的磷酸盐，以促进糖的作用。的作用。 流加尿素，一方面调节流加尿素，一方面调节pH，另一方面补氮。，另一方面补氮。 谷氨酸发酵时，初次加入尿素量和补加量取决谷氨酸发酵时，初次加入尿素量和补加量取决于菌种的脲酶活力强弱和耐尿能力。于菌种的脲酶活力强弱和耐尿能力。脲酶活力低，耐尿素强，初次加入用量多脲酶活力低，耐尿素强，初次加入用量多2%，流加次数少流加次数少脲酶活力强，耐尿素低，初次加入用量少脲酶活力强，耐尿素低，初次加入用量少0.6%，流加以少量多次好，流
53、加以少量多次好补料应注意的问题：补料应注意的问题：（1）料液配比要适合：）料液配比要适合：过浓会影响到消毒及料液的输送，过浓会影响到消毒及料液的输送，过稀则料液体积增大，引起一系列问题，如发酵单位稀释、液过稀则料液体积增大，引起一系列问题，如发酵单位稀释、液面上升、加油量增加等；面上升、加油量增加等；（2）加强无菌控制：）加强无菌控制：由于经常性添加物料易染菌由于经常性添加物料易染菌（3）经济核算）经济核算：节约粮食，并注意培养基的碳氮平衡等。节约粮食，并注意培养基的碳氮平衡等。第六节第六节发酵终点的判断发酵终点的判断一一.发酵终点的判断发酵终点的判断二二.自溶的监测自溶的监测三三.影响自溶的
54、因素影响自溶的因素生产能力（或称生产率、产率）是指单位时生产能力（或称生产率、产率）是指单位时间内单位罐体积发酵液的产物积累量而言。间内单位罐体积发酵液的产物积累量而言。生产率单位一般为生产率单位一般为g(Lh)或或kg(m3h)，产物浓度，产物浓度单位为单位为gL或或kgm3，发酵时间单位为，发酵时间单位为h。高生产率高生产率+成本控制成本控制到了衰亡期，菌体的产物分泌能力都要下降，产物到了衰亡期，菌体的产物分泌能力都要下降，产物的生产率相应下降或停止。有的产生菌在衰亡期，的生产率相应下降或停止。有的产生菌在衰亡期，营养耗尽，菌体衰老而进入自溶，释放出体内的分营养耗尽，菌体衰老而进入自溶，释
55、放出体内的分解酶会破坏已形成的产物。解酶会破坏已形成的产物。发酵终点的判断原则发酵终点的判断原则根据发酵类型和生产目标判断发酵终点。根据发酵类型和生产目标判断发酵终点。对发酵及原材料成本占整个生产成本主要部分的对发酵及原材料成本占整个生产成本主要部分的发酵品种，主要追求提高生产率发酵品种，主要追求提高生产率(kg/m3h)，得率，得率(kg产物产物/kg基质基质)和发酵系数和发酵系数(kg产物产物/罐容积罐容积m3发发酵周期酵周期h)下游提取精制成本占主要部分和产品价格比较贵，下游提取精制成本占主要部分和产品价格比较贵，除了要求高的产率和发酵系数外，还要求高的产除了要求高的产率和发酵系数外，还
56、要求高的产物浓度。物浓度。一一.发酵终点的判断发酵终点的判断1、产品质量因素、产品质量因素如果发酵时间太短：过多剩余营养物（如各种蛋白、脂肪等）如果发酵时间太短：过多剩余营养物（如各种蛋白、脂肪等）残留在发酵液，分离提纯困难残留在发酵液，分离提纯困难如果发酵时间太长：菌体自溶，释放出菌体蛋白及各种酶类，如果发酵时间太长：菌体自溶，释放出菌体蛋白及各种酶类，改变发酵液性质或破坏产物改变发酵液性质或破坏产物2、经济效益、经济效益对于发酵和原料占主要成本：追求高生产率（对于发酵和原料占主要成本：追求高生产率（kg/m3h）、）、得率得率（kg产物产物/kg基质）基质）对下游提取纯化占主成本：除上述考
57、虑，还要求产物浓度高。对下游提取纯化占主成本：除上述考虑，还要求产物浓度高。3、特殊因素、特殊因素发现染菌，宜当立断放罐，以免倒罐造成更大损失。发现染菌，宜当立断放罐，以免倒罐造成更大损失。临发酵终点，加糖、补料，消泡剂要慎重，以免影响后续临发酵终点，加糖、补料，消泡剂要慎重，以免影响后续工艺。工艺。判断放罐的指标：判断放罐的指标：产物产量、过滤速度、氨基酸含量、菌体形态、产物产量、过滤速度、氨基酸含量、菌体形态、PH、发酵液外观与黏度等来综合确定。发酵液外观与黏度等来综合确定。1、自溶：微生物因养分的缺乏或处于不利的生长环自溶：微生物因养分的缺乏或处于不利的生长环境下受其自身作用开始裂解的过
58、程。境下受其自身作用开始裂解的过程。二二.自溶的监测自溶的监测2、自溶的监测方法、自溶的监测方法常规方法（化学和分光光度法）：监测生物量与产物浓度及常规方法（化学和分光光度法）：监测生物量与产物浓度及氨基酸脱氨生成氨基酸脱氨生成NH4+反映菌体自溶情况。反映菌体自溶情况。计算机辅助的成像分析技术：对菌形态定量描述，监测有自计算机辅助的成像分析技术：对菌形态定量描述，监测有自溶征兆菌体所占比例。溶征兆菌体所占比例。酶学分析法：监测对自溶起作用的关键酶活性：蛋白酶；酶学分析法：监测对自溶起作用的关键酶活性：蛋白酶；-1,3-葡聚糖水解酶等。葡聚糖水解酶等。三三.影响自溶的因素影响自溶的因素1、化学
59、物质、化学物质（如高浓度乙醇；（如高浓度乙醇；C、N源及源及O2缺失）：外部缺失）：外部因素因素如青霉素发酵时：中后期如青霉素发酵时：中后期NH4+供给不足（供给不足（0.25-0.34g/L），），青霉素合成中止，菌丝自溶加剧。青霉素合成中止，菌丝自溶加剧。O2限制可显著降低青霉素限制可显著降低青霉素V的合成速率，出现自溶的时间的合成速率，出现自溶的时间比比DO控制控制40%空气饱和度的发酵更早，在空气饱和度的发酵更早，在120h后大多菌丝出后大多菌丝出现自溶征兆现自溶征兆.2、内在因素、内在因素如菌龄老化，与蛋白酶、如菌龄老化，与蛋白酶、-葡聚糖酶和壳聚糖酶有关。葡聚糖酶和壳聚糖酶有关。黑黑曲曲霉霉中中柠柠檬檬酸酸的的代代谢谢溢溢出出GG-6-P(磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶)柠檬酸柠檬酸,NH4I+A1.6二磷酸二磷酸果糖果糖丙酮酸丙酮酸草酰乙酸草酰乙酸乙酰乙酰CoA柠檬柠檬酸酸顺乌头酸顺乌头酸异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸(丙酮酸羧化丙酮酸羧化酶酶)(柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶 )-酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶
