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1、第一节基因工程的原理普通玫瑰蓝色妖姬思考：蓝色妖姬如何培育的？“蓝色妖姬”最早来自荷兰是一种加工花卉。它是用一种对人体无害的染色剂和助染剂调合成着色剂，等白玫瑰（或白月季）快到花期时，开始用染料浇灌花卉，让花像吸水一样，将色剂吸入进行染色。据花卉专家介绍，目前世界上极少有自然生长的蓝色玫瑰花，现在市场上出售的“蓝色妖姬”都是人工染色后的产物。比较正规的“蓝色妖姬”是在花卉的成长期开始染色，颜色能均匀地附着在花瓣上，看上去比较自然；部分商贩直接将普通的白玫瑰花采摘后染成蓝色，颜色不自然，也容易掉色。2008年11月1日闭幕的东京国际花卉博览会上，全球首批真正的蓝玫瑰首次在公众面前亮相。这种蓝玫瑰
2、是转基因玫瑰，被植入三色紫罗兰所含一种能刺激蓝色素产生的基因，花瓣因而自然呈现蓝色。基因工程培育蓝色玫瑰的简要过程：基因工程培育蓝色玫瑰的简要过程：普通玫瑰普通玫瑰( (无蓝色无蓝色) )蓝色基因蓝色基因与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入普通玫瑰细胞普通玫瑰细胞( (含蓝色含蓝色基因基因) )蓝色玫瑰蓝色玫瑰( (有蓝色有蓝色) )上述培育蓝色玫瑰的关键步骤是什么？上述培育蓝色玫瑰的关键步骤是什么？三色紫罗兰三色紫罗兰提取提取基因工程培育蓝色玫瑰的关键步骤：基因工程培育蓝色玫瑰的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：从三色紫罗兰中提取蓝色基因从三色紫罗兰中
3、提取蓝色基因关键步骤二：关键步骤二：蓝色基因蓝色基因与运载体与运载体DNA连接连接关键步骤三：关键步骤三：蓝色基因蓝色基因导入受体导入受体(普通玫瑰普通玫瑰)细胞细胞解决培育蓝色玫瑰的关键步骤需要哪些工具解决培育蓝色玫瑰的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：基因的基因的剪刀剪刀限制酶限制酶基因的基因的针线针线DNA连接酶连接酶基因的基因的运载工具运载工具运载体运载体1.基因工程又叫什么？2.基因工程的工具有哪些？3.“分子手术刀”是什么？作用是什么？断开的化学键是什么？4.“分子缝合针”是什么？作用是
4、什么？缝合的化学键是什么？链接的是什么？5.“分子运输车”是什么？作用是什么？需要什么条件？常用的载体有哪些？我展示我展示 我精彩我精彩展示问题展示问题展示小组展示小组点评点评1.基因工程又叫什么？10组组B/C5组A2.基因工程的工具有哪些？9组组B/C4组A3.“分子手术刀”是什么？作用是什么？断开的化学键是什么？8组组B/C3组A4.“分子缝合针”是什么？作用是什么？缝合的化学键是什么？链接的是什么？7组组B/C2组A5.“分子运输车”是什么？作用是什么？需要什么条件？常用的载体有哪些？6组组B/C1组A基因工程按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外_，并与特殊的运载工具进行_，然后转入
5、另一种生物的体内进行扩增，并使之表达产生所需蛋白质的技术。剪切剪切重新组合重新组合DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具“分子手术刀分子手术刀” 限制酶限制酶 “分子缝合针分子缝合针” DNA连接酶连接酶 “分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 一、基因工程所需的工具识别双链识别双链识别双链识别双链DNA DNA 分子的某种分子的某种分子的某种分子的某种特定的核苷酸特定的核苷酸特定的核苷酸特定的核苷酸序列序列序列序列，并且使每一条链中，并且使每一条链中，并且使每一条链中，并且使每一条链中特定部位特定部位特定部位特定部位的两的两的两的两个核苷酸之间的个核苷酸
6、之间的个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。断开。断开。主要是从主要是从主要是从主要是从原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来的一的一的一的一种酶。能将外来的种酶。能将外来的种酶。能将外来的种酶。能将外来的DNADNA切断切断切断切断，由于这种，由于这种，由于这种，由于这种切割作用是在切割作用是在切割作用是在切割作用是在DNADNA分子内部进行的，故分子内部进行的，故分子内部进行的，故分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。名限制性核酸内切酶。名限制性核酸内切酶。名限制性核酸内切酶。4000种。种。 1、
7、来源：、来源： 2、种类：、种类：3、作用：、作用：4、结果：、结果：形成两种末端形成两种末端形成两种末端形成两种末端(一一)、 “分子手术刀分子手术刀” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶黏性末端黏性末端平末端平末端限制性内切酶作用过程点击播放点击播放DNA连接酶 1. 1.连接酶的作用：将互补配对的两个黏性将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的末端连接起来，使之成为一个完整的DNADNA分子。分子。 问题问题问题问题用用用用DNADNADNADNA连接酶连接两个相同的黏连接酶连接两个相同的黏连接酶连接两个相同的黏连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？性未端要连接几个
8、磷酸二酯键？性未端要连接几个磷酸二酯键？性未端要连接几个磷酸二酯键？2.2.连接的部位连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。：磷酸二酯键，不是氢键。DNA连接酶的作用过程点击播放点击播放 大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶的一种限制酶能识别能识别GAATTC序列序列，并在，并在G和和A之间切开。之间切开。限制酶限制酶什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？限制限制限制限制酶酶酶酶什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正好，他们之间正好互互补配对补配对，这
9、样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。什么叫平末端？什么叫平末端？ 当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线从识别序列的中心轴线处切开时，处切开时，切开的切开的DNADNA两条单链的切口，两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫是平整的，这样的切口叫平末端平末端。(二二)、 “分子缝合针分子缝合针” DNA连接酶连接酶1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键 DNA连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端之间的缝隙之间的缝隙“缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重
10、组的起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。分子就形成了。DNA连接酶的作用过程返回APCPGPTPAPCPGPTP限制酶切割的是哪个部位的键限制酶切割的是哪个部位的键? ? T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 A DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli连连接酶。另一种是从接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相
11、同，都是连连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链接双链DNA的缺口（的缺口（nick），而不能连接单链），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与位碳原子上的羟基与5位位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连
12、接酶是在两个连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间片段之间形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNA链为模板，链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的板链互补的DNA链；而链；而DNA连接酶是将连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。组成和性质各
13、不相同。( (三三) )、基因进入受体细胞的运载体基因进入受体细胞的运载体“分子运输车分子运输车”（1 1）运载体的作用）运载体的作用u作为运载工具，将外源基因作为运载工具，将外源基因( (抗虫基因抗虫基因) )转移到受体细胞转移到受体细胞( (棉花细棉花细胞胞) )中去。中去。u利用运载体在受体细胞利用运载体在受体细胞( (棉花细胞棉花细胞) )内，对外源基因内，对外源基因( (抗虫基因抗虫基因) )进进行大量复制。行大量复制。（随载体的复制而复制）（随载体的复制而复制）（2）作为运载体必须具备的条件）作为运载体必须具备的条件u能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。能够在宿主细胞中自我复制并
14、稳定地保存。u具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。u具有某些标记基因，便于进行筛选。具有某些标记基因，便于进行筛选。u必需是安全的，不会对受体必需是安全的，不会对受体 细胞有害。细胞有害。u大小应适合，便于提取和操作大小应适合，便于提取和操作（3）常用的运载体）常用的运载体 基因进入受体细胞的运载体基因进入受体细胞的运载体“分子运输车分子运输车”u细菌细胞质的质粒细菌细胞质的质粒u噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物u动植物病毒动植物病毒注意：真正用作运载体的质粒都注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。是人工改造过的。 基因进入受体细胞的运
15、载体基因进入受体细胞的运载体“分子运输车分子运输车” 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，其中常含有抗药基因，如四环素的如四环素的标记基因。标记基因。质粒的存在与否对宿主质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。只能在宿主细胞内成。 质粒是质粒是一种裸露的、结构简单、独一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核立于细菌染色体（即拟核DNADNA）之外，）之外，并且具有自我复制能力的双链环状并且具有自我复制能力的双链环状DNADNA分子。分子。质粒是基因工程最常用的运载体。质粒是基因工程最常
16、用的运载体。 “分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的载体：基因进入受体细胞的载体：二、基因工程概念：按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外剪切，并与特殊的运载工具进行重新组合，然后转入另一种生物的体内进行扩增，并使之表达产生所需蛋白质的技术。意义：能够打破生物种属的界限，在分子水平上定向改造生物的遗传特性。二、基因工程的操作程序目的基因的获得重组载体的构建重组载体的转化和筛选目的基因的表达和鉴定获取目的基因的方法用限制酶切用限制酶切断成许多片段断成许多片段直接分离法鸟枪法用限制酶将完整的DNA随机切成许多片段，然后用某种检测方法挑选出所需要的基因。如用“核酸探针法”，核酸探针是用放射性同
17、位素标记的DNA单链，具有非常特异的脱氧核苷酸序列，能与DNA互补链结合。人工合成法反转录法和化学合成法反转录法：mRNA单链DNA双链DNA（目的基因）化学合成法：氨基酸序列基因序列合成目的基因返回运载工具载体(质粒)用与提取目的基因相用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，使之出现一个切口，将目的基因插入切口将目的基因插入切口处，让目的基因的黏处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，性末端互补配对后，在在DNADNA连接酶的作用下连接酶的作用下连接形成连接形成重组重组DNADNA分子分子。提取质粒并用提取质粒并用提取质粒并用提
18、取质粒并用限制酶切割限制酶切割限制酶切割限制酶切割用连接酶将目的用连接酶将目的用连接酶将目的用连接酶将目的基因和质粒连接基因和质粒连接基因和质粒连接基因和质粒连接重组载体的构建目的基因与质粒的连接返回重组载体的转化和筛选转化方法：基因枪法、显微注射法和花粉管通道法。受体是动物细胞时最常用的是显微注射法，是植物细胞时常用基因枪法。筛选：利用载体上的标记基因，借助选择培养基进行筛选。将目的基因导将目的基因导将目的基因导将目的基因导入受体细胞入受体细胞入受体细胞入受体细胞有表达产物有表达产物( (导入）导入）无表达产物无表达产物（未导入）（未导入）选择培养基（载体选择培养基（载体选择培养基（载体选择
19、培养基（载体标记基因）标记基因）标记基因）标记基因）返回目的基因的表达和鉴定基因工程成功的标志：目的基因表达，进而产生相应的性状。鉴定：检测转化的生物有没有显示出目的基因控制的性状。例：用转基因棉铃饲喂棉例：用转基因棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明目的基因未表达；如状，说明目的基因未表达；如虫吃后中毒死亡，则说明目的虫吃后中毒死亡，则说明目的基因表达。基因表达。返回课本知识回顾基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，改造生物的遗传性状。基因拼接技术基因拼接技术DNA重组技术重组技术基因基因
20、修饰改造修饰改造定向地定向地DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具“分子手术刀分子手术刀” “分子缝合针分子缝合针” “分子运输车分子运输车” 限制酶限制酶DNA连接酶连接酶基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶主要是从主要是从 的一种酶。的一种酶。识别双链识别双链DNA 分子的某种分子的某种 ，并且使每一条链中并且使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的两个核苷酸之间的的 断开。断开。形成两种末端形成两种末端原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二酯键粘性末端粘性末端平末端平末端二、二、 “
21、分子缝合针分子缝合针” DNA连接酶连接酶1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体通常有三种:在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在基础上进行过的质粒质粒噬菌体衍生物噬菌体衍生物动植物病毒动植物病毒天然质粒天然质粒人工改造人工改造 1.如图所示为部分双链DNA片段，下列有关基因工程中工具酶功能的叙述错误的是()A切断a处的酶为限制性核酸内切酶B连接a处的酶为DNA连接酶C切断b处的酶为DNA解旋酶D连接b处的酶为RNA聚合酶课堂反馈D2下列有关基因工程操作
22、的叙述中，正确的是A用同种限制性核酸内切酶切割载体与目的基 因可获得相同的黏性末端B以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同C检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功D用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接A3下列一般不作为基因工程中的标记基因的是()A四环素抗性基因B绿色荧光蛋白基因C产物具有颜色反应的基因D贮藏蛋白的基因D4质粒作为“分子运输车”的条件是 ()能够自我复制双链环状DNA分子有多个限制性核酸内切酶切割位点有标记基因真核细胞中没有A BC DB5下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是()A需要限制性核酸内切酶
23、和DNA连接酶B必须在细胞内进行C抗生素抗性基因可作为标记基因D启动子位于目的基因的首端B6下面是下面是获得抗虫棉的技得抗虫棉的技术流程示意流程示意图。有关。有关叙述叙述错误的是的是( )A重重组质粒构建粒构建过程中需要限制性核酸内切程中需要限制性核酸内切酶酶和和DNA连接接酶酶B图中愈中愈伤组织分化分化产生的再生植株基因型一般都相生的再生植株基因型一般都相同同C卡那霉素抗性基因中含有相关限制性核酸内切卡那霉素抗性基因中含有相关限制性核酸内切酶酶的的识别位点位点D转基因抗虫棉有性生殖的后代不能基因抗虫棉有性生殖的后代不能稳定保持抗虫性定保持抗虫性状状D7哪项不是基因表达载体的组成部分( )A启
24、动子 B终止密码 C标记基因 D目的基因8、下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( )A基因枪法 B显微注射法C农杆菌转化法 D花粉管通道法9基因工程中常用的受体细胞不包括( )A人体细胞 B动物细胞 C植物细胞 D微生物细胞DBA1010基因工程的正确操作步基因工程的正确操作步骤是是( )( )构建基因表达构建基因表达载体体 将目的基因将目的基因导入受体入受体细胞胞检测目的基因的表达是否符合特定性状要求目的基因的表达是否符合特定性状要求取目的基因取目的基因A A B B C C D DC11人体受病毒刺激后，可以产生干扰素，干扰素分为三类，1980年，生物学家成功破译了干扰素的全部遗传信
25、息，并运用插入质粒的方法，用大肠杆菌生产得到干扰素可以用于治疗肝炎和肿瘤，回答下列问题：(1)上述材料中涉及的现代生物技术有(2)在利用大肠杆菌生产干扰过程中，目的基因是_，所用载体是。表达载体的结构组成包括、。(3)目的基因在大肠杆菌中表达时，必须经过_-和过程。基因工程合成干扰素的基因质粒目的基因启动子终止子标记基因转录翻译12、下、下图为DNA分子的切割和分子的切割和连接接过程。程。(1)EcoRI是一种酶，其识别序列是，切割位点是与之间的键。切割结果产生的DNA片段末端形式为(2)不同来源DNA片段结合，在这里需要的酶应是连接酶，此酶的作用是在与之间形成键，而起“缝合”作用的。还有一种连接平末端的连接酶是。限制性核酸内切GAATTC鸟嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸磷酸二酯黏性末端EcoliDNA鸟嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸磷酸二酯T4DNA连接酶谢谢！再见
