-皮肤储存新技术及临床应用

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1、皮肤储存新技术皮肤储存新技术及临床应用及临床应用 贾晓明 教授 解放军总医院第一附属医院 解放军总医院烧伤整形医院前前 言言 据据统统计计，目目前前据据统统计计，目目前前世世界界每每年年大大约约有有世世界界每每年年大大约约有有1 10 00 01 10 00 0万万人人因因各各种种原原因因而而烧烧万万人人因因各各种种原原因因而而烧烧（烫烫）伤伤。尤尤其其大大面面（烫烫）伤伤。尤尤其其大大面面积积深深度度烧烧伤伤病病人人，治治积积深深度度烧烧伤伤病病人人，治治疗疗是是一一个个漫漫长长而而复复杂杂疗疗是是一一个个漫漫长长而而复复杂杂的的过过程程。通通常常需需要要通通的的过过程程。通通常常需需要要通

2、通过过异异体体（种种）皮皮片片移移过过异异体体（种种）皮皮片片移移植植来来覆覆盖盖创创面面，而而皮皮植植来来覆覆盖盖创创面面，而而皮皮源源的的缺缺乏乏往往往往成成为为治治源源的的缺缺乏乏往往往往成成为为治治疗疗的的关关键键问问题题之之一一疗疗的的关关键键问问题题之之一一皮库的意义皮库的意义 5 54 45 54 4年年 前前 英英 国国 人人年年 前前 英英 国国 人人P Pi ic ck ke er ri il ll lP Pi ic ck ke er ri il ll l写写下下了了这这样样一一写写下下了了这这样样一一段段话话段段话话：“毫毫无无争争议议，毫毫无无争争议议，创创伤伤整整复复

3、手手术术成成功功的的创创伤伤整整复复手手术术成成功功的的关关键键之之一一是是有有可可供供给给关关键键之之一一是是有有可可供供给给的的皮皮源源覆覆盖盖因因创创伤伤带带的的皮皮源源覆覆盖盖因因创创伤伤带带来来的的大大面面积积皮皮肤肤缺缺来来的的大大面面积积皮皮肤肤缺缺损损。实实际际上上在在某某种种情情损损。实实际际上上在在某某种种情情况况下下，对对皮皮源源需需要要超超况况下下，对对皮皮源源需需要要超超越越一一切切。因因此此这这启启示示越越一一切切。因因此此这这启启示示我我们们应应该该注注重重皮皮肤肤的的我我们们应应该该注注重重皮皮肤肤的的储储存存与与临临床床应应用用。储储存存与与临临床床应应用用。

4、”我院皮库简介：我院皮库简介：自自19731973年创建皮库以来，分别运用年创建皮库以来，分别运用了了44、-20-20和和-80-80低温冰箱皮肤低温冰箱皮肤保存法以及液氮储皮方法保存法以及液氮储皮方法19871987年开始速冻玻璃化储皮方法储年开始速冻玻璃化储皮方法储存的实验研究和临床应用存的实验研究和临床应用 我院皮库简介：我院皮库简介：每年异体尸体皮采集及储存每年异体尸体皮采集及储存4040余具余具深低温速冻异体皮保存方法的改进使保存深低温速冻异体皮保存方法的改进使保存皮片活力稳定保持在皮片活力稳定保持在70%70%以上，皮片移植以上，皮片移植成活率达成活率达95%95%以上以上成为亚

5、洲最大的皮库之一，成为亚洲最大的皮库之一，已储存了已储存了30003000余具活力良好的尸体皮，供全国余具活力良好的尸体皮，供全国3030个省市个省市300300多家医院使用多家医院使用每年创利润数百万元，经济效益显著每年创利润数百万元，经济效益显著我院皮库简介：我院皮库简介：科研方面曾获国家自然科学基金，首科研方面曾获国家自然科学基金，首都医学科技发展基金，八五、九五、都医学科技发展基金，八五、九五、十五、十一五全军科研基金十五、十一五全军科研基金2020余项；余项；出版相关专著出版相关专著1010余部，发表学术论著余部，发表学术论著100100余篇；培养进修生、研究生数百余篇；培养进修生、

6、研究生数百人人获国家科技进步二等奖获国家科技进步二等奖1 1项，军队科项，军队科技进步二等奖技进步二等奖6 6项项第一部分 皮肤的低温储存 皮肤储存的基础知识皮肤的结构皮肤的结构皮肤的功能皮肤的功能皮肤低温储存的重要意义皮肤低温储存的重要意义皮肤低温储存的理论依据皮肤低温储存的理论依据皮肤的低温损伤机制皮肤的低温损伤机制 皮肤的结构 皮肤从外到内，由表皮肤从外到内，由表皮、真皮和皮下组织皮、真皮和皮下组织三部分组成三部分组成皮肤附件作为特化的皮肤附件作为特化的表皮结构也属于皮肤表皮结构也属于皮肤的重要结构，其中包的重要结构，其中包括汗腺、皮脂腺、毛括汗腺、皮脂腺、毛发、指甲发、指甲皮肤的结构

7、表皮表皮 从上到下又从上到下又分为分为 角质层、透明层、角质层、透明层、颗粒层、棘层、基底颗粒层、棘层、基底层层 真皮真皮 分为乳头层、分为乳头层、网状层。主要有结缔网状层。主要有结缔组织构成，包括胶原组织构成，包括胶原纤维、弹力纤维、网纤维、弹力纤维、网状纤维。此外皮肤附状纤维。此外皮肤附件，血管、淋巴管、件，血管、淋巴管、神经末梢神经末梢皮肤的主要功能：皮肤的主要功能：保护作用保护作用感觉作用感觉作用体温调节作用体温调节作用分泌和排泄作用分泌和排泄作用吸收作用吸收作用水分水分 电解质电解质皮肤缺失皮肤缺失热量热量 蛋白质蛋白质病原体病原体 贫血贫血 低蛋白血症低蛋白血症 创面脓毒症创面脓毒

8、症MODS死亡死亡大面积烧伤病人创面焦痂的存在引起： 体液的丢失体液的丢失 有害介质释放有害介质释放侵袭性感染的滋生地侵袭性感染的滋生地机体超高代谢机体超高代谢多器官功能衰竭及并发症多器官功能衰竭及并发症皮肤储存的必要性：当大面积烧伤或皮肤缺损超过体表面当大面积烧伤或皮肤缺损超过体表面积的积的30%30%时，自体供皮受限时，自体供皮受限临床实践证明：具有活力的异体皮仍临床实践证明：具有活力的异体皮仍是目前最为理想的创面覆盖物是目前最为理想的创面覆盖物 异体皮来源时间受限异体皮来源时间受限皮片的来源及种类自体皮自体皮 烧伤治疗中最为常用的皮片，其来源受烧伤治疗中最为常用的皮片，其来源受烧伤治疗中

9、最为常用的皮片，其来源受烧伤治疗中最为常用的皮片，其来源受 到供皮区的限制到供皮区的限制到供皮区的限制到供皮区的限制异种皮异种皮 以猪皮多见。取材方便，但移植后排斥以猪皮多见。取材方便，但移植后排斥 时间短，有时难以达到覆盖创面的目的时间短，有时难以达到覆盖创面的目的同种异体皮同种异体皮 主要来源于成人新鲜尸体，其次为新主要来源于成人新鲜尸体，其次为新 鲜死婴皮鲜死婴皮 皮肤的低温储存 低温储存理论依据 理理论论上上，储储存存温温度度越越低低，储储存存物物活活力力保保持持的的时时间间越越长长，细细胞胞组组织织代代谢越低，污染的细菌也不易繁殖谢越低，污染的细菌也不易繁殖表表皮肤储存方法比较项目项

10、目 4 -20 -80 -196 4 -20 -80 -196 费用费用 少少 少少 较贵较贵 贵贵（补液氮）（补液氮） 保存时间保存时间(d) 3-7 45 12(d) 3-7 45 12个月个月 理论无限期理论无限期 最佳活力最佳活力(%) 30-80 50-60 (%) 30-80 50-60 50-6050-60 7070低温损伤机制：低温损伤机制： 低温保存关键在于解决低温损伤对生物组低温保存关键在于解决低温损伤对生物组织的影响。经典的低温生物学认为在低温条件织的影响。经典的低温生物学认为在低温条件下，细胞主要受到来自两种因素的损伤即下，细胞主要受到来自两种因素的损伤即溶质溶质性损伤

11、性损伤和和胞内冰损伤胞内冰损伤，即，即“两因素两因素”学说学说“两因素”学说胞内冰晶损伤胞内冰晶损伤 胞内生成冰晶，长大到一定程度，引起细胞壁及细胞胞内生成冰晶，长大到一定程度，引起细胞壁及细胞胞内生成冰晶，长大到一定程度，引起细胞壁及细胞胞内生成冰晶，长大到一定程度，引起细胞壁及细胞内超微结构的变化，甚至导致细胞死亡，是降温速率内超微结构的变化，甚至导致细胞死亡，是降温速率内超微结构的变化，甚至导致细胞死亡，是降温速率内超微结构的变化，甚至导致细胞死亡，是降温速率较快时引起损伤的主要原因较快时引起损伤的主要原因较快时引起损伤的主要原因较快时引起损伤的主要原因溶质性损伤（高渗性损伤溶质性损伤（

12、高渗性损伤） 细胞外水分结冰，导致细胞内外溶液浓度的升高并持细胞外水分结冰，导致细胞内外溶液浓度的升高并持细胞外水分结冰，导致细胞内外溶液浓度的升高并持细胞外水分结冰，导致细胞内外溶液浓度的升高并持续较长的时间。由高渗引起细胞的损伤，是降温速率续较长的时间。由高渗引起细胞的损伤，是降温速率续较长的时间。由高渗引起细胞的损伤，是降温速率续较长的时间。由高渗引起细胞的损伤，是降温速率较慢时引起损伤的主要原因较慢时引起损伤的主要原因较慢时引起损伤的主要原因较慢时引起损伤的主要原因“两因素”学说皮肤结构与储存的关系皮肤结构与储存的关系 皮肤不是单细胞成分，而是由表皮和皮肤不是单细胞成分，而是由表皮和真

13、皮构成的复合组织，由于皮肤内的各种真皮构成的复合组织，由于皮肤内的各种主要细胞成分的结构与功能的复杂性，各主要细胞成分的结构与功能的复杂性，各种细胞代谢与营养条件不同种细胞代谢与营养条件不同, ,对环境改变的对环境改变的适应性亦有所不同。因此皮肤的低温损伤适应性亦有所不同。因此皮肤的低温损伤是一个更为非常复杂的过程是一个更为非常复杂的过程皮肤低温损伤的其他因素皮肤低温损伤的其他因素 近年来的研究发现，表皮细胞低温损近年来的研究发现，表皮细胞低温损伤还与细胞骨架、细胞连接桥粒以及细胞伤还与细胞骨架、细胞连接桥粒以及细胞间黏附的关系密切间黏附的关系密切低温损伤的干预：玻璃化储皮方法的发展玻璃化储皮

14、方法的发展抗冻液的使用抗冻液的使用玻璃化的基础知识 玻璃化的概念玻璃化的概念 玻璃化是一个物理学的概念，玻璃化是一个物理学的概念，是指当水或溶液在极快降温到或低是指当水或溶液在极快降温到或低于于-100-100-110-110的温度范围时，形的温度范围时，形成一种具有高黏度的界于液态和固成一种具有高黏度的界于液态和固态之间、非晶体态的、杂乱无章的、态之间、非晶体态的、杂乱无章的、透明的玻璃状态透明的玻璃状态 玻璃化储存的特点：玻璃化储存的特点： 玻玻璃璃化化储储存存生生物物组组织织和和细细胞胞，由由于于降降温温速速率率很很快快，水水分分没没有有足足够够的的时时间间来来形形成成冰冰晶晶，即即进进

15、入入均均匀匀的的玻玻璃璃状状态态。这这种种玻玻璃璃态态的的物物理理性性能能与与晶晶体体态态不不同同，是是一一种种既既可可以以避避免免或或减减轻轻冷冷冻冻过过程程组组织织的的损损伤伤，又又是是同时可长期保存组织的良好方法同时可长期保存组织的良好方法两种方法的比较两种方法的比较慢降温速率冰晶形态慢降温速率冰晶形态玻璃化速冻时冰晶的形态玻璃化速冻时冰晶的形态皮肤的玻璃化储存 皮皮肤肤在在196196的的深深低低温温环环境境中中，其其组组织织和和细细胞胞内内各各种种酶酶的的活活力力及及代代谢谢很很低低甚甚至至近近乎乎零零，即即所所谓谓的的“生生命命悬悬持持状状态态 ”。在在此此温温度度下下保保存存的的

16、皮肤理论上可无限期储存皮肤理论上可无限期储存玻璃化的理想条件理论上说，体积很小的理论上说，体积很小的1 1微微升纯水要用升纯水要用10106 6-10-107 7/s/s降温速率降温速率才能形成玻璃态才能形成玻璃态皮肤玻璃化储存的途径皮肤玻璃化储存的途径以水为主要成分的生物组织以水为主要成分的生物组织, ,实现完全玻璃化需要极高的降温实现完全玻璃化需要极高的降温速率。目前只能采用各种方法实速率。目前只能采用各种方法实现部分玻璃化，抑制冰晶形成和现部分玻璃化，抑制冰晶形成和长大，避免细胞严重损伤长大，避免细胞严重损伤皮肤玻璃化储存的途径皮肤玻璃化储存的途径冷源问题冷源问题 目前国内各家目前国内各

17、家皮库主要采用液氮皮库主要采用液氮作为冷源，温度可作为冷源，温度可达达-196-196，皮片直，皮片直接放入液氮后，其接放入液氮后，其最快的降温速率可最快的降温速率可达达2160/min2160/min皮肤玻璃化储存的途径皮肤玻璃化储存的途径储存的皮肤往往因储存的皮肤往往因具有一定的厚度和具有一定的厚度和面积带来冷源温度面积带来冷源温度传导困难和储存不传导困难和储存不便便 ，因此可设计成，因此可设计成皮卷形式皮卷形式皮肤玻璃化储存的途径皮肤玻璃化储存的途径降温速率降温速率 冷却的铜板预冷冷却的铜板预冷皮肤后即将其直接皮肤后即将其直接浸入液氮浸入液氮 预冷铜板示意图预冷铜板示意图抗 冻 剂 的

18、应 用抗冻液的作用及机制： 深低温储存组织离不开抗冻液的保护，否深低温储存组织离不开抗冻液的保护，否 则皮肤将受到严重的损伤则皮肤将受到严重的损伤 抗冻剂的作用机制有以下两点：抗冻剂的作用机制有以下两点：有效抑制过冷水的不规则形态及促有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶，促进玻璃化行程进快速结晶，促进玻璃化行程缓冲因冰形成而造成的渗透压升高，缓冲因冰形成而造成的渗透压升高，减轻溶质损害减轻溶质损害目前较为成熟抗冻液配方目前较为成熟抗冻液配方 H H液液（20%20%二甲基亚砜、二甲基亚砜、6%6%丙丙二醇二醇），以此作为玻璃化储存皮），以此作为玻璃化储存皮肤的抗冻液肤的抗冻液 一般一般10

19、000cm10000cm2 2面积的皮肤约需面积的皮肤约需抗冻液抗冻液3000ml3000ml3030分钟分钟分钟分钟6 6 6 6小时内皮片小时内皮片小时内皮片小时内皮片新洁新洁新洁新洁尔灭尔灭尔灭尔灭生理生理生理生理盐水盐水盐水盐水H H抗抗抗抗冻液冻液冻液冻液玻璃化储皮及使用步骤玻璃化储皮及使用步骤临床使用液氮复温复温404015153030 皮卷皮卷生理生理生理生理盐水盐水盐水盐水生理生理生理生理盐水盐水盐水盐水总结：总结：玻璃化储存皮肤的步骤玻璃化储存皮肤的步骤异体皮的采集异体皮的采集消毒消毒皮肤的修整皮肤的修整抗冻液的处理抗冻液的处理包装包装快速降温快速降温液氮容器的管理液氮容器的

20、管理细胞膜的影响细胞膜的影响 降低细胞的流动性降低细胞的流动性细胞骨架受损细胞骨架受损表皮细胞黏附率降低表皮细胞黏附率降低基底膜的破坏基底膜的破坏玻璃化对皮肤结构和功能的影响玻璃化对皮肤抗原性影响皮肤经低温储存后，异体皮的存活时间较皮肤经低温储存后，异体皮的存活时间较新鲜异体皮长新鲜异体皮长低温储存后皮片抗原性降低，可能与皮肤低温储存后皮片抗原性降低，可能与皮肤内朗格汉斯细胞（内朗格汉斯细胞（LSLS）数量降低有关）数量降低有关保存温度越低，抗原性越弱，移植后存活保存温度越低，抗原性越弱，移植后存活时间越长时间越长低温对朗格汉斯细胞的影响低温对朗格汉斯细胞的影响 新鲜豚鼠皮朗格汉斯细胞新鲜豚鼠

21、皮朗格汉斯细胞数量较多、呈树突状轮廓数量较多、呈树突状轮廓 -196 -196豚鼠皮豚鼠皮朗格汉斯细胞数朗格汉斯细胞数量明显减少、树突变短量明显减少、树突变短异体皮匀浆免疫扩散电泳图异体皮匀浆免疫扩散电泳图 右侧为新鲜皮匀浆与抗体形成的沉淀右侧为新鲜皮匀浆与抗体形成的沉淀环环; ;左侧为液氮储存左侧为液氮储存48h48h后与抗体形成的后与抗体形成的沉淀环，面积明显缩小沉淀环，面积明显缩小异体皮匀浆免疫火箭电泳图异体皮匀浆免疫火箭电泳图上图为新鲜皮匀浆电泳结果上图为新鲜皮匀浆电泳结果下图为液氮储存下图为液氮储存48h48h后皮片匀浆电泳结果后皮片匀浆电泳结果皮肤活力的鉴定常用的常用的皮肤活力的鉴

22、定皮肤活力的鉴定方法方法皮肤氧耗量测定法皮肤氧耗量测定法琥珀酸钠脱氢酶测定法琥珀酸钠脱氢酶测定法四氮唑盐四氮唑盐WST-1WST-1法法SYTO/EBSYTO/EB双重染色法双重染色法皮肤氧耗量测定法皮肤氧耗量测定法 原理：原理：有活力的组织均有代谢耗氧有活力的组织均有代谢耗氧 恒温营养液内微电极（铂、银电极）与有活恒温营养液内微电极（铂、银电极）与有活力的皮肤接触，表面氧分压下降，通过放大力的皮肤接触，表面氧分压下降，通过放大器测下降程度，推算出皮肤的活力，操作可器测下降程度，推算出皮肤的活力，操作可在在1h1h内完成内完成我院自行设计的测氧仪外观我院自行设计的测氧仪外观琥珀酸脱氢酶测定法l

23、测定原理琥珀酸钠+红四氮唑 延胡索酸+甲琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶HH+ +月 替琥珀酸脱氢酶测定法示意图 皮片皮片皮片皮片氮气氮气氮气氮气琥珀酸钠+红四氮唑3737水浴水浴水浴水浴1h1h1h1h乙二醇乙醚乙二醇乙醚皮片皮片皮片皮片ODOD490um490um/mg/mg（活力单位）（活力单位）（活力单位）（活力单位）四氮唑盐WST-1法 原理:利用活组织或细胞中的线粒体琥珀酸四氮 唑反应体系(RS) ,作用在亚细胞呼吸链反 应中的还原型辅酶 (NADH)、NAD +(辅 酶) 脱氢反应与细胞组织中的呼吸链 EC(电子偶联反应体系) 结合,将H 结合到 WST-1 的甲氮唑苯环上,打开其四氮唑

24、苯 环而显色四氮唑盐WST-1法琥珀酸四氮唑琥珀酸四氮唑反应体系反应体系(RS)琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶HH+呼吸链呼吸链呼吸链呼吸链WST-1显色反应显色反应SYTO/EBSYTO/EB双重染色法双重染色法为一种敏感、快速的皮肤活力检测法为一种敏感、快速的皮肤活力检测法, ,采用采用新型穿透性核酸染色剂新型穿透性核酸染色剂SYTOSYTO和和EBEB方方 法法 ：皮皮 片片 经经P PB BS S洗洗 涤涤 后后 加加 入入S SY YT TOO 5 50 0u ul l, ,3 37 7避避光光孵孵育育3 30 0， P PB BS S洗洗涤涤加加入入5 50 0u

25、 ul lE EB B, ,水水浴浴避避光光孵孵育育3 30 0 后后P PB BS S洗洗涤涤。通通过过4 48 88 8/ /5 52 20 0n nmm激激发发，在在荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察玻璃化对皮肤活力的影响玻璃化对皮肤活力的影响 通过对氧耗量及琥珀酸脱氢酶通过对氧耗量及琥珀酸脱氢酶活力的测定发现玻璃化储存的皮肤活力的测定发现玻璃化储存的皮肤活力较慢冻法提高了将近活力较慢冻法提高了将近20%20%速冻玻璃化储皮的优点及效果：该法可以永久保存皮肤，储存后冷冻皮片的平均活力指标可达到新鲜皮片的70 %，较以往的慢速冷冻法提高活力近20 %采用该法保存的皮肤临床具有质地柔软、植皮后

26、转红快、成活率高（95%左右）、存活期长等优点第二部分临床实际应用冷冻异体皮的适用范围冷冻异体皮的适用范围开放性创面、深度烧伤创面和切痂创面的暂时性覆盖用于邮票、网状或自体微粒皮的覆盖移植，保证下方自体微粒皮成活用于自体皮源紧张的烧伤后期整形重建手术，作为自体微粒皮的支架用于暂不适合自体皮的创面覆盖以改善创基情况 异体皮覆盖创面的意义异体皮覆盖创面的意义防止创面干燥，减少水分及热量丧失防止创面干燥，减少水分及热量丧失 防止电解质、蛋白质及血细胞丢失防止电解质、蛋白质及血细胞丢失减少创面污染，减轻患者疼痛减少创面污染，减轻患者疼痛有利于关节部位早日活动有利于关节部位早日活动保护暴露的组织，促进肉

27、芽成熟、创面愈合，保护暴露的组织，促进肉芽成熟、创面愈合，具有抗感染能力具有抗感染能力低温储存后抗原性降低，创面覆盖时间延长低温储存后抗原性降低，创面覆盖时间延长应用方法 大张异体皮嵌植小块自体皮大张异体皮嵌植小块自体皮 大张异体皮自体微粒皮移植大张异体皮自体微粒皮移植目前临床应用较多的是第二种方法大张异体皮+微粒皮制备方法 第一步第一步复 温大张异体皮+微粒皮制备方法 第二步第二步微粒皮的制备大张异体皮+微粒皮制备方法 第三步第三步 漂 皮创 面 处 理 前 切 削 痂 后 创 面大张异体皮覆盖创面 微粒皮植皮注意事项植皮面积与微粒皮比例植皮面积与微粒皮比例 自体微粒皮与异体皮的比例为自体微

28、粒皮与异体皮的比例为1:101:101:151:15较好较好. .自自 体皮源极度缺乏时甚至可达体皮源极度缺乏时甚至可达1:201:20微粒皮正反面问题微粒皮正反面问题微粒皮均匀分散微粒皮均匀分散临床变化临床变化异体皮发黑变干脱落创面愈合异体皮发黑变干脱落创面愈合异体皮发黑变干脱落创面愈合异体皮发黑变干脱落创面愈合 移植皮片移植皮片移植皮片移植皮片3-43-43-43-4天转红，天转红，天转红，天转红，1-21-21-21-2周异体皮色泽近似正周异体皮色泽近似正周异体皮色泽近似正周异体皮色泽近似正常皮肤，此后呈斑点状或斑片状发黑区即为成活常皮肤，此后呈斑点状或斑片状发黑区即为成活常皮肤，此后呈

29、斑点状或斑片状发黑区即为成活常皮肤，此后呈斑点状或斑片状发黑区即为成活的自体微粒皮。的自体微粒皮。的自体微粒皮。的自体微粒皮。4-64-64-64-6周异体皮坏死成干痂，但仍附周异体皮坏死成干痂，但仍附周异体皮坏死成干痂，但仍附周异体皮坏死成干痂，但仍附着牢固，此时微粒皮融合成片，以后异体皮完全着牢固，此时微粒皮融合成片，以后异体皮完全着牢固，此时微粒皮融合成片，以后异体皮完全着牢固，此时微粒皮融合成片，以后异体皮完全变干脱落，创面修复完成。变干脱落，创面修复完成。变干脱落，创面修复完成。变干脱落，创面修复完成。未见异体皮发黑，变干，脱落而创面愈合未见异体皮发黑，变干，脱落而创面愈合未见异体皮

30、发黑，变干，脱落而创面愈合未见异体皮发黑，变干，脱落而创面愈合临床病例创面创面临 床 病 例术中削痂后术中削痂后覆盖异体皮覆盖异体皮临 床 病 例术后术后4w4w异体皮排斥异体皮排斥术后术后45d45d创面基本愈合创面基本愈合皮肤低温储存的基础研究进展皮肤低温储存的基础研究进展 皮肤细胞外基质（纤维连接蛋白、层粘连皮肤细胞外基质（纤维连接蛋白、层粘连蛋白等）、骨架蛋白（微丝、微管、中间蛋白等）、骨架蛋白（微丝、微管、中间丝）以及细胞间连接桥粒结构可能是低温丝）以及细胞间连接桥粒结构可能是低温损伤的关键位点损伤的关键位点 新型抗冻剂新型抗冻剂 海藻糖的发现，可进一步优海藻糖的发现，可进一步优化低

31、温抗冻液配方化低温抗冻液配方细胞微环境略图细胞微环境略图黏附连接黏附连接缝隙连接缝隙连接紧密连接紧密连接桥粒桥粒各种细胞连接示意图各种细胞连接示意图海藻糖分子结构示意图FNFN免疫组化染色结果免疫组化染色结果 新鲜皮肤新鲜皮肤FN免疫组化染色免疫组化染色 360-196储存皮肤储存皮肤FN免疫组化染色免疫组化染色 360-80储存皮肤储存皮肤FN免疫组化染色免疫组化染色 3604储存皮肤储存皮肤FN免疫组化染色免疫组化染色 360 LNLN免疫组化染色结果免疫组化染色结果 新鲜皮肤新鲜皮肤LN免疫组化染色免疫组化染色 360-196储存皮肤储存皮肤LN免疫组化染色免疫组化染色 3604储存皮肤

32、储存皮肤LN免疫组化染色免疫组化染色 360 -80储存皮肤储存皮肤LN免疫组化染色免疫组化染色 360表表2 2 低温储存对皮肤表皮低温储存对皮肤表皮FNFN和和LNLN含量的影响含量的影响（平均积分光密度，（平均积分光密度， X XSDSD，n=10n=10）标本标本组别组别FNLN新鲜皮肤新鲜皮肤144.143.6156.540.7 -196组组121.338.4127.837.3 -80组组68.917.9*85.916.4* -20组组31.48.7*54.89.3* 4组组22.84.6*22.47.6* 与新鲜皮片组相比，P0.01P0.01E-cadherin免疫组化染色结果免

33、疫组化染色结果 新鲜皮肤新鲜皮肤E-cadherin免疫组化染色免疫组化染色 3604储存皮肤储存皮肤E-cadherin免疫组化染色免疫组化染色 360-80储存储存E-cadherin免疫组化染色免疫组化染色 360-196储存皮肤储存皮肤E-cadherin免疫组化染色免疫组化染色360-catenin-catenin免疫组化染色结果免疫组化染色结果 新鲜皮肤新鲜皮肤-catenin免疫组化染色免疫组化染色 360-196储存皮肤储存皮肤-catenin免疫组化染色免疫组化染色 360 -80储存皮肤储存皮肤-catenin免疫组化染色免疫组化染色 360 4储存皮肤储存皮肤-caten

34、in免疫组化染色免疫组化染色 360 表表3 3 低温储存对皮肤表皮低温储存对皮肤表皮E-cadherinE-cadherin和和-catenin-catenin含量的影响含量的影响 （平均积分光密度（平均积分光密度, ,X XSDSD，n=10n=10）* 与新鲜皮片组相比，与新鲜皮片组相比，P0.01P0.01标本标本组别组别E-cadherin-catenin新鲜皮肤76.618.5100.223.9-196组61.823.487.817.3-80组 23.911.4 * 65.918.4 *-20组24.48.7 *34.89.3 *4组18.85.6 *22.47.6 * 新鲜皮肤表

35、皮层细胞结构清晰，排列正常，胞核圆形或椭圆形，196皮肤结构基本正常，有少量胞质水肿，淡染，胞核缩小。 (HE(HE400)400) 低温冷冻对皮肤组织低温冷冻对皮肤组织-肌动蛋白表达的影响肌动蛋白表达的影响新鲜组新鲜组196组组 新鲜皮肤组织-actin主要分布于细胞质，颜色均匀分布,阳性反应强，196组阳性反应减弱，但结构清晰，胞质染色基本呈红色 。(SP(SP200)200) 新鲜组新鲜组196组组低温冷冻对皮肤组织低温冷冻对皮肤组织-肌动蛋白表达的影响肌动蛋白表达的影响透射电镜下观察低温冷冻对皮肤组织微丝的影响透射电镜下观察低温冷冻对皮肤组织微丝的影响 新鲜组较粗,束状广泛均匀分布。-

36、80组大片束状结构解聚，空隙增大，见断裂和分叉；4组分布不均，细丝样物质明显减少，结构松散，粗细不等。 -196组分布较广泛，呈束状(20K，电镜） 新鲜组新鲜组 -80 4 -196 新鲜皮肤颜色均匀，阳性反应强，T/D组近似，但有少量细胞质水肿，胞核缩小。D/P组呈淡黄色，DMEM组呈阴性反应。 （SP200，光镜） T/DD/PDMEM新鲜组新鲜组海藻糖对低温保存皮肤后海藻糖对低温保存皮肤后-肌动蛋白的实验研究肌动蛋白的实验研究透射电镜下观察透射电镜下观察CPACPA对低温保存皮肤后微丝的影响对低温保存皮肤后微丝的影响 新鲜组束状广泛分布于细胞质中，T/D组少量断裂和分叉，束状密集分布。

37、D/K组呈簇状不均匀分布，空隙增大，解聚断裂；DMEM组大部分已解聚断裂，无明显束状结构。 （25K，电镜） 新鲜新鲜T/DD/KDMEM皮肤皮肤11整合素及相关蛋白整合素及相关蛋白免疫组化染色结果免疫组化染色结果 基质蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白关系模型lamininlaminin整合素是一类位于细胞表面黏附分子，属跨膜糖蛋白胞外区与基质蛋白相连，胞内区与细胞骨架相连，介导细胞内外双向信息传递1整合素位于皮肤基底细胞表面，维系表皮、真皮之间的连接，对维持细胞膜完整性及功能起着重要的作用整合素（整合素（Integrin）示意图）示意图新鲜组新鲜组196组组-20组组4组组低温冷冻对皮肤组织低

38、温冷冻对皮肤组织11整合素整合素表达的影响表达的影响新鲜正常皮肤组织1integrin分布基底细胞细胞膜或胞浆低温冷冻对皮肤层粘连蛋白低温冷冻对皮肤层粘连蛋白laminin表达的影响表达的影响新鲜正常皮肤组织laminin表达在真皮和表皮连接处新鲜组新鲜组196组组20组组4组组低温冷冻对皮肤层低温冷冻对皮肤层踝蛋白踝蛋白talin表达的影响表达的影响新鲜正常皮肤组织talin分布于基底细胞分布于基底细胞新鲜组新鲜组196组组20组组4组组低温冷冻对皮肤低温冷冻对皮肤-辅肌动蛋白表达的影响辅肌动蛋白表达的影响各温度组皮肤组织-actinin表达表达新鲜组新鲜组196196组组44组组8080组

39、组低温储存对皮肤表皮低温储存对皮肤表皮1integrin、 laminin、 talin含量的影响含量的影响 （平均积分光密度（平均积分光密度, ,X XSDSD，n=10n=10）与新鲜组皮肤组织比较，与新鲜组皮肤组织比较，P0.05, *P0.01标本标本组别组别1integrinlaminin talin新鲜皮肤0.2560.016 0.2650.016 0.2160.012 -196组0.2450.0210.2470.025 0.1940.013* -80组0.2320.0120.2380.020 0.1790.009* -20组0.1650.015* 0.1760.013* 0.16

40、30.010*4组0.1350.011* 0.1470.015* 0.1520.017* 低温储存对皮肤组织基底膜影响新鲜组新鲜组196组组4组组新鲜皮肤基底膜完整、密度正常，连续性好，半桥粒结构清晰可见，分布均匀； -196组中基底膜结构基本与新鲜组相似； 4组基底膜变薄，出现断裂，结构模糊不清，半桥粒明显减少海藻糖对低温保存皮肤海藻糖对低温保存皮肤11整合素的实验研究整合素的实验研究T/D-7d组组D/P -7d组组T/D-14d组组D /P -14d组组14天时两组染色程度均降低，天时两组染色程度均降低，D /P 组染色强度降低较明显组染色强度降低较明显两种低温保护剂对皮肤组织两种低温保

41、护剂对皮肤组织1integrin表达变化影响表达变化影响 （平均积分光密度（平均积分光密度, ,X XSDSD，n n=6=6）与新鲜组皮肤比较，与新鲜组皮肤比较，* *P0.05, *P0.01P0.05, *P0.01，T/DT/D、D/PD/P组间比较，组间比较，P0.05,P0.01P0.05,P0.01 组别组别 7 天天 14天天新鲜组T/D组 D/P组 0.2960.019 0.2960.019 0.2870.015 0.2790.010 0.2840.014 0.2490.018* 桥粒透射电镜下观察透射电镜下观察CPACPA对低温保存皮肤基底膜的影响对低温保存皮肤基底膜的影响

42、T/D-7d组组D /P -7d组组T/D-14d组组D /P -14d组组2周时间，周时间，D/P组基底膜部分区域结构稍有松散，模糊不清，半桥粒数量有组基底膜部分区域结构稍有松散，模糊不清，半桥粒数量有所下降，所下降，T/D组基底膜较完整，厚度大致均匀，半桥粒未见明显渐少，组基底膜较完整，厚度大致均匀，半桥粒未见明显渐少，桥粒芯糖蛋白桥粒芯糖蛋白1 1、2 2免疫组化染色结果免疫组化染色结果 锚锚着着在在桥桥粒粒斑斑上上的的细细胞胞骨架细丝骨架细丝胞质桥粒斑蛋白胞质桥粒斑蛋白细胞间空隙细胞间空隙桥粒芯蛋白桥粒芯蛋白相邻细胞膜相邻细胞膜桥粒结构示意图 新鲜皮肤组织桥粒芯糖蛋白1主要分布于颗粒细

43、胞层，20组，4组阳性反应明显减弱。(SP(SP400)400) 低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白1 1表达的影响表达的影响-20-20新鲜组新鲜组-196-19644 新鲜皮肤组织桥粒芯糖蛋白2主要分布于基底细胞层，20组，4组阳性反应明显减弱。(SP(SP400)400) 低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白2 2表达的影响表达的影响新鲜组新鲜组-196-19644-20-20表表3 3 低温储存对皮肤表皮低温储存对皮肤表皮Dsg1Dsg1和和Dsg2Dsg2含量的影响含量的影响 （平均积分光密度（平均积分光密度, ,X XSDSD，n=

44、10n=10）* 与新鲜皮片组相比，与新鲜皮片组相比，P0.05P0.05标本标本组别组别Dsg1Dsg1Dsg2Dsg2新鲜皮肤0.2870.0080.2540.007-196组0.2830.0050.2470.006-80组0.2720.007 *0.2390.007 *-20组0.2350.018 *0.1640.008 *4组0.2030.012 *0.1150.021 *l 新鲜皮肤桥粒结构清晰、新鲜皮肤桥粒结构清晰、 完整、数量较多完整、数量较多 l -196 -196组中桥粒结构、数组中桥粒结构、数 量基本与新鲜组相似量基本与新鲜组相似l 44组桥粒出现断裂，结构模组桥粒出现断裂

45、，结构模 糊不清，数量明显减少糊不清，数量明显减少新鲜组-196-19644桥粒桥粒桥粒透射电镜下观察低温冷冻对皮肤组织桥粒的影响透射电镜下观察低温冷冻对皮肤组织桥粒的影响海藻糖对低温保存皮肤桥粒芯糖蛋白海藻糖对低温保存皮肤桥粒芯糖蛋白1 1的实验研究的实验研究D/P -21d组组T/D-21d组组T/D-7d组组D/P -7d组组表表3 3两种低温保护剂对皮肤组织两种低温保护剂对皮肤组织Dsg1Dsg1表达变化影响表达变化影响 （平均积分光密度（平均积分光密度, ,X XSDSD，n n=6=6）与新鲜组皮肤比较，与新鲜组皮肤比较，* *P0.05, *P0.01P0.05, *P0.01，

46、T/DT/D、D/PD/P组间比较，组间比较，P0.05,P0.01P0.05,P0.01 组别组别 7 天天 21天天新鲜组T/D组 D/P组 0.2870.008 0.2870.008 0.2850.006 0.2840.0040.2820.004 0.2750.005*T/D-7d组组D /P-7d组组桥粒桥粒透射电镜下观察透射电镜下观察CPACPA对低温保存皮肤桥粒的影响对低温保存皮肤桥粒的影响桥粒D /P -21d组组T/D-21d组组桥粒皮肤替代物的研究表皮替代物表皮替代物 表皮细胞膜片的培养表皮细胞膜片的培养真皮替代物真皮替代物 脱细胞异体真皮脱细胞异体真皮 、人、人 工聚合材料工聚合材料复合皮复合皮 自体表皮自体表皮+ +真皮替代物真皮替代物结结 语语 深低温皮肤储存的技术为临床救治大面积烧伤病人创面覆盖工作的顺利开展提供了有力的支持。但目前仍有一些不可忽视的问题存在，如降温速率并不十分满意，抗冻剂的进一步筛选；异体皮传播肝炎病毒、HIV的可能性；异体皮来源受到极大的限制；排斥问题的存在，排异组织溶痂及加重病情等结结 语语 随着皮肤低温储存研究的不断发展 ，从而更为有效的提高异体皮活力，同时通过对皮肤替代物研究的加强，相信大面积烧伤患者皮源匮乏的问题将得到进一步解决