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1、植物组织培养学Plant tissue culture2017年春学期年春学期阜阳师范学院生物与食品工程学院阜阳师范学院生物与食品工程学院QQ群群1109539732024/8/312第四章第四章 植物器官培养植物器官培养第一节第一节 概述概述 第二节第二节 营养器官培养营养器官培养第三节第三节 繁殖器官培养繁殖器官培养 2024/8/313植物器官培养（植物器官培养（OrganCulture）是指对植物某一器官是指对植物某一器官的全部、部分或器官原基进行离体培养的技术。分为的全部、部分或器官原基进行离体培养的技术。分为营养器官营养器官（根、茎、叶）和（根、茎、叶）和繁殖器官繁殖器官（胚胎、种
2、子、（胚胎、种子、花器官）培养。花器官）培养。第一节第一节 概述概述2024/8/314植植 物物 器器 官官 培培 养养营养器营养器官培养官培养繁殖器繁殖器官培养官培养根培养根培养茎培养（茎培养（ 包括茎尖、茎段）包括茎尖、茎段）叶培养（包括叶原基、叶柄、叶培养（包括叶原基、叶柄、 叶鞘、叶片、子叶）叶鞘、叶片、子叶）花培养花培养 （包括花托、花瓣、花丝、（包括花托、花瓣、花丝、 花柄、子房、花药）花柄、子房、花药）种子培养（包括成熟与未成熟）种子培养（包括成熟与未成熟）胚胎培养（包括幼胚、成熟胚、胚胎培养（包括幼胚、成熟胚、 胚珠、胚珠、 子房、胚乳培养子房、胚乳培养 ） 外植体形态发生形
3、成完整植株的途径外植体形态发生形成完整植株的途径（一）外植体（一）外植体- -愈伤组织愈伤组织- -完整植株。完整植株。 具体又可分为三种：具体又可分为三种： 1 1、愈伤组织、愈伤组织- -同时长芽和根同时长芽和根- -植株。植株。2 2、愈伤组织、愈伤组织- -茎茎- -根根- -植株。植株。3 3、愈伤组织、愈伤组织- -根根- -芽芽- -植株。植株。4 4、愈伤组织、愈伤组织- -体细胞胚体细胞胚- -植株植株第二节第二节 营养器官培养营养器官培养2024/8/317一、离体根的培养一、离体根的培养二、茎尖的培养二、茎尖的培养* *三、茎段的培养三、茎段的培养四、离体叶的培养四、离体
4、叶的培养*一、离体根的培养一、离体根的培养 （一）（一） 意义：意义： 生理代谢研究的优良实验体系生理代谢研究的优良实验体系 研究器官分化形态建成的良好体系研究器官分化形态建成的良好体系 建立快速生长的根无性系建立快速生长的根无性系 进行诱变育种进行诱变育种2024/8/3181. 1. 培养基选择培养基选择 White培养基；培养基；2/3或或1/2MS和和B5培养基培养基注：离体根生长要求提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果注：离体根生长要求提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入好，加入VB1、VB6最重要，生长素对离体根影响不一致。最重要，生长素对离体根影响不一致。培养温度培养温度25
5、27，暗光培养。，暗光培养。2024/8/319（二）（二） 培养方法培养方法 离体根生长的营养要求n1、无机成分 要求培养基中有全部必要元素，因为它是离体生长所需要的，一般的为MS、B5培养基。n2、氮源 氮源有铵态氮、硝态氮和可溶性有机氮如氨基酸或酰胺等，其中以硝态氮的效果最好。加入含各种氨基酸的水解酪蛋白，能促进离体根的生长。n3、碳源 以蔗糖的效果最佳，几乎为葡萄糖的10倍。蔗糖的浓度为23%。n4、维生素 维生素以B1和B6最为重要，缺少它根的生长受到阻碍，而加入它可使根的生长成倍的加快。B1的使用浓度为0.1-1.0mg/L为宜。n5、生长物质 对离体根的生长而言，生长素的效应最为
6、明显，在一般情况，加入适量的生长素能促进根的生长，其反应和需要量因植物种而异：n6、温度和光照 黑暗有利于根的形成，温度一般在16-25n7、PH 根发生和生长所需的PH范围一般为5.0-6.02. 2. 无性繁殖系的建立无性繁殖系的建立 种种子子消消毒毒 接接种种待待根根伸伸长长后后从从根根尖尖一一端端切切取取长长1 1.2cm.2cm的的根根尖尖接接种种于于培培养养基基发发育育出出侧侧根根待待侧侧根根生生长长约约1 1周周后后切切取取侧侧根根的的根根尖尖进进行行扩扩大大培培养养又又迅迅速速生生长长并并长长出出侧侧根根切切下下进进行行培培养养，如如此此反反复复得得到到从单个根尖衍生而来的离体
7、根的无性系。从单个根尖衍生而来的离体根的无性系。3.培养条件培养条件暗光和温度暗光和温度25-27。2024/8/31124、根的间接增殖n第一步在脱分化培养基上诱导形成愈伤组织，如胡杨的根段培养，可诱导形成白色愈伤组织。n第二步在再分化培养基上诱导形成芽的分化，如胡杨从绿色愈伤组织分化出小植株。一、离体根的培养一、离体根的培养 胡萝卜根培养5、培养方式 离体根的培养方式有三种类型。 第一种固体培养法，即将根尖接种在固体培养基上，根依靠培养基中的养分和生长物质而不断生长。 第二种是液体培养法，把根尖接种在无琼脂的液体培养基中，经常振荡使根获得充足的氧气。 第三种是固体-液体培养法，就是把根基部
8、插入固体琼脂培养基中，根尖浸在液体培养基中，根尖生长而根不断的伸长和分枝。 2024/8/3116二、茎尖的培养二、茎尖的培养* *（一）茎尖培养概念及类型（一）茎尖培养概念及类型（二）病毒在植物体内的分布（二）病毒在植物体内的分布（三）茎尖培养方法及步骤（三）茎尖培养方法及步骤 ( (一一) )茎尖培养概念及类型茎尖培养概念及类型 茎尖培养茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。无菌培养。 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为：茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 微茎尖培养微茎尖培养: : 带有带有1-21-2个叶原基的生长点
9、个叶原基的生长点, , 其长度不超其长度不超过过 0.5mm0.5mm。 2024/8/3117 普通茎尖培养：较大的茎尖普通茎尖培养：较大的茎尖( (如几如几mmmm到几十到几十mm)mm)、芽尖及侧、芽尖及侧芽。芽。 这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便，这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗所需时间短茎尖容易成活，成苗所需时间短 。 茎尖培养的意义：茎尖培养的意义： 普通茎尖培养技术简单，操作方便，易成活，成苗普通茎尖培养技术简单，操作方便，易成活，成苗 时间短，加快繁殖。时间短，加快繁殖。 微茎尖培养可获得脱毒苗；微茎尖培养可获得脱毒苗；2
10、024/8/3118v病毒侵染植株的叶片后，经过一段时间，即向附近的细胞增殖转移。转移速度很慢，每小时只有几微米。当叶片内病毒浓度增大到一定量时，就转移到韧皮部，随后通过维管束转移到其它部分。由于病毒转移速度慢，加上茎尖分生组织无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以生长点的病毒数量极少，几乎检测不出。茎尖培养时，切取的茎尖越小，带病毒的可能性就越小。茎尖脱毒的基本原理茎尖脱毒的基本原理 ( (二二) )病毒在植物体内的分布病毒在植物体内的分布（三）茎尖培养方法及步骤（三）茎尖培养方法及步骤2024/8/3121取取材材材材料料处处理理及及消消毒毒培培养养接接种种驯
11、驯化化移移栽栽直接取材：在生长旺盛、枝直接取材：在生长旺盛、枝条健壮、无病的母株上选生条健壮、无病的母株上选生长不久、杂菌污染少的顶梢长不久、杂菌污染少的顶梢（1 12 2cmcm）（）（取前可喷杀菌取前可喷杀菌药，可顶芽或侧芽）。药，可顶芽或侧芽）。从试管苗获取。从试管苗获取。2024/8/31221 1、 取材取材取取1-2顶梢顶梢2024/8/31232 2、材料处理及消毒、材料处理及消毒 将采集到的茎尖切成将采集到的茎尖切成0.5-1.0cm0.5-1.0cm长长去叶（休眠去叶（休眠芽预先剥除鳞片）芽预先剥除鳞片） 流水冲洗流水冲洗2-4h 2-4h 7575的酒的酒精中处理精中处理3
12、0s 30s 稀释稀释2020倍的次氯酸钠中浸倍的次氯酸钠中浸5-8min(5-8min(取取自老枝条上的可适当延长时间）自老枝条上的可适当延长时间）用无菌水冲洗数次，用无菌水冲洗数次，准备接种。准备接种。 3 3、接种接种 接种前再剥掉一些叶片，使茎尖接种前再剥掉一些叶片，使茎尖0.5cm 0.5cm 接种接种 要求：随切随接，动作迅速。要求：随切随接，动作迅速。 亦可将切下茎尖材亦可将切下茎尖材 料在料在1 15% 5% V VC C液中浸一下。液中浸一下。2024/8/31244 4、培养的方法和程序培养的方法和程序（1）培养基）培养基基本培养基基本培养基MS、White、B5、Hell
13、er培养基。培养基。蔗糖作碳源效果好，浓度蔗糖作碳源效果好，浓度23%。激素（激素（2，4-D，IAA，NAA）和有机添加物有明显影）和有机添加物有明显影响。但激素浓度以响。但激素浓度以0.1mg/L为宜，不要太高。为宜，不要太高。2024/8/3125生长太慢：生长太慢：茎尖不增大茎尖不增大变绿变绿细胞逐渐老化细胞逐渐老化休眠休眠原因原因:生长素浓度太低；温度过低或过高；生长素浓度太低；温度过低或过高；生长太快：生长太快：茎尖迅速增大茎尖迅速增大愈伤组织愈伤组织丧失成苗能力丧失成苗能力原因原因:生长素浓度过高；光照太弱或温度太高生长素浓度过高；光照太弱或温度太高；生长正常：生长正常：茎尖基部
14、稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色逐渐变绿，并伸长，叶原基发育成可见的小叶，逐渐变绿，并伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形成小苗。进而形成小苗。2024/8/3126茎尖生长状态茎尖生长状态（2 2）初代培养条件）初代培养条件 每天每天 光照光照16h16h， 光强度光强度1500-30001x1500-30001x， 温度温度252522 2024/8/3127（3 3） 继代培养继代培养 茎尖长成的新梢茎尖长成的新梢切成小段切成小段增殖培养基中增殖培养基中1个月左右个月左右新梢又可切成小段新梢又可切成小段再转入新培再转入新培养基养基建立和维持了茎
15、尖无性系。建立和维持了茎尖无性系。（即微型扦插）即微型扦插）继代培养可用继代培养可用MS培养基。培养基。2024/8/3128 （4 4） 诱导生根诱导生根 采用采用12MS培养基培养基加入一定的生长素类调节物质，如加入一定的生长素类调节物质，如NAA、IBA等。等。新梢基部浸入新梢基部浸入50或或100mg/l的的IBA溶液处理溶液处理4-8h，然后转移到无激素的生根培养基中。然后转移到无激素的生根培养基中。2024/8/3129(5) (5) 驯化移栽入土驯化移栽入土 在生根培养在生根培养1 1个月左右个月左右生长健壮而发达的根系生长健壮而发达的根系炼苗炼苗移栽移栽 管理（温、光、湿、气）
16、管理（温、光、湿、气）2024/8/3130 指不带芽和带一个以上定芽或不定芽（包括块茎、球茎指不带芽和带一个以上定芽或不定芽（包括块茎、球茎在内）的幼茎切段的无菌培养。在内）的幼茎切段的无菌培养。 2024/8/3131三、茎段培养三、茎段培养茎段培养用于快速繁殖的优点茎段培养用于快速繁殖的优点培养技术简单易行，繁殖速度较快，每年可增殖105-1012株苗；加速良种和珍贵植物的繁殖，芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖的问题，且可节省种株；试管苗便于运输和防止种苗带菌传播，有利于国际种质交流；试管苗可用于保存某些难以用种子保存的种质资源。
17、（一）定义：（一）定义： 离体叶培养指包括叶原基、叶柄、叶离体叶培养指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。菌培养。 它大多经脱分化形成愈伤组织，再它大多经脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出芽和根。由愈伤组织分化出芽和根。 其中叶片培养是一个典型的代表。其中叶片培养是一个典型的代表。 2024/8/3133四、离体叶的培养四、离体叶的培养* *（二）意义：（二）意义： 1.1.是繁殖稀有名贵品种的有效手段；是繁殖稀有名贵品种的有效手段； 2.2.可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题。可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理
18、论问题。2024/8/3134（三）叶片的离体培养方法（三）叶片的离体培养方法 发育方式：叶片培养再生成完整植株有两种方式：发育方式：叶片培养再生成完整植株有两种方式： 是直接诱导形成芽和根是直接诱导形成芽和根完整植株；完整植株； 是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化形成芽和根是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化形成芽和根完整植株。完整植株。 其中，以第二种方式最为常见。其中，以第二种方式最为常见。2024/8/3135叶片离体培养发育方式（成苗途径）叶片离体培养发育方式（成苗途径）2024/8/3136叶原基叶原基叶鞘叶鞘叶片叶片子叶子叶叶柄叶柄愈愈伤伤组组织织芽芽和和根根试试管管苗苗不
19、定芽不定芽 1. 1. 材料选择及灭菌材料选择及灭菌 取植物的幼嫩叶片，切割成适当大小（取植物的幼嫩叶片，切割成适当大小（2 23cm3cm），），在流水中冲洗干净。再用在流水中冲洗干净。再用7575酒精浸泡约酒精浸泡约10s10s 饱和漂白粉液中浸饱和漂白粉液中浸3-15min3-15min，或在，或在0.10.1升汞中浸升汞中浸3-3-5min 5min 无菌水冲洗数次无菌水冲洗数次无菌的干滤纸上吸干无菌的干滤纸上吸干水分水分接种。接种。 注：细嫩与成熟叶片消毒时间不同注：细嫩与成熟叶片消毒时间不同2024/8/31372.2.接种接种 外植体大小：外植体大小：0.5cm0.5cm2 2
20、薄片（叶柄、子叶）薄片（叶柄、子叶）上表皮朝上接种培养基。最好带叶脉，注意极性上表皮朝上接种培养基。最好带叶脉，注意极性2024/8/31383.3.培养培养 （1）培养基：）培养基：MS、B5、White、N6；蔗糖蔗糖3%；2.4D利于愈伤组织形成，利于愈伤组织形成，NAA抑制芽形成，利于根发生，抑制芽形成，利于根发生，KT、6-BA利于芽形成。利于芽形成。愈伤组织诱导：愈伤组织诱导：BA1-3mg/L,NAA0.25-1mg/L；分化培养：分化培养：CTK2mg/L；生根培养：生根培养：NAA0.51.0mg/L2024/8/3139(2)(2)培养过程：培养过程： 培养约培养约2周至周
21、至4周周形成愈伤组织形成愈伤组织再分化培养基上再分化培养基上（附加（附加6-BA2mgL）进行分化培养）进行分化培养约约10d左右，左右，愈伤组织开始转绿出现绿色芽点愈伤组织开始转绿出现绿色芽点发育成无根苗发育成无根苗生根培养基（附加生根培养基（附加NAA0.5-lmg/L）发育形成完整发育形成完整植株。植株。2024/8/3140(3)培养条件：培养条件： 温度：温度：252光照时间：光照时间：10-12h，光照强度：光照强度：1500-3000Lx。2024/8/3141 叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大。叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大。 首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶
22、易首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易培养。培养，子叶比叶片易培养。 其次要添加适当的生长素和细胞分裂素，保证利于叶其次要添加适当的生长素和细胞分裂素，保证利于叶组织的脱分化和再分化。组织的脱分化和再分化。 2024/8/3142第三节第三节 生殖器官的培养生殖器官的培养2024/8/3143一、花器官的培养一、花器官的培养二、种子的培养二、种子的培养三、胚胎的培养三、胚胎的培养*2024/8/3144一、花器官的培养一、花器官的培养1. 1. 定义：定义： 花器官培养指整个花器及其花器官培养指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子
23、房、花药等的丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。无菌培养。 2024/8/3145一、花器官的培养（花蕾）一、花器官的培养（花蕾）2 2、意义：、意义： 通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用别决定中所起的作用 可以了解花器各部分对果实和种子发育的作用可以了解花器各部分对果实和种子发育的作用 内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用 生产上也可用于珍贵品种的扩大繁殖。生产上也可用于珍贵品种的扩大繁殖。2024/8/31462024/8/3147二、种子培养二、种子培养2024/
24、8/31481.1.定义：定义： 种子培养是指受种子培养是指受精后发育完全的精后发育完全的成熟种子和发育成熟种子和发育不完全的未成熟不完全的未成熟种子的无菌培养。种子的无菌培养。2. 2. 意义意义 ：可以打破种子休眠，可以打破种子休眠，促进萌发；促进萌发；通过胚胎拯救解决远缘杂种通过胚胎拯救解决远缘杂种败育性，产生后代；败育性，产生后代；快速繁殖苗木快速繁殖苗木优点：植株分化容易，优点：植株分化容易，无菌操作方便无菌操作方便2024/8/3149 定义：定义：植物胚胎培养是指对植物的胚植物胚胎培养是指对植物的胚( (幼胚、成熟胚幼胚、成熟胚) )、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整
25、植株子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。的技术。2024/8/3150三、胚胎的培养三、胚胎的培养*胚胎培养已有近百年的历史：胚胎培养已有近百年的历史：19041904年的年的HaningHaning最早成功地培养了萝卜和辣椒的胚，最早成功地培养了萝卜和辣椒的胚，并萌发形成小苗。并萌发形成小苗。3030年代年代 成功地把兰科植物的胚培养成小植株。成功地把兰科植物的胚培养成小植株。4040年代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、年代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培
26、养均取得了不同程度的进展及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展2024/8/3151（一）胚胎培养的意义（一）胚胎培养的意义克服远缘杂种的不育性克服远缘杂种的不育性 ；使胚发育不全的植物获得后代；使胚发育不全的植物获得后代； 缩短育种年限缩短育种年限 ；研究与胚发育有关的内外因素。研究与胚发育有关的内外因素。2024/8/3152（二）离体胚培养（二）离体胚培养 离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，一般可分为成熟胚和幼胚培养一般可分为成熟胚和幼胚培养。2024/8/31531.1.成熟胚培养成熟胚培养 指子叶期后至发育完全的胚。指子叶期后至发
27、育完全的胚。培养较易成功，在含有大量无机元素和糖的基本培养基上，培养较易成功，在含有大量无机元素和糖的基本培养基上，就能正常生长成幼苗。就能正常生长成幼苗。将成熟或未成熟种子用将成熟或未成熟种子用70酒精进行几秒钟的表面消毒酒精进行几秒钟的表面消毒无菌水冲洗无菌水冲洗3-4次次无菌条件下进行解剖，取出胚并接种无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。在适当的培养基上培养。2024/8/3154 培养基：培养基：WhiteTukeyMS无机盐无机盐+糖糖(1-2%)+生长辅助物质生长辅助物质(激素、激素、AA、活性炭、维生素等活性炭、维生素等)2024/8/3155幼胚是指子叶期以前
28、的幼小胚。幼胚是指子叶期以前的幼小胚。由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，其研究应用越来越深入广泛。其研究应用越来越深入广泛。幼胚培养技术：心形期胚或更早期的胚（长度仅幼胚培养技术：心形期胚或更早期的胚（长度仅0.10.10.20.2mmmm）胚越小就越难培养胚越小就越难培养 , ,幼胚培养成功的有大麦、荠菜、幼胚培养成功的有大麦、荠菜、甘蔗、甜菜、胡萝卜等甘蔗、甜菜、胡萝卜等 2024/8/3156 2. 2. 幼胚（未成熟胚）培养：幼胚（未成熟胚）培养：（1 1）未成熟胚胎的培养有三种不同的发育）未成熟胚胎的培养有三种不同的发育方式：
29、方式：a. a. 继续进行正常的胚胎发育，维持继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长胚性生长”；b. b. 早熟萌发，即培养后迅速萌发成幼苗；早熟萌发，即培养后迅速萌发成幼苗；c. c. 胚在培养基中发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此胚在培养基中发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。再分化形成多个胚状体或芽原基。 2024/8/3157（2 2）幼胚培养技术）幼胚培养技术幼胚培养的操作方法与成熟胚培养方法基本相同。幼胚培养的操作方法与成熟胚培养方法基本相同。值得注意值得注意的是切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，的是切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，操作时要细心，尽量取出完整的
30、胚。操作时要细心，尽量取出完整的胚。幼胚培养成功的关键，是提供幼胚所必需的营养幼胚培养成功的关键，是提供幼胚所必需的营养和环境条件。和环境条件。2024/8/3158 培养基培养基 幼胚对培养基要求较高，常用的培养基有幼胚对培养基要求较高，常用的培养基有TukeyTukey，NitchNitch、 MSMS，B5B5培养基；培养基；2024/8/3159通常存在的影响条件如下：通常存在的影响条件如下：生长调节物质生长调节物质 不同植物的胚培养需要的生长物质不同。不同植物的胚培养需要的生长物质不同。如如IAAIAA可明显促进向日葵胚的生长；可明显促进向日葵胚的生长；IAAIAA，KtKt的共同作
31、用可促进荠菜幼胚的生长；的共同作用可促进荠菜幼胚的生长；一般认为一般认为IAAIAA可使胚的长度增加；可使胚的长度增加；加入加入BABA可提高胚的生存机会；可提高胚的生存机会；2024/8/3160天然提取物的作用天然提取物的作用 椰乳对胚培养有一定的促进作用（番茄胚在含有椰乳对胚培养有一定的促进作用（番茄胚在含有50%50%椰乳的培养基中可维持生长椰乳的培养基中可维持生长 ）一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力。一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力。 2024/8/3161温光条件温光条件 对于大多数植物的胚来说，在对于大多数植物的胚来说，在25-3025-30为宜为宜 早熟果树如桃的种
32、胚，必须经过一定的低温春化阶段早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长，而马铃薯胚以才能正常萌发生长，而马铃薯胚以2020为好。光照可为好。光照可以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。2024/8/3162其它条件其它条件 胚培养中除要求较高的蔗糖（胚培养中除要求较高的蔗糖（4.5%4.5%）浓度、）浓度、高渗透压以外，还要求较高浓度的氨基酸及无机高渗透压以外，还要求较高浓度的氨基酸及无机盐。盐。 2024/8/31632024/8/31
33、64(三三)胚珠培养胚珠培养. .定义：定义：胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚珠置于培养基培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一珠置于培养基培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。起取下来培养。2024/8/3165柱头柱头花柱花柱子房子房花梗花梗花托花托花组成花组成2024/8/3166胚囊胚囊卵细胞卵细胞珠心珠心珠珠孔孔反足细胞反足细胞珠珠被被胚珠胚珠极核极核株柄株柄2024/8/31672.2.意义：意义： 胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚较小不易培养的胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚较小不易培养的问题。问题。 另一方面在未
34、受精的胚珠培养中，可诱发大孢子发另一方面在未受精的胚珠培养中，可诱发大孢子发育成单倍体，用于单倍体育种。育成单倍体，用于单倍体育种。 3.3.培养技术：培养技术： 从花中取出子房从花中取出子房70%酒精消毒酒精消毒30秒秒无菌水冲洗无菌水冲洗5%次氯酸钠液中灭菌次氯酸钠液中灭菌10分钟分钟无菌水冲洗数次无菌水冲洗数次在无菌条件下进行解剖在无菌条件下进行解剖取出胚珠取出胚珠放在培养基上放在培养基上培养培养基本培养基：用基本培养基：用Nistch培养基培养基MS、N6、B5等培养基也可采用等培养基也可采用关键：选择胚的发育时期关键：选择胚的发育时期球形胚期的胚珠较易培养成功球形胚期的胚珠较易培养成
35、功2024/8/31684.4.发育方式：发育方式：2024/8/3169未受精胚珠未受精胚珠受精胚珠受精胚珠愈伤组织愈伤组织发育成种子发育成种子大孢子或卵分化为大孢子或卵分化为单倍体植株单倍体植株再生植株再生植株( (四四) )子房培养子房培养2024/8/31701.1.取材：取材： 开花前开花前1 15 5天摘下未授粉子房；天摘下未授粉子房； 或授粉后摘下子房。或授粉后摘下子房。2.2.灭菌：灭菌： 材料处理材料处理( (禾谷类植物用禾谷类植物用70%70%酒精擦洗幼穗；双子酒精擦洗幼穗；双子叶植物花蕾用饱和漂白粉灭菌叶植物花蕾用饱和漂白粉灭菌1515分分) 70%) 70%浸浸3030
36、秒秒 无菌水冲洗无菌水冲洗 0.1% 0.1%升汞升汞15152020分钟分钟 无无菌水冲洗菌水冲洗 无菌滤纸吸干。无菌滤纸吸干。3.3.接种：接种：无菌条件下剥开幼花，夹出子房并接种于培养基（无菌条件下剥开幼花，夹出子房并接种于培养基（MS、N6等）。等）。4.4.培养：培养：温度温度26,相对湿度相对湿度50-60%，16h散射光。散射光。2024/8/3171 胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的三倍体组织。成的三倍体组织。 由它可获得无子结实的三倍体植株，进而可将它由它可获得无子结实的三倍体植株，进而可将它加倍成六倍体植株。加倍成
37、六倍体植株。2024/8/3172( (五五) )胚乳的培养胚乳的培养 培养方法：培养方法： 1.取材与接种取材与接种取授粉取授粉4-8d后的幼果后的幼果常规消毒常规消毒在无菌条在无菌条件下切开果实件下切开果实取出种子取出种子分离出胚乳分离出胚乳接种接种2.培养基培养基:MS、White+2，4-D（NAA，0.5-2.0mg/L）+6-BA，0.1-1.0mg/L 2024/8/31733.3.培养培养 在在25-2725-27，黑暗条件或散射光下培养约，黑暗条件或散射光下培养约6-l0d6-l0d胚乳开始膨大胚乳开始膨大形成愈伤组织形成愈伤组织分化培养基上（分化培养基上（ 附附加加6-BA
38、6-BA， 0.5-3.0mg/L0.5-3.0mg/L，少量的，少量的NAANAA ）培养）培养 待愈待愈伤组织长出芽后，取下不定芽伤组织长出芽后，取下不定芽生根培养基生根培养基光下光下培养培养10-15d10-15d，切口处可长出白色的不定根。，切口处可长出白色的不定根。2024/8/31742024/8/3176第第4节节 植物组织与器官培植物组织与器官培养养 实例实例v植物组织培养：将离体的植物组织（器官、植物组织培养：将离体的植物组织（器官、细胞、胚胎、原生质体）等在适当的培养条细胞、胚胎、原生质体）等在适当的培养条件，长成完整植株的技术。件，长成完整植株的技术。诱发产生愈伤诱发产生
39、愈伤组织、潜伏芽组织、潜伏芽v植物器官培养：植物器官培养：将诱导的或植株将诱导的或植株上原有的各种器官，上原有的各种器官，放在无菌的人工环境放在无菌的人工环境中让其进一步发育，中让其进一步发育，最终长成幼苗或大量繁殖最终长成幼苗或大量繁殖的过程。的过程。植物离体无性繁殖植物离体无性繁殖v简称离体繁殖简称离体繁殖（in vitroin vitro propagation propagation)、微微型繁殖型繁殖（micropropagationmicropropagation)，是指利用离体是指利用离体培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、
40、组织和细胞进行离体培养，片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，并在短期内获得大量遗传性一致的植株的方并在短期内获得大量遗传性一致的植株的方法（技术）。法（技术）。v用这种方法得到的植株群体称单株无性系。用这种方法得到的植株群体称单株无性系。(来自一个单株（或一个单芽），它们遗传组成相同来自一个单株（或一个单芽），它们遗传组成相同)近近400种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子西瓜、马铃薯、种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广泛应用。杨树等已在种苗生产上广泛应用。植物离体无性繁殖的意义（优越性）植物离体无性繁殖的意义（优越性）繁殖速度快，经济效益高繁殖速度快，经
41、济效益高占用空间小，不受地区季节限占用空间小，不受地区季节限制，便于工厂化育苗制，便于工厂化育苗可以繁殖各种珍稀、涉危苗木可以繁殖各种珍稀、涉危苗木离体繁殖周期：离体繁殖周期：13个月个月繁殖系数：几十繁殖系数：几十几百倍几百倍又称快繁又称快繁离体繁殖是建立在体离体繁殖是建立在体细胞系的基础上，细胞系的基础上，是在人工控制的环是在人工控制的环境条件下，不会造境条件下，不会造成性状分离，也不成性状分离，也不会退化，同时还可会退化，同时还可避免病虫害的侵染。避免病虫害的侵染。利于筛选突变体，为育种服务利于筛选突变体，为育种服务手指玫瑰手指玫瑰 由根由根组织培养组织培养的蒲的蒲公英幼苗公英幼苗植物离
42、体无性繁殖的方式植物离体无性繁殖的方式v器官发生型器官发生型(organogenesis type)(organogenesis type)v胚状体发生型胚状体发生型(embryogenesis type)(embryogenesis type)v不定芽型（不定芽型（adventitious bud type)adventitious bud type)v器官型器官型(organ type)(organ type)v原球茎型原球茎型(protocorm type)(protocorm type)v球茎芽型球茎芽型 v块茎型块茎型v鳞茎型鳞茎型v孢子型孢子型v根茎型根茎型 v微枝扦插型微枝扦插型
43、 器官发生型器官发生型(organogenesis type)(organogenesis type)：v诱导器官外植体产生诱导器官外植体产生愈伤组织愈伤组织，经分化培，经分化培养形成芽、根再生成植株的方式。养形成芽、根再生成植株的方式。v技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早期挑选，使其来源尽量一致。期挑选，使其来源尽量一致。v特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再生成植株，遗传性不稳定，易产生变生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。异。芦荟、烟草、油菜等芦荟、烟草、油菜等 2024/8/3182无菌母株制备无菌母株制
44、备增殖、分化增殖、分化植株再生及鉴定植株再生及鉴定炼苗和移植炼苗和移植器器官官发发生生型型基基本本程程序序培养基中激素配比培养基中激素配比激素种类及浓度激素种类及浓度基本培养基组成基本培养基组成渗透压渗透压逐步过渡逐步过渡培养基筛选培养基筛选材料灭菌材料灭菌胚状体发生型胚状体发生型(embryogenesis type)(embryogenesis type)：v指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱分化形成胚状体再成苗的方式。分化形成胚状体再成苗的方式。v技术关键：提高不同外植体胚状体发生及技术关键：提高不同外植体胚状体发生及萌发率和提高胚状体同步化率。萌发
45、率和提高胚状体同步化率。v特点：胚状体发生数量多、速度快、结构特点：胚状体发生数量多、速度快、结构完整，繁殖系数高；遗传性稳定。完整，繁殖系数高；遗传性稳定。甘蔗、胡萝卜、石刁柏等甘蔗、胡萝卜、石刁柏等 不定芽型（不定芽型（adventitious bud type)adventitious bud type)：v选取具有顶芽和腋芽的短枝选取具有顶芽和腋芽的短枝无菌培养，诱导芽萌发成苗无菌培养，诱导芽萌发成苗或增殖产生许多不定芽发育或增殖产生许多不定芽发育成苗，将新萌生的枝条再转成苗，将新萌生的枝条再转接继代，重复芽到苗的增殖接继代，重复芽到苗的增殖过程，最后使其生根形成植过程，最后使其生根形
46、成植株的方式。株的方式。v技术关键：打破顶端优势，技术关键：打破顶端优势，促使腋芽增殖并促其生根。促使腋芽增殖并促其生根。v特点：繁殖率高、保持物种特点：繁殖率高、保持物种的遗传稳定性，多用于林木的遗传稳定性，多用于林木的繁殖。的繁殖。FLash器官型器官型(organ type)(organ type)v指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球茎、小块茎）产生再生成植株的方式。茎、小块茎）产生再生成植株的方式。v技术关键：对培养基要求高，控制好激素技术关键：对培养基要求高，控制好激素浓度，
47、避免愈伤组织发生。浓度，避免愈伤组织发生。v优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹等丝石竹等 原球茎型原球茎型(protocorm type)(protocorm type)v兰属特有的方式，兰属特有的方式，即外植体经培养即外植体经培养产生原球茎，再产生原球茎，再直接长成植株。直接长成植株。球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中
48、种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，球茎
49、芽，一端出芽一端出根一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植中种植 唐唐菖菖蒲蒲观观叶叶海海棠棠块茎型块茎型 v叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根化出芽和根v块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高移栽，成活率高 。v花叶芋花叶芋 鳞茎型鳞茎型 v鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎 v在试管内形成小鳞茎需较长时间在试管内形成小鳞茎需较长时间 v百合百合 郁金香郁金香孢子型孢子型 v用成熟或未成熟的孢子进行培养用成熟或未成熟的
50、孢子进行培养 v孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长间较长 v地钱地钱狼尾蕨狼尾蕨根茎型根茎型 v蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组织培养的最佳外植体组织培养的最佳外植体 v根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢子型快子型快v肾蕨等肾蕨等 微枝扦插型微枝扦插型 带芽的小插条在试管内进行无菌扦插带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 为木本植物进行快速繁殖的主要方式为木本植物进行快速繁殖的主要方式 葡萄、杨树葡萄、杨树 2024/8/3193培养基无机盐无机盐无机盐培养基的组成培养基的组成大量元素大
51、量元素大量元素大量元素( (使用浓度大于使用浓度大于使用浓度大于使用浓度大于0.5mmol/L)0.5mmol/L)微量元素微量元素微量元素微量元素( (使用浓度小于使用浓度小于使用浓度小于使用浓度小于0.5mmol/L)0.5mmol/L)2024/8/3194无机盐2024/8/3195有有机物机物氨基酸类氨基酸类 重要的有机氮源重要的有机氮源维生素类维生素类 以辅酶形式参与植物细胞以辅酶形式参与植物细胞代谢活动，对生长、分化具有很好的促代谢活动，对生长、分化具有很好的促进作用进作用 vb1， vb6糖类糖类 主要的碳源主要的碳源蔗糖？蔗糖？天然有机添加物类天然有机添加物类 CM（椰乳）、
52、（椰乳）、马铃薯汁、酵母提取液（马铃薯汁、酵母提取液（YE）、番茄汁）、番茄汁等等2024/8/3196蔗糖浓度分别为蔗糖浓度分别为0 0、1%1%、5%5%2024/8/3197调节物质（一）生长素类（一）生长素类 促进细胞伸长生长和分裂、促进细胞伸长生长和分裂、诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的细胞分裂素配合可诱导不定芽的分化、侧芽细胞分裂素配合可诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的产生等。的萌发与生长、胚状体的产生等。常用的有常用的有2,4-D2,4-D、NAANAA、IBAIBA、IAAIAAIAAIAA为天然植物生长素，见光易分解，高
53、温高压为天然植物生长素，见光易分解，高温高压易受破坏；易受破坏；2,4-D2,4-D有抑制芽形成的作用，一般用于细胞启动有抑制芽形成的作用，一般用于细胞启动脱分化阶段；脱分化阶段；诱导分化则用诱导分化则用NAANAA、NBANBA或或IAAIAA。IBAIBA诱导生根效果诱导生根效果最好。最好。2024/8/3198（二）细胞分裂素类（二）细胞分裂素类 促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、抑制离体组织或器官衰老。抑制离体组织或器官衰老。常用的有常用的有6-BA、 KT 、 ZT6-BA6
54、-BA2024/8/3199BA分别为分别为0,0.1,5mg/LNAA分别为分别为0,0.1,5mg/L2024/8/31100（三）赤霉素类（三）赤霉素类 主要应用主要应用GA3，促进体细胞胚发育成小植，促进体细胞胚发育成小植株，株，GA3不耐热，水溶解后不稳定，应采不耐热，水溶解后不稳定，应采用过滤除菌，并用酒精溶解。用过滤除菌，并用酒精溶解。脱落酸脱落酸 抑制蛋白质合成，抵消和抑制上述三种激抑制蛋白质合成，抵消和抑制上述三种激素发挥作用；诱导休眠、促进衰老和脱落。素发挥作用；诱导休眠、促进衰老和脱落。乙烯乙烯2024/8/31101植物细胞工程培养基配制植物细胞工程培养基配制v培养基母
55、液的配制培养基母液的配制大量元素一般配成大量元素一般配成10倍浓度的母液；倍浓度的母液；微量元素和有机营养常配成微量元素和有机营养常配成100倍浓度的母液；倍浓度的母液；混合定容时，注意药剂的添加顺序及稀释度，以混合定容时，注意药剂的添加顺序及稀释度，以免沉淀；免沉淀；生长调节类物质不溶于水生长调节类物质不溶于水,需用不同溶剂进行溶解需用不同溶剂进行溶解单独配制的试剂：单独配制的试剂：v铁盐与铁盐与EDTAvCaCl2 前前P282024/8/31102以以KNO3为例为例1L培养基需要量为培养基需要量为19g。在配制母液时，增加在配制母液时，增加10倍量，为倍量，为190g。在母液中的浓度为
56、在母液中的浓度为190g/L，即，即0.19g/ml在配制培养基时，取在配制培养基时，取10ml，10ml0.19g/ml=19g回回P262024/8/31103植物细胞工程培养基配制植物细胞工程培养基配制v培养基配制过程培养基配制过程药品药品 按顺序混合按顺序混合 pHpH调整调整 加热溶解加热溶解器皿器皿 水洗水洗 干燥干燥 分装培养基分装培养基 加塞加塞 冷却冷却 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 2024/8/31104常常用培养基用培养基v到目前研制开发了数十种适宜不同植物、不到目前研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方。同组织、不同细胞生长发育的培养基配方。
57、但多数培养基配方是在几种普遍应用的培养但多数培养基配方是在几种普遍应用的培养基上演变而来的。基上演变而来的。v这几种常见的培养基为是：这几种常见的培养基为是：MS、ER、B5、N6、NT、White等，其配方如下：等，其配方如下：2024/8/311052024/8/31106培养基分类培养基分类v根据培养基无机盐含量的差异将其分为以根据培养基无机盐含量的差异将其分为以下下4类：类：高无机盐含量培养基（植物器官、花药、高无机盐含量培养基（植物器官、花药、细胞及原生质体培养）；细胞及原生质体培养）；-MS较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科和单子叶植物的组织和
58、花药培养）；和单子叶植物的组织和花药培养）；-B5中等无机盐含量培养基（花药培养）；中等无机盐含量培养基（花药培养）；-H低无机盐含量培养基（生根）。低无机盐含量培养基（生根）。-WHITE2024/8/31107植植物组织培养问题分析物组织培养问题分析试试管苗玻璃化现象（管苗玻璃化现象（vitrificationvitrification） 是指组织培养过程中的特有的一种生理失是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。态异常的现象。v 玻璃化苗绝大多数为玻璃化苗绝大多数为 来自茎尖或茎段来自茎尖或茎段 培养物的不
59、定芽。培养物的不定芽。v 通常玻璃化苗通常玻璃化苗 恢复正常的比例很低，恢复正常的比例很低， 在继代培养中仍然在继代培养中仍然 形成玻璃化苗。形成玻璃化苗。2024/8/31108玻璃化的解决方法玻璃化的解决方法1.增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；水势；2.减少培养基中减少培养基中NH4+浓度；浓度；3.增加光照；增加光照；4.增加容器通风，最好进行增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；5.降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻降低培养温度，进行变温培养，有助于减
60、轻试管苗玻璃化的现象发生；试管苗玻璃化的现象发生；6.降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。入适量脱落酸。2024/8/31109褐褐变问题变问题v成因酶促-酚氧化成醌及聚合非酶促-醌聚合v时段初代培养初代培养继代培养继代培养2024/8/31110 选择合适的外植体选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 合适的培养条件合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以
61、减轻材料的褐变现象。度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。 使用抗氧化剂使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。 材料预处理和细胞筛选材料预处理和细胞筛选使用吸附剂使用吸附剂 0.1%-0.5%0.1%-0.5%的活性炭的活性炭、PVP对防止褐变也有较为对防止褐变也有较为明显的效果。明显的效果。连续转移连续转移 对容易褐变的材料可间隔对容易褐变的材料可间隔1224h1224h的培养后，再转的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理移
62、到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d7-l0d后，褐变现象便后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。会得到控制或大为减轻。减轻褐变现象发生的方法减轻褐变现象发生的方法2024/8/31111微微生物污染问题生物污染问题v原因原因消毒不彻底消毒不彻底v外植体消毒问题外植体消毒问题v培养基及器皿消毒问题培养基及器皿消毒问题v环境消毒问题环境消毒问题无菌操作不过关无菌操作不过关2024/8/31112外植体消毒问题外植体消毒问题外植体取材外植体取材 外植体外植体(expant)是指用于离体培养的活的是指用于离体培养的活的植物组织。植物组织。来源：来源：2024/8/31113外植体消毒问题外植体消
63、毒问题外植体灭菌的过程：外植体灭菌的过程：流水冲洗流水冲洗1020min表面消毒表面消毒无菌水冲洗无菌水冲洗45次次 沥水待用沥水待用 Flash2024/8/31114常用消毒剂消毒灭菌效果比较常用消毒剂消毒灭菌效果比较消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度%去除的难易去除的难易 消毒时间消毒时间min 效果效果次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钠次氯酸钠漂白粉漂白粉溴水溴水过氧化氢过氧化氢升汞升汞酒精酒精抗生素抗生素硝酸银硝酸银9102饱和溶液饱和溶液1210120.11707545(mg/L)1易易易易易易易易最易最易较难较难易易中中较难较难5305305302105152100.223060530很好很好很
64、好很好很好很好很好很好好好最好最好好好较好较好好好2024/8/31115容器容积容器容积（mL）121下所需的最下所需的最少灭菌时间少灭菌时间( (min）205075250500100015002000152025303540培养基及器皿消毒灭菌问题培养基及器皿消毒灭菌问题培养基高压蒸汽灭菌所需的最少时间培养基高压蒸汽灭菌所需的最少时间2024/8/31116培养基灭菌培养基灭菌培养基组成中若含有遇热易分解物质，培养基组成中若含有遇热易分解物质，如如生长调节物质、维生素、尿素、酶等，生长调节物质、维生素、尿素、酶等，则必须用过滤法除菌。则必须用过滤法除菌。过滤除菌时，使用孔径为过滤除菌时，
65、使用孔径为0.220.45m或更小的细菌滤膜。或更小的细菌滤膜。过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器进行，所用器皿均应经过高压消毒灭菌，进行，所用器皿均应经过高压消毒灭菌，灭菌温度不超过灭菌温度不超过121。2024/8/31117器皿消毒灭菌器皿消毒灭菌v手术刀手术刀v镊子镊子v平皿平皿v干热灭菌干热灭菌 150-160，2h 2024/8/31118环境消毒问题环境消毒问题2024/8/31119无菌操作问题无菌操作问题评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否2024/8/31120评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否2024/8/31121评价下列操作
66、正确与否评价下列操作正确与否2024/8/31122评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否2024/8/31123无菌操作无菌操作v无菌操作前的准备工作无菌操作前的准备工作无菌操作台的使用无菌操作台的使用操作所用器械应浸泡在操作所用器械应浸泡在95%酒精中，用前需放在酒精中，用前需放在耐热器皿中加入少量酒精后进行灼烧，每次使用耐热器皿中加入少量酒精后进行灼烧，每次使用后都要灭菌。后都要灭菌。v无菌操作步骤无菌操作步骤外植体的适当切割的注意事项外植体的适当切割的注意事项继代培养的材料继代培养的材料( (液体材料、固体材料）液体材料、固体材料）2024/8/311243.1.4.4 其他问题v培
67、养条件控制培养条件控制激素水平激素水平光照：时间，强度和光质。光照：时间，强度和光质。温度：适温有利于细胞分裂与分化，而在一温度：适温有利于细胞分裂与分化，而在一定范围内降低培养温度可以使细胞的质量定范围内降低培养温度可以使细胞的质量增加；培养基昼夜变温可能有利于器官的增加；培养基昼夜变温可能有利于器官的发生。发生。pH pH 通常使用的通常使用的pHpH值的范围是值的范围是5.55.56.56.5。pH4pH77，培养物不能正常生长。，培养物不能正常生长。气体气体2024/8/31125激素水平的控制激素水平的控制v生长素应用的浓度范围为生长素应用的浓度范围为0.115mg/L。在细胞脱分化
68、过程中，启动细胞分裂形在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形成愈伤组织，以成愈伤组织，以2,4-D最为有效。最为有效。细胞脱分化需要高浓度的细胞脱分化需要高浓度的2,4-D，当胚，当胚性细胞形成转入再分化时，则需较低的性细胞形成转入再分化时，则需较低的2,4-D浓度。浓度。v使用浓度范围为使用浓度范围为0.110mg/L。细胞分裂素既可诱导细胞分裂，又可调节细细胞分裂素既可诱导细胞分裂，又可调节细胞分化。胞分化。2024/8/3112616h/d24h/d0h/d光照时间的影响光照时间的影响光照时间的影响光照时间的影响2024/8/31127液体振荡培养的愈伤组织生长与振荡频率的关系液体振荡培养的
69、愈伤组织生长与振荡频率的关系2024/8/311283.2 植物胚胎培养Flash2024/8/31129概念概念花药培养属于花药培养属于器官培养范畴器官培养范畴花粉培养属于花粉培养属于细胞培养范畴细胞培养范畴也称小孢子培养也称小孢子培养花药及花粉培养花药及花粉培养把发育到一定阶段的花药接种在人把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成植工培养基上，使其发育和分化成植株的过程株的过程从花药中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，通过从花药中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，通过培养使其脱分化并发育成植株的过程培养使其脱分化并发育成植株的过程2024/8/31130v获得单倍
70、体植株获得单倍体植株v花药培养的基本程序：花药培养的基本程序： Flash选处于生殖生长高峰期的花药，需低选处于生殖生长高峰期的花药，需低温预处理（温预处理（310，210天），光天），光照先弱后强。照先弱后强。花药培养花药培养目的及程序目的及程序2024/8/31131花粉或小孢子的分离花粉或小孢子的分离花粉或小孢子培养目的及方法花粉或小孢子培养目的及方法目的：获得单倍体植株目的：获得单倍体植株2024/8/31132花药看护培养花药看护培养花粉悬浮培养花粉悬浮培养固液双层培养固液双层培养花花粉培养方法粉培养方法2024/8/311332024/8/31134毛毛状根培养状根培养v定义：毛状
71、根定义：毛状根(hairy roots)是（双子叶）植株是（双子叶）植株或组织、器官经发根农杆或组织、器官经发根农杆菌（菌（Agrobacterium rhizogenes）感染后，）感染后，形成的类似头发一样的根形成的类似头发一样的根组织。又称发状根。组织。又称发状根。1934年，年，Hildebrand报道了发根农杆菌感报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根染苹果树产生发根。2024/8/31135 毛状根的特性毛状根的特性v特性：特性：毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。多分枝，多根毛，无向地性。生理生化和遗传稳定。生理生
72、化和遗传稳定。v为什么可以不依赖激素？为什么可以不依赖激素？发根农杆菌的发根农杆菌的Ri质粒上的质粒上的T-DNA片断整合进片断整合进植物细胞核基因组中。植物细胞核基因组中。T-DNA上有生长素合成基因上有生长素合成基因tms 1 和和tms 2能能够指导够指导IAA的合成。的合成。 2024/8/31136 毛状根的诱导毛状根的诱导外外植体接种法植体接种法 -共培养共培养 茎秆接种法茎秆接种法原原生质体生质体-农杆菌共培养法农杆菌共培养法2024/8/31137生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素v青蒿：为双子叶植物药菊科植物青蒿：为双子叶植物药菊科植物v青蒿
73、素：青蒿素：倍半萜内酯类化合物倍半萜内酯类化合物功效：治疗疟疾功效：治疗疟疾2024/8/311381.Bioreactor,2.Concentricdraughtcylinder,3.Stainlessstellmesh,4.Airoutlet,5.Timer,6.Mistnozzle,7.Medium,8.Airinlet,9.Airfilter,10.Flowmeter,11.Holesondraughtcylinder,12.Electromagneticvalve,13.Airstoragetank,14.Nebulizingdevice,15.40Wfluorescentlamp2
74、024/8/311392024/8/31140生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素2024/8/31141GrowthfeatureofArtemisia annua adventitiousshootinthemistbioreactor(a)0d;(b)10d;10cm30cm2024/8/31142生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素素v实验材料实验材料青蒿毛状根：青蒿毛状根：由发根农杆菌由发根农杆菌R1601诱导青蒿叶片产生诱导青蒿叶片产生v培养方法及条件培养方法及条件1. 固体培养固体培养2030 mm青蒿毛状根根尖青蒿毛
75、状根根尖MS固体培养基固体培养基(添加添加30 L蔗糖蔗糖)继代时同为继代时同为15d2024/8/31143生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素v培养方法及条件2. 液体振荡培养（三角瓶）接种量：每L培养液（MS）5 g 毛状根培养物（分支多且细长的毛状根）120-130 rpm，251 ，12 hd光照液体培养的继代时间为10 d。 3.反应器培养反应器中的培养液(MS)为400mL，接种量为0.8g12 hd培养，25I 。雾化间隔30 min，雾化2min。通气量为0.5 Lmin，通气时间为15 mln。2024/8/31144v最大生物量最大生物量10.3g/L，青蒿素产量达到，青蒿素产量达到179.1mg/L，青蒿，青蒿素的含量为素的含量为1.74。2024/8/31145小结小结v外植体选择是植物组织培养的基本环节，应外植体选择是植物组织培养的基本环节，应根据不同培养目的确定取材原则。根据不同培养目的确定取材原则。v通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？
