《核酸和核苷酸PPT课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸和核苷酸PPT课件（79页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 第三章第三章 核酸和核苷酸核酸和核苷酸1n n认识核酸在生命科学上的重要性n n弄清碱基、核苷、核苷酸和核酸分子结构上的关系n n了解核酸的化学本质及DNA和RNA在组分、结构和功能上的差异n n认识核酸的结构与其性质与功能之间的关系。学习要求学习要求上页下页章首2n n18681868年年 F.MiescherF.Miescher首先从伤员绷带的脓细胞首先从伤员绷带的脓细胞中分离得到称为中分离得到称为“ “核素核素” ”的核酸的核酸n n19441944年年 O.N.AveryO.N.Avery通过转化实验证实通过转化实验证实DNADNA是主是主要的遗传物质要的遗传物质n n1953195
2、3年年 J. D.WatsonJ. D.Watson和和F.H.C.CrickF.H.C.Crick提出提出DNA DNA 双螺旋结构模型双螺旋结构模型 n n1958 Crick1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则提出遗传信息传递的中心法则n n1970s 1970s 建立建立DNADNA重组技术重组技术n n1980s1980s后后 分子生物学、分子遗传学等学科突分子生物学、分子遗传学等学科突飞猛进发展，提出并完成飞猛进发展，提出并完成HGPHGP核酸化学的发展过程上页下页章首3一一. . 核酸的概念和重要性核酸的概念和重要性二二. . 核酸的化学组成及其基本结构单位核苷酸核酸的
3、化学组成及其基本结构单位核苷酸三三. . 核酸的一级结构及其测定核酸的一级结构及其测定四四. . DNADNA的高级结构的高级结构五五. . RNARNA的高级结构的高级结构六六. .核酸和核苷酸的理化性质核酸和核苷酸的理化性质七七. .核酸的分离提取和纯化核酸的分离提取和纯化本章目录本章目录上页下页章首4一.核酸的概念和重要性核酸的概念和重要性核酸的概念核酸的重要性上页下页章首5核酸的概念n n核酸是酸性的大分子物质，在活细胞中与碱性核酸是酸性的大分子物质，在活细胞中与碱性蛋白结合，以核蛋白形式存在。蛋白结合，以核蛋白形式存在。n n核酸分为核酸分为脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 ( DNA )(
4、 DNA )以及核糖核酸以及核糖核酸 (RNA)(RNA)两类，两类，DNADNA所含核苷酸分子数比所含核苷酸分子数比RNARNA大得大得多。多。n n RNARNA分为三个类型，即核蛋白体分为三个类型，即核蛋白体 RNA(rRNA)RNA(rRNA)、信使信使RNA(mRNA)RNA(mRNA)和转移和转移RNA(tRNA)RNA(tRNA)，它们都参与，它们都参与蛋白质合成蛋白质合成上页下页章首节首6脱氧核糖核酸和核糖核酸异同的对比脱氧核糖核酸和核糖核酸异同的对比RNARNADNADNA组成组成戊糖戊糖核糖核糖脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基A,G,CA,G,CA,G,CA,G,CUUTT磷酸磷酸
5、Pi(Pi(磷酸二酯键磷酸二酯键) )Pi(Pi(磷酸二酯键磷酸二酯键) )结构结构单链，部分碱基互补，局部双单链，部分碱基互补，局部双螺旋，三叶草形等螺旋，三叶草形等双链，碱基互补，双螺旋双链，碱基互补，双螺旋形形分布分布细胞核细胞核( (核仁核仁) )， 细胞质细胞质( (线粒线粒体、核蛋白体、胞液体、核蛋白体、胞液) )细胞核细胞核( (染色质染色质)细胞质细胞质( (线粒体线粒体) )生物功能生物功能遗传信息表达，反转录，直接遗传信息表达，反转录，直接参与蛋白质的生物合成参与蛋白质的生物合成遗传的物质基础，负责遗遗传的物质基础，负责遗传信息贮存，发布，转录传信息贮存，发布，转录上页下页
6、章首节首7n nDNADNA是遗传的物质基础，负责遗传信息的贮存是遗传的物质基础，负责遗传信息的贮存和发布，遗传基因就是和发布，遗传基因就是DNADNA链上的若干核苷酸链上的若干核苷酸所组成的片段。所组成的片段。n nRNARNA负责遗传信息的表达负责遗传信息的表达，直接参与蛋白质生，直接参与蛋白质生物合成，转录物合成，转录DNADNA所发布的遗传信息，并将之所发布的遗传信息，并将之翻译给蛋白质，使生命机体的生长、发育、翻译给蛋白质，使生命机体的生长、发育、繁殖和遗传得以继续进行。繁殖和遗传得以继续进行。核酸的重要性核酸的重要性上页下页章首节首9核酸类物质RNA的重要功能 RNARNA种类种类
7、功能功能mRNAmRNA将信息从基因传递到蛋白质将信息从基因传递到蛋白质 tRNAtRNA携带活化氨基酸参与蛋白质生物合成携带活化氨基酸参与蛋白质生物合成 rRNArRNA构成核蛋白体（蛋白质合成场所）构成核蛋白体（蛋白质合成场所） SnRNASnRNA参与参与mRNAmRNA前体剪接加工前体剪接加工 MM1 1RNARNARNasePRNaseP的催化单体的催化单体 端粒酶端粒酶RNARNA端粒合成的模板端粒合成的模板 引物引物RNARNA起始起始DNADNA复制复制 TsRNATsRNA蛋白质分泌复合物中的一部分蛋白质分泌复合物中的一部分 返回10二二. .核酸的化学组成核酸的化学组成及其
8、基本结构单位核苷酸及其基本结构单位核苷酸核酸的化学组成核酸的基本结构单位核苷酸上页下页章首11核酸的化学组成核酸的化学组成n n元素组成：元素组成：C C、H H、O O、N N、P Pn nP P元素的含量较多并且恒定，约占元素的含量较多并且恒定，约占9 911%11%。n n核酸在酸、碱或酶作用下会水解成核苷酸，核酸在酸、碱或酶作用下会水解成核苷酸，进一步水解可得碱基进一步水解可得碱基( (嘌呤或嘧啶嘌呤或嘧啶) )，戊糖，戊糖( (核糖或脱氧核糖核糖或脱氧核糖) ) 和磷酸和磷酸上页下页章首节首12 组成核酸的戊糖有两种。组成核酸的戊糖有两种。DNADNA所含的糖为所含的糖为 -D-D-
9、2-2-脱氧核糖；脱氧核糖；RNARNA所含的糖则为所含的糖则为-D-D-核糖。核糖。(一)戊糖RiboseRiboseDeoxyriboseDeoxyribose上页下页章首节首13(二)碱基(嘌呤和嘧啶）嘌呤和嘧啶）上页下页章首节首14常见的嘌呤和嘧啶常见的嘌呤和嘧啶上页下页章首节首15( (三三) )核苷（核苷（nucleosidenucleoside）核苷核苷 戊糖戊糖+ +碱基碱基 糖与碱基之间的糖与碱基之间的C-NC-N键，称为键，称为C-NC-N糖苷键糖苷键1122334455(OH)1122334455(OH)上页下页章首节首嘧啶核苷嘧啶核苷嘌呤核苷嘌呤核苷16几种稀有核苷几种
10、稀有核苷上页下页章首节首17几种稀有核苷几种稀有核苷上页下页章首节首18（四）核苷酸（四）核苷酸（nucleotide）核苷酸核苷酸 核苷核苷+ +磷酸磷酸 戊糖戊糖+ +碱基碱基+ +磷酸磷酸HHHHHHH H H上页下页章首节首腺苷酸腺苷酸脱氧腺苷酸脱氧腺苷酸19（四）核苷酸（四）核苷酸（nucleotide）脱氧核苷酸脱氧核苷酸上页下页章首节首20（四）核苷酸（四）核苷酸（nucleotide）核苷酸核苷酸上页下页章首节首21（五）核苷酸衍生物（五）核苷酸衍生物上页下页章首节首n n1. 1. 1. 1. 继续磷酸化继续磷酸化继续磷酸化继续磷酸化AMPADPATP22（五）核苷酸衍生物（
11、五）核苷酸衍生物上页下页章首节首2.2.环化磷酸化环化磷酸化 cAMPcGMP233. 3. 肌苷酸及鸟苷酸肌苷酸及鸟苷酸( (特鲜味精特鲜味精) )4. 4. 辅酶辅酶 NADNAD、NADPNADP、FMNFMNIMP GMP上页下页章首节首24三. 核酸的一级结构及其测定核酸的一级结构核苷酸序列分析上页下页章首25核酸的一级结构n n核酸的一级结构核酸的一级结构是核酸中各核苷酸化学键连接是核酸中各核苷酸化学键连接方式即核苷酸排列顺序。方式即核苷酸排列顺序。 n n核苷酸通过核苷酸通过3 3 ，5 5 - -磷酸二酯键连接起来，磷酸二酯键连接起来，以磷酸以磷酸- -糖糖- -磷酸磷酸- -
12、糖糖形成核酸骨架形成核酸骨架上页下页章首节首553326核酸的表示方式核酸的表示方式DNA RNA5PdAPdCPdGPdTOH35PAPCPGPUOH或5ACGTGCGT35ACGUAUGU3 ACGTGCGT ACGUAUGUT53OH U53OH OH OH OH OH 若不特别注明，一般规定从5端书写至 3端 上页下页章首节首28 核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料，经水解，测定核苷酸组成及比例。酸为材料，经水解，测定核苷酸组成及比例。先以先以外切酶外切酶确定确定5 5 - -或或3 3 - -末端核苷酸，再末端核苷酸，再以以内切酶内切酶将核酸
13、链分为若干寡核苷酸段，分将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷酸组成、比例和序列。最后将核段测定核苷酸组成、比例和序列。最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个核酸苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个核酸分子的核苷酸序列。分子的核苷酸序列。核酸序列分析上页下页章首节首29DNA酶法测序n n1977年sanger发明末端终止法测定DNA序列n n根据sanger测序法，现在已经有各种DNA自动测序仪，DNA测序速度大大加快HGP得以提前完成上页下页章首节首31DNA酶法测序上页下页章首节首32DNA酶法测序上页下页章首节首平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷
14、酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列,如下图所示： 33DNA酶法测序上页下页章首节首34DNA酶法测序上页下页章首节首35四. DNA的高级结构n nDNADNA的二级结构的二级结构n nDNADNA的三级结构的三级结构上页下页章首36DNA的二级结构n nDNADNA的二级结构是的二级结构是双螺旋双螺旋结构结构，即两条多聚核苷，即两条多聚核苷酸链围绕一个共同轴，酸链围绕
15、一个共同轴，相互盘绕在一起构成直相互盘绕在一起构成直径径 2nm2nm的双螺旋，的双螺旋，互补的互补的碱基碱基(A(A和和T T互补互补 ，G G和和C C互互补补) )通过氢键连接在螺旋通过氢键连接在螺旋内部，碱基平面垂直于内部，碱基平面垂直于右旋的螺旋轴。螺旋结右旋的螺旋轴。螺旋结构中两条链走向相反构中两条链走向相反上页下页章首节首2.0 nm小小沟沟大大沟沟37DNA的二级结构类型上页下页章首节首B B型结构型结构 两条链反向平行，右手螺两条链反向平行，右手螺旋旋 碱基在内（碱基在内（A AT T，GCGC）碱基平面垂直于螺旋轴碱基平面垂直于螺旋轴 戊糖在外，双螺旋每转一戊糖在外，双螺旋
16、每转一周为周为1010碱基对（碱基对（bpbp）A A型结构型结构 碱基平面倾斜碱基平面倾斜2020，螺旋变，螺旋变粗变短，螺距粗变短，螺距2 23nm3nm。Z Z型结构型结构 左手螺旋，只有小沟左手螺旋，只有小沟38稳定DNA双螺旋结构的三种力量1.1.氢键：氢键：使四种碱基形成特异配对关系，使四种碱基形成特异配对关系，G-CG-C间可形成间可形成3 3对氢键，对氢键，A-TA-T之间有两对氢键之间有两对氢键 。2.2.疏水相互作用：疏水相互作用：轴向平行相邻的碱基平面自轴向平行相邻的碱基平面自发地相互靠近，从而使碱基缔合、层层堆积，发地相互靠近，从而使碱基缔合、层层堆积，形成了碱基堆积力
17、形成了碱基堆积力 ，它是使，它是使DNADNA结构稳定的结构稳定的主要力量。主要力量。 3.3.离子键：离子键：磷酸残基上的负电荷与介质中的正磷酸残基上的负电荷与介质中的正离子，如离子，如NaNa+ +，K K+ +，g g等之间形成的离子键。等之间形成的离子键。上页下页章首节首41n n核酸的三级结构指链状核酸分子的空间核酸的三级结构指链状核酸分子的空间构型，即其三维空间排列或组合方式。构型，即其三维空间排列或组合方式。DNA的三级结构上页下页章首节首42n nDNA的三级结构主要有以下三种：DNA的三级结构上页下页章首节首43n n回文结构与镜像结构回文结构与镜像结构特殊DNA的结构上页下
18、页章首节首44n n回文结构中的单链可形成发夹结构回文结构中的单链可形成发夹结构特殊DNA的结构上页下页章首节首45n n双链回文结构可形成十字架结构双链回文结构可形成十字架结构特殊DNA的结构上页下页章首节首46DNA和基因组n nDNA通过自我复制合成出完全相同的分子，从而将遗传信息由亲代传到子代。n n转录，以DNA为模板合成RNA的过程，碱基配对。n nmRNA用于指导蛋白质的合成，mRNA的核苷酸的序列决定了蛋白质的氨基酸序列；47中心法则中心法则48几个基本概念n n遗传学将DNA分子中最小的功能单位称作基因n n基因:能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）的DNA序列。n n为
19、RNA或蛋白质编码的基因称结构基因n nDNA中还有一些只有调节功能，而并不转录生成RNA的片断称调节基因。n n某生物体所含有的全部基因称该生物体的基因组。49原核生物基因组特点n n大多为结构基因n n串联基因n n基因重叠50真核生物基因组特点n n重复序列n n断裂基因51五五. RNA. RNA的高级结构的高级结构n nRNARNA的二级结构的二级结构n nRNARNA的三级结构的三级结构上页下页章首52RNARNA的二级结构的二级结构n nRNARNA的二级结构基本上是单股分子，其二级结的二级结构基本上是单股分子，其二级结构比构比DNADNA简单的多，但也存在少数碱基配对区简单的多
20、，但也存在少数碱基配对区域即双螺环结构。域即双螺环结构。R RN NA A单单链链的的折折叠叠 上页下页章首节首53（1 1 1 1）占总）占总）占总）占总RNARNARNARNA的的的的15151515（2 2 2 2）一种氨基酸对应最少一）一种氨基酸对应最少一）一种氨基酸对应最少一）一种氨基酸对应最少一种种种种RNARNARNARNA（3 3 3 3）分子中含有较多修饰成分子中含有较多修饰成分子中含有较多修饰成分子中含有较多修饰成分分分分（4 4 4 4） 3 3 3 3 - - - -末端都具有末端都具有末端都具有末端都具有CCAOHCCAOHCCAOHCCAOH结构结构结构结构（5 5
21、 5 5）半数碱基可经过自身回）半数碱基可经过自身回）半数碱基可经过自身回）半数碱基可经过自身回折，形成局部双螺旋折，形成局部双螺旋折，形成局部双螺旋折，形成局部双螺旋“ “茎茎茎茎” ” 结构，其间是单链形成结构，其间是单链形成结构，其间是单链形成结构，其间是单链形成的的的的“ “环环环环” ”。绝大多数。绝大多数。绝大多数。绝大多数tRNAtRNAtRNAtRNA经过这样的折叠形成经过这样的折叠形成经过这样的折叠形成经过这样的折叠形成4 4 4 4个茎个茎个茎个茎和和和和4 4 4 4个环组成的特征性三叶个环组成的特征性三叶个环组成的特征性三叶个环组成的特征性三叶草形二级结构草形二级结构草
22、形二级结构草形二级结构 。上页下页章首节首1、tRNA54占总占总占总占总RNARNARNARNA的的的的80808080上页下页章首节首2、rRNA原核生物原核生物真核生物真核生物核糖体核糖体rRNArRNA核糖体核糖体rRNArRNA 30s 30s70s70s 50s 50s16s16s5s 5s 、23s23s 40s 40s80s80s 50s 50s 18s18s5s5s、5.8s5.8s、28s28s5sRNA5sRNA的二级结构的二级结构55占总占总占总占总RNARNARNARNA的的的的3 3 3 35 5 5 5上页下页章首节首3、mRNA和hnRNAn n真核细胞真核细胞
23、真核细胞真核细胞mRNAmRNAmRNAmRNA的的的的3 3 3 3 - - - -末端有一段长达末端有一段长达末端有一段长达末端有一段长达200200200200个核苷酸左右个核苷酸左右个核苷酸左右个核苷酸左右的聚腺苷酸的聚腺苷酸的聚腺苷酸的聚腺苷酸( ( ( (polyA)polyA)polyA)polyA)，称为称为称为称为 “ “尾结构尾结构尾结构尾结构” ” ，5 5 5 5 - - - -末端有末端有末端有末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为一个甲基化的鸟苷酸，称为一个甲基化的鸟苷酸，称为一个甲基化的鸟苷酸，称为” ” 帽结构帽结构帽结构帽结构“ “ 。56占总占总占总占总RNARNA
24、RNARNA的的的的3 3 3 35 5 5 5上页下页章首节首3、mRNA和hnRNA原核生物原核生物mRNAmRNA特征特征： 先导区先导区+ +翻译区（多顺反子）翻译区（多顺反子）+ +末端序列末端序列真核生物真核生物mRNAmRNA特征特征： “帽子帽子”（m m7 7G-5ppp5-N-3pG-5ppp5-N-3p）+ +单顺反子单顺反子+ +“尾巴尾巴”（Poly APoly A）57原核细胞原核细胞mRNAmRNA的结构特点的结构特点53顺反子顺反子顺反子顺反子顺反子顺反子插入顺序插入顺序插入顺序插入顺序先导区先导区末端顺序末端顺序58真核细胞真核细胞mRNAmRNA的结构特点的
25、结构特点AAAAAAA-OH5“帽子帽子”PolyA 3顺反子顺反子m7G-5ppp-N-3 p59n n在在tRNAtRNA二级结构二级结构中未配对的某些中未配对的某些并不互补的碱基并不互补的碱基参与了三级结构参与了三级结构中特殊的氢键作中特殊的氢键作用，用，tRNAtRNA链中的链中的核糖核糖- -磷酸骨架与磷酸骨架与某些碱基甚至其某些碱基甚至其他的骨架之间也他的骨架之间也能产生作用能产生作用。 RNARNA的三级结构的三级结构上页下页章首节首60六六. .核酸和核苷酸的理化性质核酸和核苷酸的理化性质n n核核苷苷是是无无色色的的晶晶体体或或粉粉末末，熔熔点点较较高高。在在水水中中的的溶溶
26、解解度度嘧嘧啶啶核核苷苷比比嘌嘌呤呤核核苷苷大大，在在有有机机溶溶剂剂中中一一般般不不溶溶解解。由由于于戊戊糖糖有有不不对对称称的的C C原原子子，使使其其具有旋光性。具有旋光性。 n n天天然然DNADNA分分子子长长度度可可达达几几厘厘米米，而而分分子子直直径径只只有有2020埃埃米米。这这种种细细丝丝状状的的双双螺螺旋旋结结构构赋赋于于DNA DNA 一一系列显著的系列显著的物理化学特性物理化学特性。n n 由于由于RNARNA分子比分子比DNADNA短短 而且小的多而且小的多, ,只有部分只有部分双螺旋结构区，呈不定形，没有像双螺旋结构区，呈不定形，没有像 DNADNA那样明显那样明显
27、的物理、化学特性。的物理、化学特性。上页下页章首61n n沉降特性沉降特性n n高分子量高分子量n n高粘度高粘度n n紫外吸收紫外吸收n n酸碱性质酸碱性质n n变性复性变性复性核酸和核苷酸的理化性质核酸和核苷酸的理化性质上页下页章首节首62n n溶液中的核酸在引力场中可以下沉，在超溶液中的核酸在引力场中可以下沉，在超速离心机造成的极大的引力场下，核酸分子速离心机造成的极大的引力场下，核酸分子下沉的速率大大加快。应用超速离心技术，下沉的速率大大加快。应用超速离心技术，可以测定核酸的沉降常数、分子量和构象。可以测定核酸的沉降常数、分子量和构象。测定测定DNADNA分子量时，由于它的粘度大，应采
28、用分子量时，由于它的粘度大，应采用其稀溶液。其稀溶液。沉降特性沉降特性上页下页章首节首63n n目前核酸的分子量用电子显微镜照相，放射自目前核酸的分子量用电子显微镜照相，放射自显影凝胶电泳等技术来测定。显影凝胶电泳等技术来测定。n n部分核酸分子量和核苷酸数：部分核酸分子量和核苷酸数：类别类别mRNAmRNAtRNAtRNArRNArRNA果蝇巨果蝇巨染色体染色体E.ColiE.Coli染色体染色体人第人第1313对染色对染色体体分子量分子量2.5*102.5*104 410106 6230002300030000300001.1*101.1*106 68*108*1010102.2*102.
29、2*109 96.4*106.4*101010核苷酸数核苷酸数753007530073937393310031002.4*102.4*108 86*106*106 61.9*101.9*108 8高分子量高分子量上页下页章首节首64n nDNADNA的粘度比的粘度比RNARNA的大得多。当核酸溶液因的大得多。当核酸溶液因受热或在其他因素作用下发生螺旋向线性受热或在其他因素作用下发生螺旋向线性过渡时，粘度会降低。过渡时，粘度会降低。高粘度高粘度上页下页章首节首65n n由于核酸组分嘌呤和嘧啶具有强烈的紫外吸收性能，所以核酸也有强烈的紫外吸收，最大吸收值在260nm处。这可作为核酸及其组份定性和定
30、量测定的依据。紫外吸收紫外吸收上页下页章首节首66酸碱性质酸碱性质上页下页章首节首 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有核酸具有两性电离的性质两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNADNA的的pIpI约约为为4 45 5，RNARNA的的pIpI约为约为2.02.02.52.5，在，在pH7pH78 8电泳时电泳时泳向正极。泳向正极。67n n在一定物化因素在一定物化因素( (热、酸、碱热、酸、碱 作用下作用下) )，DNADNA分子内的分子内的氢键断
31、裂，氢键断裂，双螺旋结构解开双螺旋结构解开，发生变性。，发生变性。 n nRNARNA仅局部呈双螺旋结构，其螺旋形结构向线团形结仅局部呈双螺旋结构，其螺旋形结构向线团形结构转化不如构转化不如DNADNA明显。明显。n n核酸降解、变性时，其对紫外吸收增加，这种现象核酸降解、变性时，其对紫外吸收增加，这种现象称为增色效应称为增色效应n n变性变性DNADNA在适当条件下在适当条件下( (如缓慢冷却如缓慢冷却) )可使两条分开的可使两条分开的链重新缔合成双螺旋结构，这过程叫复性。复性过程链重新缔合成双螺旋结构，这过程叫复性。复性过程产生减色效应产生减色效应 变性与复性变性与复性上页下页章首节首68
32、七.核酸的分离提取和纯化n nDNA的分离n nRNA的分离n n核酸含量测定：定磷法紫外线吸收法定糖法n n核酸的纯化及其要求上页下页章首71n n 核核蛋蛋白白的的提提取取：真真核核细细胞胞中中DNADNA常常和和组组蛋蛋白白结结合合以以核核蛋蛋白白形形式式存存在在，把把真真核核细细胞胞捣捣碎碎后后加加入入0.9%NaCl0.9%NaCl和和0.01M0.01M柠柠檬檬酸酸钠钠溶溶液液，使使DNADNA蛋蛋白白质质沉淀，而柠檬酸钠是起抑制沉淀，而柠檬酸钠是起抑制DNADNA的降解作用。的降解作用。n n核核酸酸与与蛋蛋白白质质的的分分离离：利利用用核核蛋蛋白白溶溶于于1mol 1mol /
33、L /L NaClNaCl的的性性质质，将将其其从从细细胞胞匀匀浆浆中中分分离离出出来来，用用饱饱和和苯苯酚酚等等溶溶剂剂与与上上述述核核蛋蛋白白共共振振，冰冰冻冻离离心心。 DNADNA溶溶于于上上层层水水相相中中，变变性性蛋蛋白白留留在在酚酚层层内内。在在水水相相加加入入2.52.5倍倍体体积积无无水水乙乙醇醇，将将其其沉沉淀淀出出来来，再再以以核核酸酸酶酶水水解解以以除除去去RNARNA。最最后后借借助助密密度度梯梯度度平衡超速离心法或层析柱法，分离平衡超速离心法或层析柱法，分离DNADNA。DNADNA的分离的分离上页下页章首节首72 DNA DNA的精制：制得的的精制：制得的DNAD
34、NA中还含少量蛋白质中还含少量蛋白质等杂质，将它溶解在蒸馏水中，加入阴离子等杂质，将它溶解在蒸馏水中，加入阴离子去污剂硫酸十二酯钠进一步作用于去污剂硫酸十二酯钠进一步作用于DNADNA和蛋和蛋白，使蛋白质与核酸分离而沉淀，通过高速白，使蛋白质与核酸分离而沉淀，通过高速离心去掉蛋白质，在上层离心去掉蛋白质，在上层DNADNA溶液加入溶液加入95%95%乙乙醇沉淀醇沉淀DNADNA，经过乙醇重复洗几次，可得，经过乙醇重复洗几次，可得DNADNA精制品。精制品。上页下页章首节首73n n 核蛋白的提取：将细胞破碎制成匀浆，再核蛋白的提取：将细胞破碎制成匀浆，再用用0.14mol /L NaCl0.1
35、4mol /L NaCl溶液将细胞质的核糖核溶液将细胞质的核糖核蛋白体抽提出来，留下含蛋白体抽提出来，留下含DNADNA的细胞核组织，的细胞核组织，核糖核蛋白可在核糖核蛋白可在pH4.5pH4.5溶液中沉淀析出。溶液中沉淀析出。n n 核酸和蛋白质的分离：含水的酚能沉淀蛋核酸和蛋白质的分离：含水的酚能沉淀蛋白质，核酸和多糖则溶于水层。水层中的白质，核酸和多糖则溶于水层。水层中的RNARNA和多糖可被乙醇沉淀，将沉淀再溶于磷和多糖可被乙醇沉淀，将沉淀再溶于磷酸盐缓冲液，然后用酸盐缓冲液，然后用 - -甲氧乙醇抽提甲氧乙醇抽提RNARNA，用乙醇沉淀得用乙醇沉淀得RNARNA。RNARNA的分离的
36、分离上页下页章首节首74 RNA RNA的精制：的精制： 在粗制的在粗制的RNARNA中加入磷酸盐，中加入磷酸盐，醋酸盐，乙二醇甲醚并搅拌，使多糖类物醋酸盐，乙二醇甲醚并搅拌，使多糖类物质溶于水里，质溶于水里，RNARNA溶于乙二醇甲醚内，静置溶于乙二醇甲醚内，静置分层。从上层乙二醇甲醚取出加醋酸钠，分层。从上层乙二醇甲醚取出加醋酸钠，用十六烷基三甲基溴化胺盐使用十六烷基三甲基溴化胺盐使 RNA RNA 沉淀，沉淀，经离心分离得经离心分离得RNARNA。 上页下页章首节首75n n将试剂用浓硫酸或过氯酸消化，使核酸磷转将试剂用浓硫酸或过氯酸消化，使核酸磷转化成为无机磷酸。磷酸能与钼酸铵反应生成
37、化成为无机磷酸。磷酸能与钼酸铵反应生成磷钼酸铵，它在还原剂存在下，可被还原生磷钼酸铵，它在还原剂存在下，可被还原生成钼蓝，再通过测定无机磷酸测定核酸。成钼蓝，再通过测定无机磷酸测定核酸。n n通常通常RNARNA平均含磷平均含磷9.4%,9.4%,而而DNADNA含磷含磷9.9% 9.9% 。这。这样可从含磷量推算出核酸的含磷量。样可从含磷量推算出核酸的含磷量。定磷法定磷法上页下页章首节首76n n利用核酸组分嘌呤环、嘧啶环具有紫外吸利用核酸组分嘌呤环、嘧啶环具有紫外吸收的特性，在收的特性，在260nm260nm下，每下，每mlml含含1 1 g DNAg DNA的的消光值消光值(O.D.(O
38、.D.260260) )为为0.0200.020，每，每mlml含含1ug RNA1ug RNA的消光值为的消光值为 0.0220.022，由未知溶液的消光值可，由未知溶液的消光值可计算出其中核酸含量。计算出其中核酸含量。紫外线吸收法紫外线吸收法上页下页章首节首77n nRNARNA与浓硫酸共热会降解，生成的核糖进而转与浓硫酸共热会降解，生成的核糖进而转化为糖糠，它与地衣酚在化为糖糠，它与地衣酚在CuClCuCl2 2或或FeClFeCl3 3催化下催化下反应呈鲜绿色，在反应呈鲜绿色，在670nm670nm处呈现最大光吸收。处呈现最大光吸收。n nDNADNA经加热酸解后，水解所得的脱氧核糖转变经加热酸解后，水解所得的脱氧核糖转变为为-羟羟-酮戊醛，再与二苯胺生成蓝色物酮戊醛，再与二苯胺生成蓝色物质。在质。在595nm595nm处呈现最大光吸收。处呈现最大光吸收。n nRNARNA和和DNADNA在在2020020200 g/mlg/ml浓度时，光密度与核浓度时，光密度与核酸的浓度呈正比。酸的浓度呈正比。定糖法定糖法上页下页章首节首78为保持核酸的生物活性，分离、分析必须在温和条件下进行，防止过酸、过碱、强烈搅拌。上页章首节首79
