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1、 主要内容主要内容 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒 荧荧光定量光定量PCR技技术术 HBV-DNA与与临临床床乙肝：乙肝：是指由是指由乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒引起的，以肝脏损引起的，以肝脏损害为主的一组全身性传染病。害为主的一组全身性传染病。临床表现：临床表现：以疲乏、食欲减退、厌油、肝功能异以疲乏、食欲减退、厌油、肝功能异常为主，部分病例呈现黄疸。常为主，部分病例呈现黄疸。一、形一、形态态和生物学特性：和生物学特性：HBV 感染者血清中存在三种形式的病毒感染者血清中存在三种形式的病毒颗颗粒：粒：大球形大球形颗颗粒（粒（Dane）：完整的病毒）：完整的病毒颗颗粒，含量最少粒，含量最少 包膜：包膜：H
2、BsAg，糖蛋白，脂，糖蛋白，脂质质 核心：核心：DNA，DNA聚合聚合酶酶，HBcAg 是病毒复制的主体。是病毒复制的主体。小球形小球形颗颗粒：粒： 仅仅HBsAg ，无核酸，无感染性，含量最多，无核酸，无感染性，含量最多管形管形颗颗粒：粒：仅仅HBsAg ，无核酸，无感染性，无核酸，无感染性HBV抵抗力很抵抗力很强强，在血清中，在血清中30-32可保存可保存6个月，个月，-20可保存可保存15年。年。电镜下HBV颗粒HBV病毒结构示意图HBV基因组结构，1979年二、基因组结构和编码蛋白二、基因组结构和编码蛋白根据HBV全基因序列差异8%或S区基因序列差异4%，目前HBV分为A-H八个基因
3、型。各基因型又可分为不同亚型。我国主要是B和C。IFN治疗HBV应答率：AD，BC，A、DB、C基因型是否影响核苷类似物的疗效尚未确定。6510h、煮沸10min或高压蒸气均可灭活HBV。三、抗原抗体系统三、抗原抗体系统HBsAg是是HBV感感染染的的主主要要标标志志，2-12周周出出现现。只只有有抗抗原原性性，无无传传染性。染性。目前感染，患者或病毒携目前感染，患者或病毒携带带者。者。抗抗-HBs保保护护性抗体，性抗体，曾感染或免疫曾感染或免疫HBeAgHBV复复制制及及强强感感染染性性的的指指标标，仅仅见见于于HBsAg阳阳性性患患者者，HBeAg阳阳性性标标本本HBV DNA检检出出率率
4、90左左右右，两两者者有有着着良良好好的相关性的相关性抗抗-HBe有有一一定定的的保保护护作作用用，感感染染恢恢复复期期，传传染染性性低低，病病情情趋趋于于稳稳定，定，预预后良好后良好抗抗-HBc非非保保护护性性抗抗体体，曾曾感感染染，病病情情趋趋于于稳稳定定。HBcAb-IgM提提示示HBV处处于复制状于复制状态态HBcAg主要存在于主要存在于感染的肝感染的肝细细胞胞核心，血循核心，血循环环中游离的极少。中游离的极少。与与HBV DNA呈正相关，呈正相关，HBV复制及复制及强强感染性的指感染性的指标标。 四、分子生物学标记四、分子生物学标记1.HBV-DNA:主要存在于主要存在于Dane颗颗
5、粒中，是病毒复制和粒中，是病毒复制和传传染性的染性的直接直接标标志。志。2. HBV-DNA多聚多聚酶酶：位于核心部位，血清中：位于核心部位，血清中HBV-DNA多聚多聚酶酶活力是判断病毒复制、活力是判断病毒复制、传传染性高低的指染性高低的指标标之一。之一。1.传传染源染源：急、慢性乙型肝炎患者，病毒携带者；2.传传播途径播途径：母婴传播、血液及血制品传播、破损的皮肤和黏膜及性接触传播，日常工作或生活接触一般不会传染 HBV ；经吸血昆虫传播未证实；3.易感人群易感人群：抗HBs阴性者。婴幼儿是获得HBV感染的最危险时期。全球20亿曾感染HBV，慢性HBV感染者3.5亿我国属 HBV 感染高流
6、行区，一般人群 HBsAg阳性率为9.09%，总感染率为57.6%（包括既往感染和现症感染）。接种与未接种乙型肝炎疫苗人群的HBsAg阳性率分别为4.51%和9.51%。男性高于女性，有家庭聚集现象，婴幼儿感染多见。8/31/202414急性急性急性急性HBVHBVHBVHBV感染感染感染感染慢性乙肝慢性乙肝慢性乙肝慢性乙肝肝硬化肝硬化肝硬化肝硬化肝癌肝癌肝癌肝癌失代偿期肝硬化失代偿期肝硬化5年病死率70-86%代偿期肝硬化代偿期肝硬化5年病死率14-20%青少年和成人期5-10%12-25%5年6-15%5年25-30%婴幼儿期发生肝硬化的高危因素包括：病毒载量高、HBeAg持续阳性、ALT
7、水平高或反复地波动、嗜酒、合并HCV、HDV或HIV感染等。HBeAg阳性患者的肝硬化发生率要高于 HBeAg 阴性者HBV感染是HCC的重要相关因素。肝硬化患者发生HCC高危因素包括：男性、年龄、嗜酒、黄曲霉素、合 并 HCV或 HDV感 染 、 持 续 肝 脏 炎 症 、 持 续HBeAg阳性及HBV DNA持续高水平等免疫清除期免疫清除期免疫清除期免疫清除期非活动或非活动或非活动或非活动或低复制期低复制期低复制期低复制期再活动期再活动期再活动期再活动期不治疗不治疗但应检测但应检测免疫耐受免疫耐受免疫耐受免疫耐受需治疗需治疗不治疗不治疗但应检测但应检测需治疗需治疗HBV携带者携带者HBsA
8、g(+)HBeAg(+)/抗-HBe(-)HBV DNA +ALT 肝活检 -慢乙肝慢乙肝HBsAg(+)HBeAg(+)/抗-HBe(-)HBV DNA + ALT/AST + 肝活检 +HBeAg(-)(-)慢乙肝慢乙肝HBeAg(-)/抗-HBe(+)HBV DNA +ALT + 肝活检 +非活动状态非活动状态HBsAg携带者携带者HBeAg(-)/抗-HBe(+)HBV DNA -ALT/AST - 肝活检 -乙肝或HBsAg阳性史超过6个月，现HBsAg和/或HBV DNA仍阳性者，可诊断为慢性HBV感染慢性慢性乙型肝炎乙型肝炎隐匿性隐匿性慢性乙肝慢性乙肝乙型肝炎乙型肝炎肝硬化肝硬化
9、 携带者携带者 慢性HBV携带(耐受)非活动性HBsAg携带HBeAg(+)HBeAg(-)慢性慢性HBV感染感染代偿期失代偿期HBsAg(-)，HBV DNA(+)根据肝功能损害程度分为轻度/中度/重度分为活动期/静止期ALT正常（一）携带者 大三阳或小三阳， HBV DNA为阳性或阴性，但 1 年内连续随访 3 次以上 ALT和AST均在正常范围，肝组织学检查无异常（二） 慢性乙型肝炎 大三阳或小三阳，HBV DNA阳性，血清ALT持续或反复升高，或肝组织学检查有肝炎病变 (三)隐匿性慢性乙型肝炎 - 血 清 HBsAg阴 性 ， 但 血 清 和 (或 )肝 组 织 中 HBV DNA 阳
10、 性 ， 并 有 慢 性 乙 型 肝 炎 的 临 床 表 现 。 患 者 可 伴 有血清抗-HBs、抗-HBe和(或)抗-HBc阳性 - 另约20%隐匿性慢性乙型肝炎患者除HBV DNA阳性 外，其余HBV血清学标志均为阴性 - 诊断需排除其他病毒及非病毒因素引起的肝损伤 HBsAg和和HBeAg均阳性而均阳性而HBV DNA阴性？阴性？干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。 “大大三三阳阳”、“小小三三阳阳”、“携携带带者者”等等免免疫疫学学指指标标反
11、反应应的的是是机机体体的的免免疫疫反反应应状状态态，不不能能反反应应体体内内病病毒毒复复制制水水平平与与感感染染程程度度。血血清清学学指指标标()不不能能排排除除HBV感感染染。因因此此，要要准准确确知知道道HBV是是否否处处于于复复制制状状态态，最最准准确确的的方方法法还还是是通通过过检检测测HBV DNA来来决决定定。HBV DNA是是HBV本本身身的的遗遗传传物物质质，是是病病毒毒存存在在和和复复制制的的最最可可靠靠、最最直直 接接 的的 指指 标标 ， 也也 是是 患患 者者 具具 有有 传传 染染 性性 的的 标标 志志 。荧光定量PCR技术荧荧光定量光定量PCR技技术术Polyme
12、rase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶（TaqDNA聚合酶）的作用，经过高温高温变变性、低性、低温退火、适温延伸温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内反复循环30-40次，把特定的DNA片段扩增1000万倍。 每个PCR体系含4种主要成分：含有待含有待扩扩增序列的增序列的DNA模板模板引物引物TaqDNA聚合聚合酶酶脱氧核糖核酸三磷酸（脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP） 实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物
13、的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。PCRPCR反应过程反应过程5533d.NTPsTaq 酶酶Primers5353535353535353反应组分反应组分变变 性性535353535353延延 伸伸53535353353TaqTaq55重重 复复退退 火火5353535355335353循环循环2 24 4个拷贝个拷贝循环循环3 38 8个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353TaqMan探针5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反应体系反应体系变变 性
14、性535353535353Taql53RQProbe53RQ535353RQ退 火531. 链取代Taq3QR5533QTaqR52. 水 解3. 聚 合53QTaqR354. 检测荧光533QTaqR5l每产生一条DNA链，就切断一条探针每切断一条探针，就产生一个荧光信号信号强度与结合探针的DNA分子数成正比原理图原理图血清标本采集一次性无菌注射器抽取受检者静脉血一次性无菌注射器抽取受检者静脉血3-53-5毫升，注入红帽无菌管中毫升，注入红帽无菌管中室温（室温（222225C25C）放置）放置303060 60 分钟分钟血标本使用水平离心机，血标本使用水平离心机，40004000转转/ /分
15、，离心分，离心5 5分钟分钟吸取上层血清，转移至吸取上层血清，转移至1.5ml1.5ml灭菌离心管灭菌离心管 严禁使用肝素抗凝血标本，抑制严禁使用肝素抗凝血标本，抑制PCRPCR反应反应结果分析常用指标常用指标 免疫学检查免疫学检查 病毒学检查病毒学检查 肝功能检查肝功能检查指标指标HBsAg抗抗-HBsHBeAg抗抗-HBe抗抗-HBc诊断诊断结结果果+大三阳，急性或慢性现症感染，大三阳，急性或慢性现症感染，传染性强传染性强+小三阳，有无传染性应结合小三阳，有无传染性应结合HBV DNA检测结果检测结果+HBV感染恢复期，或感染恢复期，或S基因突变，基因突变，+急性肝炎早期，传染性强急性肝炎
16、早期，传染性强+既往感染，有无传染性需结合既往感染，有无传染性需结合HBV DNA+感染恢复期，有免疫力，无传染感染恢复期，有免疫力，无传染性性+窗口期，抗窗口期，抗-HBs即将出现；即将出现；HBV感染已过感染已过+注射疫苗后；注射疫苗后；遥远的过去有遥远的过去有过过HBV感染感染免疫学检查免疫学检查-乙肝五项分析乙肝五项分析 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA103copy/ml) 乙肝病毒基因型检测乙肝病毒基因型检测 乙肝病毒基因型变异检测乙肝病毒基因型变异检测病毒学检查病毒学检查肝功能检查肝功能检查 - ALT、AST：一般可反映肝细胞损伤程度，最常用 - 血清胆红素(BI
17、L)：通常与肝细胞坏死程度有关 - 凝血酶原时间(PT)：反映肝脏凝血因子合成功能 - 胆碱酯酶(ChE)：反映肝脏合成功能，可作参考 - 白蛋白(ALB)：反映肝脏合成功能，A/G可作参考 - 甲胎蛋白(AFP)：出现明显升高往往提示发生HCC目前极少能治愈！是可以治疗的！病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体能治愈吗？ 谁需要治疗？谁需要治疗？不不论论是大三阳是大三阳还还是小三阳，有以下情况者均需治是小三阳，有以下情况者均需治疗疗：肝功能异常。肝功能异常。有明有明显显的肝炎症状：乏力、的肝炎症状：乏力、厌厌食、黄疸、肝区食、黄疸、肝区隐隐痛不适痛不适等。等。HBV DNA103copy/ml)抗
18、抗病病毒毒：目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到50左右。目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类： 干干扰扰素素：重组人-1b干扰素、- 2a、 -2b干扰素等。 核苷核苷类类似物似物：拉米夫定、阿德福韦。调节免疫调节免疫保肝降酶保肝降酶乙型肝炎治疗原则改善症状，恢复肝功能；改善症状，恢复肝功能；抗病毒；抗病毒；抗肝纤维化，延缓肝硬化的发生；抗肝纤维化，延缓肝硬化的发生；预防和监控肝癌；预防和监控肝癌；无症状携带者无需抗病毒治疗。无症状携带者无需抗病毒治疗。疫苗预防疫苗预防阻断母婴传播阻断母婴传播避免医源性传播避免医源性传播
19、乙型肝炎疫苗预防 - 自2005年6月，我国新生儿HBV疫苗接种完全免费 -乙 肝 疫 苗 接 种 对 象 主 要 是 新 生 儿 ， 其 次 为 婴 幼 儿 和高危人群。全程共3针，按照0、1、6个月程序 -新 生 儿 要 求 在 出 生 后 24hr内 接 种 。 单 用 疫 苗 阻 断母婴传播保护率87.8%，联合 HBIG 保护率95-97% - 接种后有抗体应答者保护效果一般至少持续12年传播途径预防： 大 力 推 广 安 全 注 射 (包 括 针 刺 的 针 具 )， 对 牙 科 器 械 、 内 镜 等 医 疗 器 具 应 严 格 消 毒 ； 严 格 防 止 医 源 性 传 播 ；
20、 理 发 、 刮 脸 、 修 脚 、 穿 刺 和 纹 身 等 用 具 应 严 格 消 毒 ； 注 意 个 人 卫 生 ， 不 共 用 剃 须 刀 和 牙 具等用品；进行正确性教育；对HBsAg阳性孕妇， 应 避 免 羊 膜 腔 穿 刺 ， 并 缩 短 分 娩 时 间 ， 保 证 胎 盘 的完整性，尽量减少新生儿暴露于母血的机会意外暴露HBV后预防 - 血 清 学 检 测 ： 立 即 检 测 HBsAg、 抗 -HBs、 ALT等 ， 并在3和6个月内复查。 - 主 动 和 被 动 免 疫 ： 如 已 接 种 过 乙 肝 疫 苗 ， 且 已 知 抗 -HBs10mIU/ml者 ， 可 不 进 行
21、 特 殊 处 理 。 如 未 接 种 过 疫 苗 或 虽 接 种 过 疫 苗 但 抗 -HBs 10mIU/ml 或 抗 -HBs水 平 不 详 ， 应 立 即 注 射 HBIG200-400IU， 并 同 时 在 不 同 部 位 接 种 第 1针 乙 肝 疫 苗 20g， 于 1 和6个月后分别接种第2针和3针乙肝疫苗各20g。对患者和携带者的管理 - 对 慢 性 HBV携 带 者 及 HBV患 者 ， 除 不 能 献 血 和 国 家 法 律 规 定 不 能 从 事 的 特 殊 职 业 (如 服 兵 役 等 ) 以外，可照常生活、学习和工作，但要加强随访。 - 乙 肝 患 者 和 携 带 者
22、 的 传 染 性 ， 主 要 取 决 于 血 液 中 HBV DNA水平，与血清ALT/AST或胆红素水平无关。乙肝母婴传播的三种途径：乙肝母婴传播的三种途径：（1）宫内传播：是分娩以前在宫内通过胎盘等途径传播，这种情况较少。（2）产时传播：发生在分娩过程中，由于母亲产道的血液、羊水和阴道分泌物中带有乙肝病毒，会使婴儿经口吞入或通过破损的皮肤黏膜而受传染，这种情况占绝大多数。（3）产后传染：有可能通过哺乳或密切接触等途径传播，这种传播属于水平传播，比较常见。乙肝患者怀孕的时机及注意事项：乙肝患者怀孕的时机及注意事项： 乙肝患者一定要在肝功能正常、HBV-DNA阴性，维持半年以上怀孕。一旦怀孕，
23、应终止使用各种具有肝毒性的药物，定期到医院进行孕期体检。合理调整饮食结构，主张均衡营养，避免体重增长过快，形成脂肪肝或造成肝脏负担。HBsAg阳性孕阳性孕妇妇分娩分娩时应时应采取的采取的预预防措施：防措施：分娩后对胎儿复苏动作应轻，防止损伤咽黏膜，造成感染。避免婴儿吞下可被污染的液体。如果孕妇HBsAg阳性，伴有HBeAg者，行剖腹产，避免胎儿经产道时吞入被污染的阴道分泌物。HBsAg阳性孕产妇儿童应采取预防措施：阳性孕产妇儿童应采取预防措施：乙肝表面抗原阳性孕产妇所生的新生儿，在出生后24小时内注射乙肝免疫球蛋白（100国际单位），并按照国家免疫规划要求，完成24小时内及1月龄合6月龄儿童的三次乙肝疫苗接种。等宝宝周岁到医院复查。乙肝乙肝妈妈妈妈母乳喂养有何禁忌：母乳喂养有何禁忌：肝功能正常、HBV-DNA阴性，孩子注射过乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗的情况才可以喂奶。但若婴儿口腔、咽喉、食道、胃肠粘膜等处有破损、溃疡或母亲乳头破裂者也应该尽可能避免给孩子哺乳。欢 迎 指 正
