系统获得抗病性基因转化烟草系统获得抗病性基因转化烟草的研究的研究• • • 导师：邓晓玲导师：邓晓玲 副教授副教授• • 学生：谢盛红学生：谢盛红 郭明郭明 概述•本研究是将系统获得抗病性的调控基因本研究是将系统获得抗病性的调控基因NPR1NPR1通过农杆菌介导，利用叶盘转化法通过农杆菌介导，利用叶盘转化法使农杆菌介导的使农杆菌介导的NPR1NPR1基因与烟草叶盘共基因与烟草叶盘共培养，通过诱导生芽、生根，获得再生培养，通过诱导生芽、生根，获得再生细菌植株，经细菌植株，经PCRPCR检测检测2424株再生植株，检株再生植株，检测结果表明有测结果表明有4 4株含有目的基因株含有目的基因NPR1NPR1，说，说明已经将系统获得抗病性基因明已经将系统获得抗病性基因NPR1NPR1成功成功转入烟草中转入烟草中 目的和基本思路 •本研究是将系统获得抗病性的调控基因NPR1通过农杆菌介导、转入烟草植株内，经PCR检测植株含有目的基因 ，然后进行转基因植株的抗病性测定，检测其是否有广普抗病性。
科学性、先进性及独特之处 •本研究所使用的来自拟南芥的NPR1基因是一种比较新的基因,利用叶盘法将该基因转化到烟草中,使其具有广普抗病性，避免了由于化学防治所带来的3R问题 方法与步骤•1 烟草转化外植体的获得及消毒 •播种 ——网室培养 ——取嫩叶 ——消毒 •2 烟草叶盘及农杆菌对抗菌素羧苄青霉 素 （Carb）、卡那霉素（Kan）的敏感性试验 •3 农杆菌工程菌液的制备 •4 叶盘共培养法转化烟草 4.1 共培养 烟草无菌苗剪成叶盘 ——农杆菌培养液中共培养 ——MS1培养基上培养 4.2 诱导丛生芽 共培养60h——洗掉叶盘表面农杆菌——MS2培养基培养——两周后切下带芽的叶缘插入MS2培养基上继续培养 •4.34.3 诱导生根 四周后 ——叶缘长出的幼芽插入MS3培养基中——诱导生根 •4.4 再生植株的移栽 一个月后 ——将PCR阳性苗移入珍珠岩中，用1/10MS水培培养基培养 ——根系比较发达 ——移入土中栽培 •5 DNA提取 •6 转基因烟草的PCR检测 •PCR反应体系 •ddH2O 15.25µl •PCR buffer(10X) 2.50µl•MgCl2 (25mmol/L) 1.50µl•dNTP mix(10 mmol/L) 1.00µl •NPR1 P1(10µmol/L) 1.50µl•NPR1 P2(10µmol/L) 1.50µl•Taq DNApolymerase(5u/µl) 0.25µl•模板 1.50µl• 25.00µl • PCR 反应程序 • • 95℃ 3 min• • 94℃ 1 min • 55℃ 1 min 30 cycles• 72℃ 3 min • • 72℃ 10 min 实验结果 PCR检测结果Marker ＋ － 1 2 3 4 5 6 7 8L1 DL2000 Marker；+ 阳性对照（农杆菌菌液）； - 阴性对照（非转基因烟草苗）；1-8 部分经过转化的苗一共以1.5µl总DNA为模板进行PCR扩增共检测烟草无菌苗24棵，其中有4棵检测到了特异性条带为PCR阳性苗 •转基因烟草在卡那霉素选择培养基上能正常生长，而未转基因的烟草则不能正常生长 •PCR阳性苗根系发达、生长迅速 附表一• 培养基类型 原 料 MS0（每升）MS1（每升）MS2（每升）MS3（每升）MSMS1000mlMS1000mlMS1000ml1/2MS1000ml6-BA——2.0mg2.0mg——NAA——0.2mg0.2mg——头孢霉素——————250mg羧苄青霉素————250mg——卡那霉素————75mg50mg蔗糖30g30g30g30g植物凝胶—— 2.8g2.8g2.8gPH值5.8 5.85.85.8 附表二•MS混合物 原料大量元素20倍CaCl2100倍Fe盐100倍肌醇200倍微量元素1000倍微生素1000倍Gly 1mg/ml用量（ml/L）5010105112 谢谢大家！ 。