信号转导通路信号转导通路研究策略和常用方法研究策略和常用方法• 搞懂信号通路搞懂信号通路• 查找文献，了解信号系统的研究进展和热点查找文献，了解信号系统的研究进展和热点• 找到研究点找到研究点 功能分析功能分析表达分析表达分析如何分析信号蛋白？如何分析信号蛋白？Ø 何时何地表达何时何地表达Ø 基因过表达，或基因沉默基因过表达，或基因沉默( (细胞水平和整体水平细胞水平和整体水平) ) Ø 相互作用蛋白相互作用蛋白 Ø 立体论证立体论证 Ø 基因水平基因水平Ø 转录水平转录水平Ø 转录后加工转录后加工Ø 翻译水平翻译水平Ø 翻译后加工翻译后加工Ø mRNA mRNA和蛋白质降解和蛋白质降解蛋白质基因表达可以在不同层次上调节蛋白质基因表达可以在不同层次上调节 基因表达分析方法基因表达分析方法启动子分析启动子分析:--- EMSA--- Reporter gene assay--- CHIP assay--- Nuclear Run-on assay--- DNA Foot-printing assay--- DNA truncation and site-directed mutagenesis翻译水平分析翻译水平分析:--- Western Blots--- Immunocytochemistry Immunohistochemistry--- Protein modification--- Proteomics转录水平分析转录水平分析:--- RT-PCR--- Real Time PCR--- In situ hybridization--- Northern blots--- RNase protection assay --- Primer extention assay比较转录组学比较转录组学:--- Differential screening--- Subtractive hybridization--- Differential display--- Array-based methods 1. 蛋白质表达水平和细胞内定位研究蛋白质表达水平和细胞内定位研究 信号蛋白分子表达水平检测信号蛋白分子表达水平检测: Western blot analysis. ELISA Proteomics 信号蛋白分子在细胞内定位研究信号蛋白分子在细胞内定位研究: Immunohistochemistry / Immunocytochemistry Immunofluorescence (IF) Green fluorescent protein (GFP)-fusion protein—typically, live cells. 印迹技术印迹技术 blottingn将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介质上，并加将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介质上，并加以检测分析的技术。
以检测分析的技术n运用：运用：DNA、、RNA、蛋白质的检测、蛋白质的检测n DNA 印迹印迹: Southern blottingRNA 印迹印迹: Northern blotting蛋白质印迹蛋白质印迹: Western blotting n又又称称蛋蛋白白质质印印迹迹技技术术或或免免疫疫印印迹迹技技术术蛋蛋白白质质经经聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳分分离离后后转转移移〔〔电电转转〕〕至至膜膜性性支支持持物物上上(NC(NC膜膜））, ,再与溶液中的抗体相互结合的技术再与溶液中的抗体相互结合的技术n主主要要用用于于检检测测样样品品中中特特异异性性蛋蛋白白质质的的存存在在、、细细胞胞中中特特异异蛋蛋白白质质的的半半定定量量分分析析、、蛋蛋白白质质化化学学修修饰饰〔〔磷磷酸酸化化）），，以以及蛋白质分子间的相互作用研究等及蛋白质分子间的相互作用研究等Western blotting Electrophoresis 转膜转膜 Protein HRPDABH2O21Ab2Ab抽提细胞蛋白，定量抽提细胞蛋白，定量聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳与特异性抗体杂与特异性抗体杂交。
交根据标记物特点显色根据标记物特点显色 硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜目的蛋白质目的蛋白质抗目的蛋白一抗抗目的蛋白一抗标记的二抗标记的二抗偶联的碱偶联的碱性磷酸酶性磷酸酶磷酸化生色体系磷酸化生色体系脱磷酸显色脱磷酸显色采用采用Western blot方法检测蛋白质原理示意图方法检测蛋白质原理示意图 应用举例应用举例n某药物是否可引起目的蛋白的表达变化〔上调或下调）？某药物是否可引起目的蛋白的表达变化〔上调或下调）？n 分别抽提细胞蛋白〔未处理、药物处理），定量分别抽提细胞蛋白〔未处理、药物处理），定量n 相同质量上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳相同质量上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳n 印迹〔电转移）印迹〔电转移）n 杂交〔抗体）杂交〔抗体）n 显色显色/显影显影n 根据显影结果判断：根据显影结果判断：内参内参目标蛋白目标蛋白检测标本很多的情况下检测标本很多的情况下Western Western 无法满足高通量的需求无法满足高通量的需求 ELISA / Phosphospecific-ELISAs (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)Ø 检测蛋白质表达量或者活性状态检测蛋白质表达量或者活性状态 (化学修饰化学修饰-磷酸化磷酸化)Ø 比比western blot更快速、更高效更快速、更高效. 蛋白质组〔蛋白质组〔proteome）：）： 一个基因组所表达的全部蛋白质一个基因组所表达的全部蛋白质.蛋白质组学〔蛋白质组学〔proteomics)：： 研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。
研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学 蛋白质组学蛋白质组学(Proteomics)Ø 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同；达情况各不相同； Ø 在空间和时间上呈动态变化在空间和时间上呈动态变化 蛋白质组学研究技术平台蛋白质组学研究技术平台 ( (高效率高效率, ,高通量高通量) ) 双向电泳分离样品蛋白质双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位和切取蛋白质点的定位和切取 质谱分析质谱分析 第一向：等电聚焦电泳第一向：等电聚焦电泳 （（IEF）） 第二向：第二向：SDS-PAGE电泳电泳 免疫荧光技术免疫荧光技术Immunofluorescence (IF) Immunofluorescence (IF) n利用某些荧光素如利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其它蛋白等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜可对抗原进行定性或定位检测。
光，因此利用荧光显微镜可对抗原进行定性或定位检测n采用流式细胞免疫荧光技术〔采用流式细胞免疫荧光技术〔FCM〕可从单细胞水平检测〕可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子〔两种不同的分子〔Double IF），也可用多参数流式细胞术），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测对胞内多种分子进行检测 2. 蛋白质与蛋白质相互作用研究技术蛋白质与蛋白质相互作用研究技术: Co-IP〔免疫共沉淀）〔免疫共沉淀） with antibody against one protein followed by Western blot with antibody against another protein GST pull-down assay Yeast two-hybrid assay FRET (fluorescence resonance energy transfer) assay agarose beadn IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G〞能特异结合免疫球蛋白〞能特异结合免疫球蛋白FC片段的现象而发展的片段的现象而发展的方法。
目前多用精制的方法目前多用精制的protein A/G预先结合固化在预先结合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的上的prorein A/G就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的protein A抗原抗原抗体抗体 YABY裂解细胞裂解细胞 免疫沉淀蛋白质免疫沉淀蛋白质X免疫共沉淀〔免疫共沉淀〔Co-IP〕技术〕技术 非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来若用蛋白质质间的相互作用被保留了下来若用蛋白质X的抗体免疫沉的抗体免疫沉淀淀X，那么与，那么与X在体内结合的蛋白质在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来进一步也能沉淀下来进一步进行进行Western Blot和质谱分析常用于测定两种目标蛋白质和质谱分析常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档缺陷：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质相互作用缺陷：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质相互作用。
Western Blot和质谱分析和质谱分析 Co-IP工作示意图工作示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYY GST融合蛋白进行融合蛋白进行Pulldown实验实验GST pull-down assay 原理原理 将将GST融合蛋白融合蛋白(tagged protein (标记蛋白标记蛋白) or the bait (饵蛋白饵蛋白)，，GST, His6, Flag, biotin …)作为探针，作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein, or prey被扑被扑获蛋白获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白一般在发融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白一般在发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用用GST沉降技术该方法只是用于确定体外的相互作用沉降技术该方法只是用于确定体外的相互作用 GST-Pulldown Assay 转录激活因子转录激活因子DNA结合结构域结合结构域(BD)转录激活结构域转录激活结构域(AD)酵母双杂交技术酵母双杂交技术 酵母双杂交技术是一种基于转录重建而建立的酵母双杂交技术是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。
研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法n在酵母细胞中分析蛋白质相互作用在酵母细胞中分析蛋白质相互作用n以真核细胞转录激活因子的结构为基础以真核细胞转录激活因子的结构为基础 将将编编码码某某一一蛋蛋白白X X的的DNADNA序序列列与与DNADNA结结合合域域BDBD的的编编码码序序列列融融合合形形成成一一个个杂杂交交体体( (““诱诱饵饵〞〞bait)bait)，，将将编编码码另另一一蛋蛋白白Y Y的的DNADNA序序列列与与DNADNA激激活活域域ADAD的的编编码码序序列列融融合合形形成成另另一一个个杂杂交交体体( (““猎物〞或靶蛋白猎物〞或靶蛋白prey or target protein);prey or target protein);当当两两个个杂杂交交体体共共转转化化酵酵母母细细胞胞〔〔此此酵酵母母细细胞胞含含有有上上游游有有DNADNA结结合合位位点点的的报报告告基基因因）），，若若X X和和Y Y没没有有相相互互作作用用，，则则单单独独不不能能激激活活报报告告基基因因的的转转录录；；若若X X和和Y Y可可相相互互作作用用，，则则使使BDBD和和ADAD靠靠近近形形成成一一个个有有效效的的转转录录激激活活子子，，激激活活报报告告基基因因的的转转录录。
因因此此可可通通过过检检测测报报告告基基因因的的转转录录来来研研究究蛋蛋白白质质X X和和Y Y的的相相互互作用但限于核内表达的蛋白质的相互作用但限于核内表达的蛋白质的相互作用酵母双杂交系统酵母双杂交系统 荧荧光光共共振振能能量量转转移移(FRET)是是对对生生物物大大分分子子之之间间相相互互作作用用定定性性、、定定量量检检测测的的一一种种有有效效方方法法，，是是在在活活体体细细胞胞中中实实时时地地对对生生物大分子之间的相互作用进行动态监测物大分子之间的相互作用进行动态监测. 两两个个携携带带不不同同荧荧光光基基团团〔〔如如GFP、、YFP、、CFP等等〕〕的的大大分分子子在在相相互互间间距距离离足足够够近近时时会会发发生生激激发发态态能能量量非非放放射射性性地地由由一一个个荧荧光光基基团团〔〔供供体体〕〕向向另另一一个个荧荧光光基基团团〔〔受受体体〕〕转转移移的的现现象象如如果果发发生生FRET，，则则供供体体信信号号将将淬淬灭灭而而受受体体信信号号将将激激活活或或增增强强. FRET 检检测测系系统统可可以以快快速速高高效效地地捕捕获获来来自自标标定定分分子子间间相相互互作作用用的的短短暂暂微微弱弱的的荧荧光光信信号号，，而而以以分分子子尺尺度度分分辨辨出出供供体体-受受体体的的平平均距离，并能显示出受体均距离，并能显示出受体-供体的相互作用。
供体的相互作用 蛋白质直接相互作用的荧光共振能量转移蛋白质直接相互作用的荧光共振能量转移 Fluorescence Resonance Energy Transfer 以光线激发后，供体荧光基以光线激发后，供体荧光基团团(ECFP–X)会将激发能量会将激发能量转移至距离转移至距离10–100 Å 以内以内的受体荧光基团的受体荧光基团(EGFP–Y)，使之发出荧光通过检测，使之发出荧光通过检测受体荧光基团激发的荧光即受体荧光基团激发的荧光即可确认两蛋白质间的相互作可确认两蛋白质间的相互作用ECFP：强化型蓝荧光：强化型蓝荧光蛋白；蛋白；EGFP：强化型绿荧：强化型绿荧光蛋白光蛋白FRET 3. 磷酸化蛋白质研究方法磷酸化蛋白质研究方法: Western blot with phospho-specific antibodies. ELISA Phosphopeptide and phosphoamino acid analysis by mass spectrophotometric analysis.n 激酶活性的测定激酶活性的测定n 信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化， 信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化，因而对这些激酶活性的测定在信号转导研究中具因而对这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义。
常见激酶活性的测定有有重要意义常见激酶活性的测定有PTK、、PKC及及PI-3K等均有商品化的试剂盒均有商品化的试剂盒 4. 基因转录活性检测基因转录活性检测 信号蛋白转录水平表达〔信号蛋白转录水平表达〔mRNA〕的检测〕的检测: RT- PCR / Realtime RT- PCR Northern blot analysis. “gene chip” to measure changes in gene expression at larger scales. 基因启动子基因启动子/增强子转录活性的检测增强子转录活性的检测: Transient or stable reporter assay—luciferase (Luc) . RT- PCR Marker 组组1 组组2 内参基因内参基因目的基因目的基因RTRT：：以以polyTpolyT为引物，在逆转录酶为引物，在逆转录酶催化下催化下cDNAcDNA合成合成PCRPCR：：特异引物进行目的特异引物进行目的DNADNA的扩增的扩增运用：运用：1.1.获得目的基因〔编码蛋白）获得目的基因〔编码蛋白）2.2.比较不同条件下比较不同条件下mRNAmRNA变化变化RT- PCR Real-time PCR 用于基因用于基因DNADNA拷贝数和拷贝数和mRNAmRNA表达定量分析表达定量分析荧光染料：荧光染料：每形成一个每形成一个DNA双链，双链，就有一定数量的染料结就有一定数量的染料结合上去，染料一结合就合上去，染料一结合就产生荧光信号，信号强产生荧光信号，信号强度与度与DNA分子总数目成分子总数目成正比。
正比①① ② TaqMan ② TaqMan 探针探针 寡核苷酸探针的寡核苷酸探针的5′端标记一个荧光报告基团〔端标记一个荧光报告基团〔reporter ），），3′端标记一个荧光淬灭基团〔端标记一个荧光淬灭基团〔quencher ） 报报告告荧荧光光基基团团与与淬淬灭灭基基团团分分离离，，荧荧光光共共振振能能量量转移不再发生，报告基团发绿色荧光转移不再发生，报告基团发绿色荧光当当激激发发光光照照射射到到探探针针时时，，被被激激发发的的报报告告基基团团将能量转移给附近的淬灭基团而不发光将能量转移给附近的淬灭基团而不发光 每产生一条每产生一条DNADNA链，就切断一条探针，每链，就切断一条探针，每切断一条探针，就产生一个单位信号，切断一条探针，就产生一个单位信号，信号强度与结合探针的信号强度与结合探针的DNADNA分子数成正比分子数成正比 5. 蛋白质与蛋白质与DNA相互作用的研究技术相互作用的研究技术: Gel shift (or electrophoretic mobility shift) assay (EMSA)—typically, with smaller DNA sizes. Chromatin-immunoprecipitation (ChIP) assay—to assess occupancy of DNA sites with specific factors in living cells. Gel shift 染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术（（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP））—— 体内分析蛋白质体内分析蛋白质-DNA相互作用相互作用 Ø 真核生物基因组真核生物基因组DNA以染色质的形式存在。
因此，研究蛋以染色质的形式存在因此，研究蛋白质与白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径表达机制的基本途径Ø CHIP的基本原理的基本原理: 在活细胞状态下固定蛋白质－在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后免疫沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的然后免疫沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得体内蛋片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得体内蛋白质与白质与DNA相互作用的信息相互作用的信息 甲甲醛醛处处理理使使蛋蛋白白质质与与染染色色质质DNADNA交交联；联；超超声声波波或或酶酶处处理理使使染染色色质质DNADNA片片段段化；化；抗体沉淀蛋白质抗体沉淀蛋白质-DNA-DNA交联复交联复合体〔合体〔IPIP）；）；消化蛋白，解除交联，纯化消化蛋白，解除交联，纯化DNADNA；；检检 测测 分分 析析 (PCR, (PCR, qPCR, qPCR, Microarray)Microarray) 6. 基因或蛋白质功能研究基因或蛋白质功能研究 改变基因结构改变基因结构 基因突变〔点突变、缺失、融合等）基因突变〔点突变、缺失、融合等） 将突变基因或蛋白引入细胞以检测其功能将突变基因或蛋白引入细胞以检测其功能Dominant negative mutants (缺失结构域突变体)Ligand-binding sitePhosphorylation siteDocking siteProtein-protein binding siteDNA binding site §基因表达或蛋白质活性的抑制，观察表型变化推测基因功能基因表达或蛋白质活性的抑制，观察表型变化推测基因功能§RNAi—use of small interfering RNA (siRNA) to reduce specific mRNA levels.§Antisense oligonucleotides§Ribozyme§Monoclonal Antibody§Small inhibitor molecules：：tyrosine kinase inhibitor (TKi)§在生物整体内改变基因表达或基因结构〔转基因技术）在生物整体内改变基因表达或基因结构〔转基因技术）§ transgenic§ Knock-out RNA干扰技术干扰技术 RNA Interference (RNAi)由双链由双链RNA 所引起的序列特异性基因沉默所引起的序列特异性基因沉默 1.长双链长双链RNA被细胞源性的双链被细胞源性的双链RNA特异的Ｄｉｃｅｒ核酸酶特异的Ｄｉｃｅｒ核酸酶切成２１～２３个碱基对的短切成２１～２３个碱基对的短双链双链RNA，称为小干扰，称为小干扰RNA2.小干扰小干扰RNA与细胞源性的某些与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导沉默复合体，该复合诱导沉默复合体，该复合体可识别与小干扰体可识别与小干扰RNA有同源有同源序列的ｍ序列的ｍRNA，并在特异位点，并在特异位点将该ｍ将该ｍRNA切断。
切断 RNAi实例实例(载体法载体法)：：n 查找靶基因查找靶基因mRNAn 利用网络支持，寻找利用网络支持，寻找siRNA序列序列n 根据查找的根据查找的siRNA序列，合成长链序列，合成长链oligon 构建载体构建载体n 转染转染n 检测效应〔包括干扰效应和生物学效应）检测效应〔包括干扰效应和生物学效应） 转基因：转基因：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，导入将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，导入基因的表达可引起生物体性状可遗传的改变，称之为转基基因的表达可引起生物体性状可遗传的改变，称之为转基因转基因动物：转基因动物：以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物并能遗传给后代的一类动物转基因技术转基因技术 transgenic technology transgenic technology 转基因动物模型实验步骤转基因动物模型实验步骤: : 转基因载体的构建；转基因载体的构建； 将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞；将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞； 将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内；内； 对转基因动物进行鉴定。
对转基因动物进行鉴定 转基因载体结构基因报告基因增强子启动子受精全能性细胞注射 植入假孕小鼠后代Southern blot RT-PCRWestern blot转基因小鼠转基因小鼠 基因敲除技术基因敲除技术 Gene Knock-out Gene Knock-out ØØ 体外合成无效基因或突体外合成无效基因或突体外合成无效基因或突体外合成无效基因或突变基因；变基因；变基因；变基因；ØØ 定向插入定向插入定向插入定向插入( (同源重组同源重组同源重组同源重组) )宿宿宿宿主细胞染色体主细胞染色体主细胞染色体主细胞染色体DNADNA中取代中取代中取代中取代相应正常基因相应正常基因相应正常基因相应正常基因, , 使特定目使特定目使特定目使特定目的基因在细胞内或生物体的基因在细胞内或生物体的基因在细胞内或生物体的基因在细胞内或生物体内失活；内失活；内失活；内失活；ØØ 应用转基因方法孵育出应用转基因方法孵育出应用转基因方法孵育出应用转基因方法孵育出转基因动物转基因动物转基因动物转基因动物, ,即为基因敲即为基因敲即为基因敲即为基因敲除动物。
除动物基因敲除技术基因敲除技术 Gene Knock-out Gene Knock-out n 信号转导中第二信使含量的测定n 第二信使含量的高低同信号传递密切相关n1.[Ca2+]的测定：原子光谱法、离子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等目前常用标记示踪法，即用荧光探针标记靶细胞常用的荧光探针有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等，后二者较为敏感n2.IP3的测定：采用3H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后，用不同的刺激剂刺激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离子交换层析柱分离洗脱，收集IP3洗脱峰后进行液闪测定此外，还可以使用Amersham公司生产的D-myo-IP3[3H]分析系统直接测定粗提物中的IP3含量，此方法简易、敏感n3.DAG的测定：首先提取含DAG的样品，用DAG激酶催化底物DAG，使之发生磷酸化，外源加入32γ-ATP，最后将反应产物进行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含量n4.cAMP的测定：（1〕cAMP[3H]分析系统，其优点是放射性半衰期长，可用于大量样品的分析；（2〕cAMP[125I]分析系统，用于小量样品的分析；（3〕cAMP ELISA测定方法，此方法简便、敏感。
例如检测组织或细胞中某个信号通路及其作用例如检测组织或细胞中某个信号通路及其作用:1. 样本〔组织，细胞）；样本〔组织，细胞）；2. 免疫组化，免疫细胞化学定位免疫组化，免疫细胞化学定位3. RT-PCR(Realtime PCR), Western blot 检测通路关键信号检测通路关键信号分子的表达〔分子的表达〔mRNA水平，蛋白水平），磷酸化状态；水平，蛋白水平），磷酸化状态；4. 检测通路相互作用蛋白〔检测通路相互作用蛋白〔CoIP等）等）6. 关键信号分子基因沉默或增强〔沉默：抑制剂关键信号分子基因沉默或增强〔沉默：抑制剂/siRNA/抗体抗体/基因敲除动物；加强：激动剂基因敲除动物；加强：激动剂/构建过表达载体转染）构建过表达载体转染）7. 芯片芯片/组学检测组学检测 信号通路研究基本策略信号通路研究基本策略 例如研究某药物对细胞的作用及相关信号通路例如研究某药物对细胞的作用及相关信号通路:1. 药物刺激细胞〔时间梯度，浓度梯度）；药物刺激细胞〔时间梯度，浓度梯度）；2. 检测药物对细胞的作用〔毒性，增殖，凋亡，侵袭，迁移检测药物对细胞的作用〔毒性，增殖，凋亡，侵袭，迁移等）；等）； 3. 共聚焦显微镜定位；共聚焦显微镜定位；4. RT-PCR(Realtime PCR), Western blot 检测通路关键信号检测通路关键信号分子的表达〔分子的表达〔mRNA水平，蛋白水平）），磷酸化状态；水平，蛋白水平）），磷酸化状态；5. 检测通路相互作用蛋白〔检测通路相互作用蛋白〔CoIP，，FRET等）等）6. 关键信号分子基因沉默〔抑制剂关键信号分子基因沉默〔抑制剂/siRNA/抗体〕后检测抗体〕后检测7. 芯片芯片/组学检测组学检测 谢谢谢谢信号通路研究基本策略信号通路研究基本策略 基因功能研究策略基因功能研究策略新发现的功能未知的基因：新发现的功能未知的基因： 通过生物信息学分析对该基因所编码蛋白质的空间结构通过生物信息学分析对该基因所编码蛋白质的空间结构及功能进行预测及功能进行预测; ; 应用分子生物学技术在细胞及动物水平进行研究〔蛋白应用分子生物学技术在细胞及动物水平进行研究〔蛋白表达，细胞定位，沉默或过表达对细胞功能的影响等）表达，细胞定位，沉默或过表达对细胞功能的影响等）; ; 通过探讨与该基因蛋白相互作用的蛋白而确定新基因的通过探讨与该基因蛋白相互作用的蛋白而确定新基因的功能。
功能 蛋白质结构域分析和结构测定蛋白质结构域分析和结构测定 北京旅行社 欧洲旅游 美国旅游 chuguo66/ 溑炀牷 。