蛋白质组学的研究方法和进展

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1、 第九章第九章 蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质组学的研究方法和进展背背 景景基因数量有限性和基因结构的相对稳定性 vs 生命现象的复杂性和多变性 从genomic到proteomen对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。 第一节第一节 蛋白质组学的概念及其发展史蛋白质组学的概念及其发展史 第二节第二节 蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述 第三节第三节 蛋白质组学在疾病研究中的应用蛋白质组学在疾病研究中的应用主要内容主要内容 第一节第一节 蛋白质组学的概念及其发展史蛋白质组学的概念及其发展史n蛋白质组是澳大利亚学者蛋

2、白质组是澳大利亚学者WilliamsWilliams和和WilkinsWilkins于于19941994年首先提出，源于蛋白年首先提出，源于蛋白质（质（proteinprotein）与基因组（）与基因组（genomegenome）两）两个词的杂合个词的杂合, ,意指意指proteins expressed proteins expressed by a genomeby a genome，即，即“一个细胞或一个组一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质织基因组所表达的全部蛋白质”。 一、蛋白质组学的概念一、蛋白质组学的概念n对应于基因组的所有蛋白质构成的整对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，

3、不是局限于一个或几个蛋白质。体，不是局限于一个或几个蛋白质。 n同一基因组在不同细胞、不同组织中同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同的表达情况各不相同 。n在空间和时间上动态变化着的整体。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组是：蛋白质组是：蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联修饰状

4、态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 主要研究内容主要研究内容 了解某种特定的细胞、组了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；织或器官制造的蛋白质种类； 明确各种蛋白质分子是如明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；何形成类似于电路的网络的； 描绘蛋白质的精确三维结构，揭描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。合并且决定其活性的部位。 n研究对象研究对象n基础技术基础技术n研究层次研究层次 功能蛋白质组学功能蛋白质组学(functi

5、onal proteomics)的提出的提出 n功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。一生理现象相关的所有蛋白质。n介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。组学之间。 n从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。群体。 n将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的近于生命细胞的“全部蛋白质全部蛋白质”的蛋白的蛋白质组图谱。质组图谱。二、蛋白质组学的产生与发展二、

6、蛋白质组学的产生与发展背背 景景 基因组时代基因组时代 后基因组时代后基因组时代 研究重点的转移及其标志研究重点的转移及其标志 功能基因组学的主要任务功能基因组学的主要任务 mRNAmRNA水平的基因表达研究取得进水平的基因表达研究取得进 展，但展，但mRNAmRNA与蛋白质间的相关系与蛋白质间的相关系数仅为数仅为0.40.40.50.5 蛋白质自身特点难以从蛋白质自身特点难以从DNADNA和和mRNAmRNA水平得到解答水平得到解答 进进 展展各国政府支持，国际著名研究和商业机构各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：加盟：19961996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白年澳大利亚建立了世

7、界上第一个蛋白质组研究中心（质组研究中心（Australia Proteome Australia Proteome Analysis FacilityAnalysis Facility，APAFAPAF） 美国国立癌症研究院（美国国立癌症研究院（NCINCI）投资）投资1 0001 000万万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。白质组数据库。NCINCI和和FDAFDA共同投资数百万美元建立癌症不共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。同阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成

8、或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。白质组研究。 CeleraCelera公司投资上亿美元独自启动了全公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。的蛋白质表达数据库的工作。 1997年年召召开开了了第第一一次次国国际际“蛋蛋白白质质组组学学”会议会议 1998年年在在美美国国旧旧金金山山召召开开了了第第二二届届国国际际蛋白质组学会议蛋白质组学会议 1999年年1月月在在英英国国伦伦敦敦举举行行了了应应用

9、用蛋蛋白白质组会议质组会议 我国也于我国也于1998年启动了蛋白质组学研年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会了两次全国性的蛋白质组学研讨会 2003成成立立了了中中国国人人类类蛋蛋白白质质组组组组织织（CHHUPO），并并分分别别于于2003年年9月月、2004年年8月月以以及及2005年年8月月召召开开了了中中国国蛋蛋白白质质组组学学首首届届、第第二二届届及及第第三三届届学学术术大大会会，2004年年10月月在在中中国国北北京京召开了第三届国际蛋白质组学会议。召开了第三届国际蛋白质组学会议。 n 科技部已将疾病

10、蛋白质组研究列入我国科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和计划项目和“863”计划项目计划项目；国家自然国家自然科学基金委员会也将科学基金委员会也将“蛋白质组研究蛋白质组研究”列为重点列为重点项目。项目。n我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展研究方面取得了较大的进展。 第二节第二节 蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述蛋白质组研究更为复杂和困难：蛋白质组研究更为复杂和困难： 蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质数目大大超过基因数目。 蛋白质随时间和空间而变化。蛋白质随时间和空间而变化。 发展高通量、高灵敏

11、度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。 当前主要任务 一、蛋白质组表达模式的一、蛋白质组表达模式的 研究方法研究方法n研究蛋白质组的组成成分研究蛋白质组的组成成分 n支支撑撑技技术术主主要要有有双双向向凝凝胶胶电电泳泳、以以质质谱谱为为代代表表的的蛋蛋白白质质鉴鉴定定技技术术及生物信息学分析。及生物信息学分析。 蛋白质组表达模式蛋白质组表达模式（expression profile）：）：（一）蛋白质组研究中的样品制备 n通常可采用细胞或组织中的全蛋白通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。质组分进行蛋白质组分析。 n也可以进行样品预分级，

12、即将细胞也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。分，分别进行研究。 样品预分级的主要方法样品预分级的主要方法n蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白等n蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等n蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等体、叶绿体等 样品预分级主要作用在于样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度检测灵敏度。组织水平上的蛋白质组样品制备组织水平上的蛋白质组样品制备 临床样本都是各种细胞

13、或组织临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。细胞等混杂。 激光捕获显微切割激光捕获显微切割(laser capture (laser capture microdissectionmicrodissection，LCM)LCM) 可直接在显微镜下从组织切片可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。中精确分离特定的细胞或细胞群。 （二）蛋白质组研究中的样品分离n双向凝胶电泳双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用

14、蛋：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。学特性，分离各种蛋白质的方法。原原 理理 第第一一向向在在高高压压电电场场下下对对蛋蛋白白质质进进行行等等电电聚聚焦焦(IEF), 再再在在第第一一向向垂垂直直方方向向上上进进行行第第二二向向SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳(SDS-PAGE)。 1975年首先由年首先由OFarrell等创立。等创立。特特 点点n可分离可分离10100 kD分子量的蛋白质分子量的蛋白质 n高灵敏度和高分辨率高灵敏度和高分辨率n便于计算机进行图像分析处理便于计算机进行图像分析处理 n与质谱分析匹配

15、与质谱分析匹配 第一向第一向IEF电泳电泳 n传统传统OFarrell系统双向电泳的缺陷。系统双向电泳的缺陷。nBjellgvist等发展并完善了固相等发展并完善了固相pH梯梯度等电聚焦技术，度等电聚焦技术，Grg等成功地将等成功地将之应用于双向电泳之应用于双向电泳。 优点优点 固相固相pHpH梯度等电聚焦的优点梯度等电聚焦的优点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的可以随意精确设定的稳定的可以随意精确设定的pH梯度。梯度。 尤尤其其可可在在较较窄窄的的pH范范围围内内进进行行第第二二轮轮分析，大大提高了分辨率及重复性。分析，大大提高了分辨率及重复性。 第

16、二向第二向SDS-PAGE电泳电泳 垂直板电泳垂直板电泳 水平超薄胶电泳水平超薄胶电泳 2-DE技术的缺点技术的缺点 极极酸酸、极极碱碱性性蛋蛋白白质质，疏疏水水性性蛋蛋白白质质，极极大大蛋蛋白白质质、极极小小蛋蛋白白质质以以及及低低丰丰度度蛋蛋白质用此种技术难于有效分离。白质用此种技术难于有效分离。 胶胶内内酶酶解解过过程程费费时时、费费力力，难难于于与与质质谱谱联用实现自动化。联用实现自动化。 新型非凝胶技术新型非凝胶技术 液相色谱法液相色谱法liquid chromatography，LC毛细管电泳毛细管电泳capillary electrophoresis，CEn液质联用技术（液质联用

17、技术（LC-MS/MSLC-MS/MS） 蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替代替2-DE的分离，然后进入的分离，然后进入MS系统获得肽系统获得肽段分子量，再通过串联段分子量，再通过串联MS技术，得到部分技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。蛋白质。 根根据据蛋蛋白白质质带带电电性性及及疏疏水水性性不不同同，用用MS分离多肽复合物。分离多肽复合物。 n多维多维色谱技术（色谱技术（LC/LC-MS/MS） n多维蛋白质鉴定技术多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein ide

18、ntification technology) （三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定传统方法：蛋白质微量测序传统方法：蛋白质微量测序 氨基酸组成分析氨基酸组成分析 新型蛋白质鉴定技术新型蛋白质鉴定技术 质谱（质谱（MSMS）法）法 基本原理基本原理：样品分子离子化后，：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（根据离子间质荷比（m/zm/z）的差）的差异来分离并确定样品的分子量。异来分离并确定样品的分子量。 “软电离软电离”的特点的特点n分分子子电电离离时时保保留留整整个个分分子子的的完完整整性性，不不会形成碎片离子。会形成碎片离子。 n灵灵敏敏度度高高、快快速速、能

19、能同同时时提提供供样样品品的的精精确确分分子子量量和和结结构构信信息息、既既可可定定性性又又可可定定量量、并并能能有有效效地地与与各各种种色色谱谱联联用用来来分分析析复杂体系。复杂体系。 n基质辅助激光解吸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） n电喷雾质谱（电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS） 主要质谱类型主要质谱类型鉴定和注

20、释蛋白质的路线鉴定和注释蛋白质的路线 n通过肽质谱指纹图（通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹）和数据库搜寻匹配配 n通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配 目目 录录 仪仪 器器 nMALDI-TOF质谱仪：灵敏度高质谱仪：灵敏度高（可达（可达fmol），分析速度快，），分析速度快，谱图简单易于解析以及受缓冲液、谱图简单易于解析以及受缓冲液、盐份的干扰小盐份的干扰小 肽质谱指纹图在数据库中匹配肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因不成功

21、的可能原因n 样样品品量量太太少少，PMF图图信信噪噪比比太太低低，输输入库中搜寻的数据质量不好。入库中搜寻的数据质量不好。n2-DE胶胶上上所所取取的的一一个个蛋蛋白白质质点点并并非非单单一一蛋蛋白白质质，所所获获PMF图图实实际际上上是是两两个个以上蛋白质的混合图。以上蛋白质的混合图。n 操作中角蛋白或其他蛋白质的污染操作中角蛋白或其他蛋白质的污染n蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载库中未有记载n所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多解片段多 n未知的新蛋白质未知的新蛋白质 n数据库规模太小数据库规模太小

22、续：续：组织切片或印片原位质谱分析技术组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换回旋共振质谱（傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸表面增强激光解吸/电离飞行时间质电离飞行时间质谱（谱（SELDI-TOF-MS） 联合技术精确鉴定蛋白质联合技术精确鉴定蛋白质 （四）蛋白质组学研究的生物信息学（四）蛋白质组学研究的生物信息学 生生物物信信息息学学是是蛋蛋白白质质组组学学研研究究的一个不可缺少的部分。的一个不可缺少的部分。 构建和分析双向凝胶电泳图谱构建和分析双向凝胶电泳图谱 数据库的搜索与构建数据库的搜索与构建

23、 应应 用用 蛋白质组数据库是蛋白质组蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础研究水平的标志和基础 n瑞士的瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。大、种类最多的蛋白质组数据库。n目前应用最普遍的数据库是目前应用最普遍的数据库是NRDB 和和dbEST数据库。数据库。dbEST数据库数据库 由美国国家生物技术信息中心（由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和）和欧洲生物信息学研究所（欧洲生物信息学研究所（EBI）共同编辑，）共同编辑，包括许多生物体的表达序列标签（包括许多生物体的表达序列标签（EST） 肽序列标签肽序列标签(PST)或部分序列

24、信或部分序列信息最适合查寻息最适合查寻 概概念念：把把一一个个基基因因组组表表达达的的全全部部蛋蛋白白质质或或一一个个复复杂杂体体系系中中所所有有的的蛋白质进行精确的定量和鉴定。蛋白质进行精确的定量和鉴定。 （五）定量蛋白质组学研究（五）定量蛋白质组学研究 低丰度蛋白质检测困难低丰度蛋白质检测困难 蛋蛋白白质质表表达达量量差差异异很很小小，如如在在50%以下时，精确定量成为瓶颈以下时，精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化蛋白质表达的瞬时变化 蛋白质定量的难点蛋白质定量的难点1 1基于双向凝胶电泳的定量基于双向凝胶电泳的定量 蛋白质组研究策略蛋白质组研究策略 双双向向凝凝胶胶电电泳泳(2-DE

25、)是是目目前前唯唯一一能能分分离离展展示示大大量量蛋蛋白白质质并并进进行行蛋蛋白白质质定定量量分分析析的的一一种种方法。方法。 荧光差异显示双向电泳（荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE） 2基于生物质谱的定量蛋白基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略质组研究策略 原原理理：对对于于具具有有相相同同离离子子化化能能力力的的蛋蛋白白质质或或多多肽肽，可可以以通通过过比比较较质质谱谱峰峰的的强强度度（或或峰峰面面积积）得得到到待待比比较较蛋蛋白白质质的相对量。的相对量。 二、蛋白质组功能模式的二、蛋白质组功能模式的研究方法研究方法n揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互揭示蛋白质组成员间的相互作用、相

26、互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。白质结构功能的关系。 主要研究目标 （一）蛋白质翻译后修饰的研究（一）蛋白质翻译后修饰的研究翻译后修饰翻译后修饰糖糖基基化化乙乙酰酰化化甲甲基基化化羧羧基基化化二二硫硫键键n修饰肽的检测的高灵敏度方法修饰肽的检测的高灵敏度方法 n蛋白质翻译后修饰的定量分析蛋白质翻译后修饰的定量分析 n合适的修饰状态下处理和电离条件合适的修饰状态下处理和电离条件 n测定工作量巨大测定工作量巨大 研究面临的困难：研究面临的困难： （二）蛋白质相互作用研究技术

27、（二）蛋白质相互作用研究技术n生命的基本过程是不同功能蛋白质在时生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用空上有序和协同作用 n新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现络协同作用实现 n细胞信号转导及病原体感染和免疫反应细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 n1989年年Field 和和Song等人在酵母细胞中等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。设计的分析蛋白质相互作用的方法。n以真核细胞转录激活因子的结构和活性以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。特点为基础的。1酵母双杂交系统（yeast two-hybrid syst

28、em） 转录激活因子转录激活因子GAL4的特点的特点nN N端含端含NLSNLS和与酵母和与酵母GAL1GAL1基因启动子上游基因启动子上游激活序列激活序列(UASG)(UASG)结合的结构域结合的结构域nC C端含端含GAL1GAL1转录激活结构域转录激活结构域 n功能上相互独立又互相依赖，只有通功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整的过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性转录因子活性 系系 统统 构构 建建n分别构建含分别构建含GAL4 BD 和和AD 的两个的两个酵母融合蛋白表达载体；酵母融合蛋白表达载体；n建立含建立含特殊基因型特殊基因型、适用于双杂交适用

29、于双杂交体分析体分析的酵母菌株的酵母菌株 主要特点和优势主要特点和优势n使蛋白质表现型和基因型相联系使蛋白质表现型和基因型相联系n筛选筛选cDNA文库文库n真实反应体内蛋白质间相互作用情况真实反应体内蛋白质间相互作用情况n不需分离靶蛋白不需分离靶蛋白n敏感性高敏感性高 缺缺 点点1.1.假阳性结果假阳性结果 2.2.假阳性结果假阳性结果 3.3.限于核内表达的蛋白质的相互作用限于核内表达的蛋白质的相互作用 2噬菌体表面显示技术噬菌体表面显示技术 ( phage display ) 三个基本因素：三个基本因素： 在噬菌体在噬菌体pp和和pp衣壳蛋白衣壳蛋白N N端插入外源端插入外源待筛基因编码的

30、蛋白，形成的融合蛋白表达待筛基因编码的蛋白，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面；同时其保持的外源蛋在噬菌体颗粒的表面；同时其保持的外源蛋白天然构象能被相应的抗体或受体识别白天然构象能被相应的抗体或受体识别n利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和筛选法（筛选法（panning），从噬菌体文库中筛选），从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。出能结合筛选分子的目的噬菌体。n外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA测测序推导出来。序推导出来。主主

31、要要 应应 用用筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质 研究抗体或受体的结合位点研究抗体或受体的结合位点构建随机肽库、抗体库和蛋白文库构建随机肽库、抗体库和蛋白文库 改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性 研究新型多肽药物、疫苗和抗体研究新型多肽药物、疫苗和抗体 研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物学研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物学过程和新型的基因治疗导向系统过程和新型的基因治疗导向系统 主要优点主要优点n在细菌外完成在细菌外完成 n高度的选择性高度的选择性 n亲和纯化反应高效性亲和纯化反应高效性 n不需要了解筛选分子结

32、构不需要了解筛选分子结构 缺缺 点点n限制肽段大小限制肽段大小n外源蛋白质无法正确折叠或修饰外源蛋白质无法正确折叠或修饰 n融合蛋白可能会影响到蛋白质本身活性融合蛋白可能会影响到蛋白质本身活性 3基于质谱的蛋白质相互作用基于质谱的蛋白质相互作用研究方法研究方法n靶蛋白制备靶蛋白制备 n蛋白质复合体的纯化蛋白质复合体的纯化 n蛋白质蛋白质复合体复合体的质谱鉴定的质谱鉴定 基本步骤：基本步骤：（1）亲和层析耦联质谱技术）亲和层析耦联质谱技术 n基本原理：基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的

33、蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白的）鉴定靶蛋白的结合蛋白。结合蛋白。 先决条件先决条件 n得到足够多的保持生物活性的重组得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵（靶蛋白作为诱饵（bait） n获得足够量、纯度高的与诱饵相互获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质作用的蛋白质 利用含靶蛋白的融合蛋白获得利用含靶蛋白的

34、融合蛋白获得相互作用蛋白质相互作用蛋白质n谷胱甘肽谷胱甘肽S转移酶（转移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白）融合蛋白n蛋白蛋白A融合蛋白融合蛋白主要优点主要优点 n灵敏度高：高浓度靶蛋白灵敏度高：高浓度靶蛋白 n候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等 n检测多亚基蛋白质之间的相互作用检测多亚基蛋白质之间的相互作用 （2）免疫共沉淀耦联质谱技术）免疫共沉淀耦联质谱技术 n原理：原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀沉淀（immuno-pre

35、cipitation，IP）纯化靶蛋白免疫复合物纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离凝胶电泳分离后后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。 研究鼻咽癌细胞系中的研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白相互作用蛋白n抗抗p53抗体与抗体与HNE1和和HNE2总蛋白进行总蛋白进行免疫共沉淀免疫共沉淀nSDS-PAGE分离免疫沉淀复合物分离免疫沉淀复合物n切取切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，）分析，得到相应的肽序列标签得到相应的肽序列标签 n搜索数据库搜索数据库 特特 点点 生理条件下蛋白质之间的相

36、互作用生理条件下蛋白质之间的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用 局局 限限 性性A. 灵敏性不高灵敏性不高 B. 假阳性假阳性C. 受免疫球蛋白的干扰较大受免疫球蛋白的干扰较大 Biacore基于基于表面等离子共振表面等离子共振（SPR）进进行生物大分子相互作用分析行生物大分子相互作用分析(BIA) 质谱质谱（MALDI-TOF-MS或或LC-ESI-MS/MS）鉴定）鉴定Biacore芯片上配体所捕芯片上配体所捕获的生物分子获的生物分子 （3 3）生物传感器耦联质谱技术）生物传感器耦联质谱技术 组组

37、 成成 当生物大分子结合（如蛋白质相互当生物大分子结合（如蛋白质相互作用）时会引起作用表面作用）时会引起作用表面(芯片芯片)折射率折射率的变化，这种光信号可被光感受器接受的变化，这种光信号可被光感受器接受并转换成电信号传送到计算机，再由计并转换成电信号传送到计算机，再由计算机还原为模拟的生物信号。算机还原为模拟的生物信号。 BiacoreBiacore的基本工作原理的基本工作原理（4）串联亲和纯化耦联质谱技术）串联亲和纯化耦联质谱技术 n基本原理：在靶蛋白一端或中部嵌入蛋白质标记（TAP Tag），经过特异性的两步亲和纯化，在生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质便可洗脱下来，然后用质谱技术对得到

38、的蛋白质复合体进行鉴定。主要流程主要流程 双重分子标签构建到靶蛋白双重分子标签构建到靶蛋白 表达融合蛋白表达融合蛋白 制备细胞裂解液制备细胞裂解液 IgG柱纯化柱纯化 TEV蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体 耦联钙调素的亲和柱纯化耦联钙调素的亲和柱纯化 洗脱洗脱 含含EGTA的洗脱液洗脱的洗脱液洗脱 质谱鉴定结合蛋白质质谱鉴定结合蛋白质 续：续：特特 点点n获得生理条件下与靶蛋白相互作用获得生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质的蛋白质 n鉴定出在空间上非直接物理相互作鉴定出在空间上非直接物理相互作用的蛋白质用的蛋白质n适用于大规模蛋白质相互作用研究适用于大规模蛋白质相

39、互作用研究 基基本本原原理理：将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋蛋白进行定性和定量分析。白进行定性和定量分析。（三）蛋白质芯片（三）蛋白质芯片（protein chips，protein array）技术技术依据的杂交反应原理依据的杂交反应原理: n抗原抗原-抗体反应抗体反应n配体配体-受体反应受体反应n蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质相互作用第三节第三节 蛋白质组学在疾病蛋白质组学在疾病 研究中的应用研究中的应用