植物组织培养常规技术

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1、第三章第三章植物组织培养常规技术植物组织培养常规技术第一节第一节 组织培养所需要的组织培养所需要的基本条件基本条件第二节第二节 组织培养中的组织培养中的无菌技术无菌技术第三节第三节 培养基培养基及其配制及其配制第四节第四节 组织培养的组织培养的基本程序基本程序第五节第五节 外植体的外植体的褐变与玻璃化苗褐变与玻璃化苗第一节第一节 组织组织培养所需要的基本条件培养所需要的基本条件所需条件所需条件实验室设置实验室设置仪器设备仪器设备无菌条件无菌条件一、实验室的设计与要求一、实验室的设计与要求 v实验室的设计和装备程度应依据工作目的、规模以实验室的设计和装备程度应依据工作目的、规模以及实际的经济状况

2、而定。及实际的经济状况而定。（一）（一）化学实验室化学实验室（二）（二）无菌操作室无菌操作室（三）（三）培养室培养室（四）（四）观察鉴定室观察鉴定室（五）（五）驯化移植室驯化移植室（一）化学实验室（一）化学实验室v用途用途: :化学实验室化学实验室是进行预处理和前期准备的场所是进行预处理和前期准备的场所器皿、用具的洗涤、干燥、灭菌和保存器皿、用具的洗涤、干燥、灭菌和保存培养基配制培养基配制植物材料的清洗和预处理植物材料的清洗和预处理存放各种器皿、设备和药品等存放各种器皿、设备和药品等v需要的装备需要的装备: :化学实验室应有实验台、药品柜、防尘橱或防尘柜化学实验室应有实验台、药品柜、防尘橱或防

3、尘柜冰冰箱箱、烘烘箱箱、天天平平、酸酸度度计计、水水浴浴锅锅、电电炉炉、灭灭菌菌锅锅、蒸蒸馏馏水水器器等等设设备备也也可可存存放放于于该该室室的的不不同同位位置置，相相应应的的操操作作也也在在该该室中进行。室中进行。v要求要求干净明亮，气流畅通。干净明亮，气流畅通。（二）无菌操作室（二）无菌操作室v用途：用途：无菌操作室也称无菌室或无菌操作室也称无菌室或接种室接种室，它是组织培养中，它是组织培养中进行无菌操作的场所进行无菌操作的场所。v设备设备：超净工作台超净工作台、灭菌器灭菌器等。等。v要求要求：一般要求一般要求室内干爽室内干爽、整洁、明亮，墙壁光滑平整不易积染、整洁、明亮，墙壁光滑平整不易

4、积染灰尘，地面平坦无缝便于清洗和消毒。灰尘，地面平坦无缝便于清洗和消毒。室内应尽量少放设备和器械，除在出入口安装室内应尽量少放设备和器械，除在出入口安装移动滑门移动滑门外，外，其他门窗均应密闭，以保证没有通风和空气对流，通风换其他门窗均应密闭，以保证没有通风和空气对流，通风换气必须通过空气调节装置进行。气必须通过空气调节装置进行。定期用定期用甲醛和高锰酸钾甲醛和高锰酸钾或其他药剂进行消毒灭菌，室内的或其他药剂进行消毒灭菌，室内的上方和门口也应上方和门口也应安装紫外灯安装紫外灯，使室内保持良好的无菌或少，使室内保持良好的无菌或少菌状态。菌状态。 无菌室外应设无菌室外应设缓冲室缓冲室接种室接种室超

5、净工作台超净工作台紫外灯紫外灯缓冲室缓冲室消毒药消毒药消毒器消毒器滑门滑门（三）（三）培养室培养室v用途用途：培养室是培养接种材料的场所。：培养室是培养接种材料的场所。v设备设备：摇床摇床、光照培养箱光照培养箱、培养架、空调、加湿、培养架、空调、加湿除湿设备、除湿设备、时间程控时间程控器械。器械。v要求：要求：优越的照明条件：优越的照明条件：日光灯 良好的温控条件：良好的温控条件：自动控温电炉或空调等 能够保持一定的能够保持一定的湿度湿度：除湿机、加湿机（器） 能进行通风换气。能进行通风换气。通风窗口或加装排风扇v环境条件的控制与环境条件的控制与要求要求（四）观察鉴定室（四）观察鉴定室v用途用

6、途:对培养物进行观察鉴定的场所。对培养物进行观察鉴定的场所。v设备设备:显微观察设备显微观察设备:双筒实体显微镜、高倍显微镜、倒置显微双筒实体显微镜、高倍显微镜、倒置显微镜及其相应的显微照相设备、镜及其相应的显微照相设备、离心机离心机、测微尺和、测微尺和血球计数血球计数器器等等。组织切片染色设备组织切片染色设备:普通和超薄切片机、磨刀机、烤片普通和超薄切片机、磨刀机、烤片台或烘片器、恒温箱、染色缸等台或烘片器、恒温箱、染色缸等。照相冲洗设备等照相冲洗设备等:照相机、近视镜、测光表、显影罐、照相机、近视镜、测光表、显影罐、放大机、暗袋或暗箱等放大机、暗袋或暗箱等。离心机离心机（五）（五）驯化移植

7、室驯化移植室v用途用途：主要用于试管苗的驯化和移栽；也可用于：主要用于试管苗的驯化和移栽；也可用于母株的预栽培。母株的预栽培。v设施设施：室内应备有弥雾装置、荫棚、移植床（苗：室内应备有弥雾装置、荫棚、移植床（苗床）、恒温恒湿控制仪、光照调节装置等设施以床）、恒温恒湿控制仪、光照调节装置等设施以及培养土、培养盆（钵）、育苗盘等器材。及培养土、培养盆（钵）、育苗盘等器材。 v驯化移植室驯化移植室1、2二、常用仪器设备与器械二、常用仪器设备与器械（一）常用仪器设备（一）常用仪器设备： 超净工作台超净工作台；高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅；冰箱冰箱；烘箱烘箱；天平天平；蒸馏水器蒸馏水器；酸度计酸度计；

8、摇床与转床摇床与转床；光光照培养箱照培养箱（二）常用器皿与器械（二）常用器皿与器械1培养器皿培养器皿 ( (图图2 2) )2盛装器皿盛装器皿3计量器皿计量器皿4灭菌器械灭菌器械5接种器械接种器械6其他其他：漏斗、玻璃棒、落水架、器械支架、洗瓶、毛刷等。三、环境条件的控制与要求三、环境条件的控制与要求v光照光照v温度温度对大多数植物而言，对大多数植物而言，252的培养温度是适的培养温度是适宜的，低于宜的，低于15和高于和高于35的温度对培养都不利。的温度对培养都不利。喜喜温温性性植植物物：在在2628（如如茄茄科科、葫葫芦芦科科、兰兰科、芸香科、禾本科、蔷薇科等）；科、芸香科、禾本科、蔷薇科等

9、）；冷冷凉凉性性植植物物：1822或或0.5mmol/L）和微量）和微量元素元素（1）大量元素）大量元素种类：种类：C、H、O、N、S、P、K、Ca、Mg等。等。作用：作用：N元素：组培中利用的无机氮主要有硝态氮元素：组培中利用的无机氮主要有硝态氮(NO3-)和铵和铵态氮态氮(NH4+)两种形式两种形式.应注意：应注意：A.培养基中一般硝酸盐和铵盐按一定比例配合使用，两者比培养基中一般硝酸盐和铵盐按一定比例配合使用，两者比例大小应根据植物种类做适宜调整。例大小应根据植物种类做适宜调整。B.培养基中硝酸盐和铵盐各自的含量过高或过低或比例不当，培养基中硝酸盐和铵盐各自的含量过高或过低或比例不当，均

10、不利于培养物的培养均不利于培养物的培养(一般硝酸盐一般硝酸盐25mmol/L,铵盐铵盐8mmol/L)。（一）无机元素（一）无机元素v种类：种类：主要包括主要包括Fe、Cu、Mn、Zn、Mo、Na、Co、B、I等。等。v作用：作用：微量元素在植物生命活动过程中，多以酶微量元素在植物生命活动过程中，多以酶系中的辅基形式起着重要作用。系中的辅基形式起着重要作用。v使用中应注意的问题使用中应注意的问题若使用量过大，常会引起植物细胞酶系失活、代若使用量过大，常会引起植物细胞酶系失活、代谢障碍、蛋白质变性以及组织死亡等毒害现象。谢障碍、蛋白质变性以及组织死亡等毒害现象。来源问题来源问题不同培养基配方中的

11、用量差别很大不同培养基配方中的用量差别很大v植物组织培养常用培养基中离子植物组织培养常用培养基中离子浓度的比较浓度的比较（2）微量元素）微量元素植物组织培养常用培养基中离子浓度的比较植物组织培养常用培养基中离子浓度的比较NO3mmol/L3.3339.4133.7925.0018.4027.99NH420.6215.002.009.007.01总N3.3360.0348.7927.0327.4035.00P0.141.252.501.080.502.94K1.6620.0521.2925.009.9030.93Ca1.272.992.991.021.491.13Mg3.041.501.501.

12、000.750.75Cl0.875.985.982.042.992.26Femol/L12.50100.00100.0050.10100.00100.00S4502.001730.001610.002079.90996.804379.13Na2958.00202.00237.201089.00202.00202.00B24.20100.0010.0048.50161.8025.88Mn22.40100.0010.0059.20112.0019.73Zn10.4030.0037.307.0034.705.22Cu0.040.100.010.100.10Mo0.0071.000.101.001.0

13、0Co0.100.010.10离子单位WhiteMSERB5NitschN6I4.505.004.504.82（二）有机营养（二）有机营养1. 1. 碳水化合物碳水化合物碳水化合物碳水化合物2. 2. 氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸3.3.维生素维生素维生素维生素4. 4. 有机添加物有机添加物有机添加物有机添加物v几种培养基有机成分的几种培养基有机成分的几种培养基有机成分的几种培养基有机成分的比较比较比较比较肌醇肌醇100100100烟酸烟酸0.50.50.0550.51吡哆醇吡哆醇0.50.50.010.50.51硫胺素硫胺素0.40.50.010.5110甘氨酸甘氨酸22322叶酸叶酸0.5生

14、物素生物素0.05培养基成分培养基成分培养基（单位：培养基（单位：mg/L）*MSERWhite NitschN6B5蔗糖蔗糖3%4%2%2%5%2%1. 碳水化合物碳水化合物vv作用：作用：作用：作用：糖的加入主要是作为碳素来源和能量物质，同时糖具有维糖的加入主要是作为碳素来源和能量物质，同时糖具有维糖的加入主要是作为碳素来源和能量物质，同时糖具有维糖的加入主要是作为碳素来源和能量物质，同时糖具有维持和调节培养基渗透压的作用。持和调节培养基渗透压的作用。持和调节培养基渗透压的作用。持和调节培养基渗透压的作用。vv种类：种类：种类：种类：蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。蔗糖、葡萄

15、糖、果糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。vv应用：应用：应用：应用： 培养基中碳水化合物种类和浓度的选择主要依据培养材培养基中碳水化合物种类和浓度的选择主要依据培养材培养基中碳水化合物种类和浓度的选择主要依据培养材培养基中碳水化合物种类和浓度的选择主要依据培养材料而定，也视培养阶段而异。料而定，也视培养阶段而异。料而定，也视培养阶段而异。料而定，也视培养阶段而异。 应用最广泛的糖类是蔗糖。通常使用浓度在应用最广泛的糖类是蔗糖。通常使用浓度在应用最广泛的糖类是蔗糖。通常使用浓度在应用最广泛的糖类是蔗糖。通常使

16、用浓度在2%-5%2%-5%，在，在，在，在有些情况下使用较高的浓度，如花药培养和幼胚培养中。有些情况下使用较高的浓度，如花药培养和幼胚培养中。有些情况下使用较高的浓度，如花药培养和幼胚培养中。有些情况下使用较高的浓度，如花药培养和幼胚培养中。2. 氨基酸类氨基酸类v作用：作用：为为重要的有机氮源，对细胞的脱分化、再分化以重要的有机氮源，对细胞的脱分化、再分化以及器官建成起重要作用，特别是胚胎发生中，多种氨及器官建成起重要作用，特别是胚胎发生中，多种氨基酸混合使用常起到良好的促进作用。基酸混合使用常起到良好的促进作用。v种类种类:甘氨酸甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸、

17、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白（天冬酰胺、水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（）和水解乳蛋白（LH）等也是常用的氨基酸类。等也是常用的氨基酸类。v应用应用甘氨酸、甘氨酸、CH、LH最常用，前者的使用量较小一最常用，前者的使用量较小一般再般再23mg/L，后两者一般为，后两者一般为1001000mg/L。3. 维生素类维生素类种类种类作用作用使用量使用量(1mg/L)盐酸硫胺素盐酸硫胺素（VB1）促进细胞分裂促进细胞分裂, , 愈伤组织的形成愈伤组织的形成0.41盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇（VB6）促进根的形成与生长促进根的形成与生长0.51烟酸烟酸（Vpp）促进植物代谢和胚胎发育促进植物代谢和胚

18、胎发育0.51肌醇肌醇（Myo-inositol）促进细胞壁的形成和愈伤组织增殖；促进细胞壁的形成和愈伤组织增殖； 促促进培养物生长、胚状体和芽的形成；肌进培养物生长、胚状体和芽的形成；肌醇还有助于其他活性物质发挥作用醇还有助于其他活性物质发挥作用50100抗坏血酸抗坏血酸（Vc）防止组织褐变防止组织褐变50-2004天然有机添加物类天然有机添加物类v种类：种类：多种多样，如多种多样，如椰乳、马铃薯汁、麦芽浸出物、酵椰乳、马铃薯汁、麦芽浸出物、酵母提取物等母提取物等。v应用应用有时必不可少，但使用要慎重。在定性研究中可有时必不可少，但使用要慎重。在定性研究中可行，但不能应用于定量化研究。行，但

19、不能应用于定量化研究。（三）植物生长调节物质（三）植物生长调节物质v植物生长调节物质植物生长调节物质对于调节细胞分化、形态发生对于调节细胞分化、形态发生致关重要，是组培中的关键物质。致关重要，是组培中的关键物质。v种类：种类： 生长素类生长素类生长素类生长素类 细胞分裂素类细胞分裂素类细胞分裂素类细胞分裂素类 赤霉素类赤霉素类赤霉素类赤霉素类 乙烯乙烯乙烯乙烯 脱落酸脱落酸脱落酸脱落酸v作用：作用：作用：作用：主要作用是促进细胞伸长生长和细胞分裂主要作用是促进细胞伸长生长和细胞分裂 ,常被用于常被用于 : 诱导愈伤组织诱导愈伤组织;根的分化根的分化;与一定量的细胞分裂素配合使用，可用于诱导不定

20、芽的与一定量的细胞分裂素配合使用，可用于诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长；分化、侧芽的萌发与生长； 胚状体的产生；胚状体的产生；v种类种类：2，4二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸（2，4-D） 吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAA） 萘乙酸萘乙酸 （NAA）吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBA） 萘氧乙酸（萘氧乙酸（NOA）v作用强弱作用强弱： 2，4-D NOA NAA IBA IAA1.生长素类生长素类v应用情况：应用情况：应用情况：应用情况：使用浓度范围为使用浓度范围为0.115mg/L，最常用的浓度，最常用的浓度为为0.15mg/L。 2,4-D：诱导细胞分裂的效果最强诱导细胞分裂的效果最强 ；趋向于抑制培养物

21、的趋向于抑制培养物的形态发生形态发生 ；诱导胚状体发生。；诱导胚状体发生。 NAA：应用最广泛，：应用最广泛，常与细胞分裂素配合使用，用于愈常与细胞分裂素配合使用，用于愈伤组织的诱导和器官分化伤组织的诱导和器官分化 。 IBA：常用于生根。：常用于生根。 IAA：v稳定性稳定性： 2,4-D、NAA 性质稳定；性质稳定；IBA 、IAA易变性。易变性。v溶解溶解：95%酒精或酒精或0.1mol/LNaoH（1 1）作用：）作用：主要用于促进细胞分裂和芽的分化。主要用于促进细胞分裂和芽的分化。主要用于：主要用于：诱导芽的分化；诱导芽的分化； 解除顶端优势，促进侧芽生长与解除顶端优势，促进侧芽生长

22、与茎芽的增殖茎芽的增殖 ； 延缓组织衰老，增强蛋白质的合成，显著改变延缓组织衰老，增强蛋白质的合成，显著改变其他激素作用。其他激素作用。（2 2）使用种类）使用种类： 玉米素（玉米素（ZT）、）、6-苄基腺嘌呤（苄基腺嘌呤（6-BA）激动素（激动素（KT）、）、2-异戊烯基腺嘌呤（异戊烯基腺嘌呤（2iP）（3 3）活性强弱）活性强弱ZT=2-iP 6-BAKT。 2. 2. 细胞分裂素类细胞分裂素类（4 4）应用情况：）应用情况：使用浓度范围为使用浓度范围为0.110mg/L，常用，常用的浓度为的浓度为0.12mg/L。 ZT：作用最强；价格昂贵。：作用最强；价格昂贵。6-BA ：应用最广泛。

23、：应用最广泛。2iP：在某些木本植物（杜鹃）的茎芽分化中效果不错在某些木本植物（杜鹃）的茎芽分化中效果不错KT：可部分代替：可部分代替6-BA 的作用。的作用。（5 5）稳定性：）稳定性： 6-BA和和2-iP性质稳定性质稳定 ；ZT、KT易变性。易变性。（6 6）溶解性：）溶解性：0.5或或1mol/LNaoH或或HCL3.其他激素其他激素（1 1）赤霉素类）赤霉素类 常用的是常用的是GA3。GA3具有促进茎细胞伸长和打破休眠的具有促进茎细胞伸长和打破休眠的作用，作用， 主要用于促进已分化茎芽的伸长生长、刺激胚状体正主要用于促进已分化茎芽的伸长生长、刺激胚状体正常发育成小植株以及打破有些植物

24、的种子、块茎、磷茎等常发育成小植株以及打破有些植物的种子、块茎、磷茎等的休眠。的休眠。（2 2）脱落酸）脱落酸 ABA具有抑制蛋白质合成、诱导休眠、促进衰老和脱具有抑制蛋白质合成、诱导休眠、促进衰老和脱落的作用；也具有抵消和抑制生长素、细胞分裂素和赤霉落的作用；也具有抵消和抑制生长素、细胞分裂素和赤霉素发挥作用的效应。素发挥作用的效应。（3 3）乙烯）乙烯 乙烯含量的提高，将会引起培养物衰老、玻璃化、落乙烯含量的提高，将会引起培养物衰老、玻璃化、落叶甚至死亡等不良反应。叶甚至死亡等不良反应。附加物类主要包括琼脂、活性炭、抗生素、抗氧化剂、附加物类主要包括琼脂、活性炭、抗生素、抗氧化剂、附加物类

25、主要包括琼脂、活性炭、抗生素、抗氧化剂、附加物类主要包括琼脂、活性炭、抗生素、抗氧化剂、生长抑制剂等。生长抑制剂等。生长抑制剂等。生长抑制剂等。 1. 1. 琼脂琼脂琼脂琼脂A. A. 作用：作用：作用：作用：B. B. 用量：用量：用量：用量：0.4%-1%0.4%-1%，用量过大培养基变硬，用量过大培养基变硬，用量过大培养基变硬，用量过大培养基变硬，从而影响营养物质的扩散和培养物对养分的吸收；用量不足从而影响营养物质的扩散和培养物对养分的吸收；用量不足从而影响营养物质的扩散和培养物对养分的吸收；用量不足从而影响营养物质的扩散和培养物对养分的吸收；用量不足培养基凝固不良，起不到支撑作用。培养

26、基凝固不良，起不到支撑作用。培养基凝固不良，起不到支撑作用。培养基凝固不良，起不到支撑作用。 2. 2. 活性炭活性炭活性炭活性炭 A. A. 作用：作用：作用：作用：吸附功能，除去培养基中的有毒物或培养物产吸附功能，除去培养基中的有毒物或培养物产吸附功能，除去培养基中的有毒物或培养物产吸附功能，除去培养基中的有毒物或培养物产生的有毒代谢产物；防止组织褐变、刺激胚胎发生、利于培生的有毒代谢产物；防止组织褐变、刺激胚胎发生、利于培生的有毒代谢产物；防止组织褐变、刺激胚胎发生、利于培生的有毒代谢产物；防止组织褐变、刺激胚胎发生、利于培养物生根等功能。养物生根等功能。养物生根等功能。养物生根等功能。

27、 B. B. 用量：用量：用量：用量：0.2%-0.5%0.2%-0.5%（四）（四）附加物类附加物类3抗生素抗生素作用：防止和控制菌类污染，减少培养材料的损失。作用：防止和控制菌类污染，减少培养材料的损失。种类：常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素、庆大霉种类：常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素、庆大霉素等，用量一般在素等，用量一般在520mg/L。 使用抗生素不能代替无菌操作。使用抗生素不能代替无菌操作。4抗氧化剂抗氧化剂作用作用:控制或缓解培养材料的褐变控制或缓解培养材料的褐变种类种类:半胱氨酸、抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮（半胱氨酸、抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、）、谷胱甘肽、二硫

28、苏糖醇等。谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。5生长抑制剂生长抑制剂作用作用:调节内源与外源植物激素的平衡，利于培养物的生调节内源与外源植物激素的平衡，利于培养物的生长和分化长和分化种类种类:根皮苷、三碘苯甲酸、矮壮素、比久（根皮苷、三碘苯甲酸、矮壮素、比久（B9）、间苯）、间苯三酚等三酚等（五）培养基的酸碱度和渗透压（五）培养基的酸碱度和渗透压1 1. 培养基的培养基的PH（1）调节）调节PH的必要性的必要性（2）调节方法：）调节方法：酸度计或精密酸度计或精密pH试纸，试纸，配好的培养基常偏酸，配好的培养基常偏酸，偏碱的情况很少见偏碱的情况很少见 。（3）调节依据调节依据 培养基的培养基的pH因培养材料

29、不同而异，大多数植物适宜的因培养材料不同而异，大多数植物适宜的pH在在5.66.0之间之间 。 pH的大小影响到培养基的固化程度。的大小影响到培养基的固化程度。Ph6.0Ph6.0时，培养基将时，培养基将会变硬；会变硬；5.06.2 失效失效柠檬酸铁柠檬酸铁PH6.0 失效失效2培养基的渗透压培养基的渗透压（1 1）意义：）意义：当培养材料和培养基之间处于等渗时，或培养材当培养材料和培养基之间处于等渗时，或培养材料的渗透压微低于培养基渗透压时，培养材料才可能料的渗透压微低于培养基渗透压时，培养材料才可能从培养基中汲取养分。从培养基中汲取养分。（2 2）培养基渗透压的调节）培养基渗透压的调节 调

30、节渗透压往往从调节糖浓度着手。调节渗透压往往从调节糖浓度着手。 渗透压的调节应根据培养材料、培养目的等的不渗透压的调节应根据培养材料、培养目的等的不渗透压的调节应根据培养材料、培养目的等的不渗透压的调节应根据培养材料、培养目的等的不同进行同进行同进行同进行 ：对大多数植物而言，糖的使用浓度在对大多数植物而言，糖的使用浓度在对大多数植物而言，糖的使用浓度在对大多数植物而言，糖的使用浓度在2%5%2%5%的范围内是适宜的。的范围内是适宜的。的范围内是适宜的。的范围内是适宜的。如：如：如：如：幼胚、原生质体花粉培养：较高的渗透压幼胚、原生质体花粉培养：较高的渗透压幼胚、原生质体花粉培养：较高的渗透压

31、幼胚、原生质体花粉培养：较高的渗透压 根的分化：根的分化：根的分化：根的分化：较低的渗透压较低的渗透压较低的渗透压较低的渗透压 二、培养基种类及其特点二、培养基种类及其特点（一）培养基（一）培养基种类种类种类种类特点特点举例举例高无机盐含量高无机盐含量培养基培养基钾盐、铵盐及硝酸盐的含量较高，钾盐、铵盐及硝酸盐的含量较高，微量元素种类齐全，营养组成和比微量元素种类齐全，营养组成和比例也比较合理，例也比较合理，MS、LS、BL、RM、ER等等较高硝酸钾含量较高硝酸钾含量培养基培养基KNO3的使用量远远高于其他无机的使用量远远高于其他无机盐盐B5、N6、SH、GS等等中等无机盐含量中等无机盐含量培

32、养基培养基大量元素约为大量元素约为MS培养基的一半，培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较微量元素种类减少，但含量较MS的高的高Nitsch、NT、H、Miller等等低无机盐含量低无机盐含量培养基培养基大量元素含量大幅度降低并且种类大量元素含量大幅度降低并且种类减少减少改良改良White、Heller、WS、Knop、HB等等NH4NO31650720KNO31900809502830CaCl2.2H2O440166CaCl2166MgSO4.7H2O370750185185KH2PO417068400(NH4)2SO4463Ca(NO3)2.4H2O300Na2SO4200NaH2PO4

33、.2H2O19KCl65KI0.830.750.8H3BO36.21.5101.6MnSO4.4H2O22.35254.4ZnSO4.7H2O8.63101.5NaMoO4.2H2O0.2525MoO30.001CuSO4.5H2O0.0250.010.025CoCl26H2O0.025Fe2(SO4)32.5FeSO4.7H2O27.827.827.8Na2.EDTA.2H2O37.337.337.3组成组成MSWhiteNitschN6三、培养基的配制三、培养基的配制配制母液配制母液配制母液配制母液量取母液并混合量取母液并混合量取母液并混合量取母液并混合称量琼脂、蔗糖，充分熔解琼脂。称量琼

34、脂、蔗糖，充分熔解琼脂。称量琼脂、蔗糖，充分熔解琼脂。称量琼脂、蔗糖，充分熔解琼脂。定容定容定容定容调调调调PHPH分装分装分装分装密封与标记密封与标记密封与标记密封与标记灭菌灭菌灭菌灭菌使用或暂存使用或暂存使用或暂存使用或暂存第四节第四节 组织培养的基本程序组织培养的基本程序选择品种、植株、取材部位选择品种、植株、取材部位选择品种、植株、取材部位选择品种、植株、取材部位截取、切割外植体截取、切割外植体截取、切割外植体截取、切割外植体外植体的灭菌与接种外植体的灭菌与接种 组培苗的驯化与移栽组培苗的驯化与移栽 离体培养离体培养离体培养离体培养、根芽形成、植株再生、根芽形成、植株再生、根芽形成、植

35、株再生、根芽形成、植株再生1.依据培养目的，选择性状优良、生长健壮、无病虫害的依据培养目的，选择性状优良、生长健壮、无病虫害的品种或植株。品种或植株。2.做好取材部位、取材季节、试材做好取材部位、取材季节、试材生理状态和发育年龄生理状态和发育年龄的的选择。选择。（1）取材部位）取材部位A.培养目的；培养目的；B.外植体（培养材料）应易获得，来源广，易培养。外植体（培养材料）应易获得，来源广，易培养。C.外植体经培养后是否会发生变异（变异的程度和优劣）外植体经培养后是否会发生变异（变异的程度和优劣）对大多数植物而言：对大多数植物而言：茎尖是较好的取材部位；茎尖是较好的取材部位；叶片是许多植物组培

36、的起始材料；叶片是许多植物组培的起始材料； 对一些培养较困难的植物，可通过其子叶或下胚轴来建对一些培养较困难的植物，可通过其子叶或下胚轴来建立起组织培养再生体系立起组织培养再生体系。一、培养材料的选择和预处理一、培养材料的选择和预处理（2）取材季节）取材季节（3）外植体大小的选择外植体大小的选择外植体的大小应根据植物材料和培养目的而定外植体的大小应根据植物材料和培养目的而定： 枝段、茎段：包含腋芽，一般枝段、茎段：包含腋芽，一般0.5-2cm 茎尖脱毒：茎尖脱毒：0.2mm以下以下 叶片、鳞片等：叶片、鳞片等：0.5-2cm23.材料的材料的处理处理（1）母株的母株的预栽培：温室栽培、水培、暗

37、培养等。预栽培：温室栽培、水培、暗培养等。（2）打破休眠：低温和赤霉素处理。）打破休眠：低温和赤霉素处理。（3）对材料的简单清理：去枯、去斑、清洗等。）对材料的简单清理：去枯、去斑、清洗等。试材的生理状态和发育年龄的影响试材的生理状态和发育年龄的影响一般沿植物主轴，越向上一般沿植物主轴，越向上部分所形成的器官的生长部分所形成的器官的生长时间越短其生理年龄也相时间越短其生理年龄也相应越老，越接近发育上的应越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官。成熟，越易形成花器官。沿植物主轴越向下，所形沿植物主轴越向下，所形成的器官的生长时间越长成的器官的生长时间越长其生理年龄也相应越幼，其生理年龄也相应越幼

38、，越易形成芽器官。越易形成芽器官。如烟草的表皮组培中，下部组织产生营养芽如烟草的表皮组培中，下部组织产生营养芽的比例高，的比例高，而上部产生花器官的比例大。而上部产生花器官的比例大。二、外植体的灭菌与接种二、外植体的灭菌与接种1.1.外植体的灭菌外植体的灭菌2.2.接种接种：经过灭菌的植物材料，按照不同的培养要求，：经过灭菌的植物材料，按照不同的培养要求，经过剪切、分割处理后，移至培养基上（中）的经过剪切、分割处理后，移至培养基上（中）的全部操作过程，称为全部操作过程，称为“接种接种”。v注意：注意： 接种于固体培养基上的材料要求既要和培养基达到接种于固体培养基上的材料要求既要和培养基达到最大

39、面积的接触最大面积的接触，又要避免完全嵌入培养基。，又要避免完全嵌入培养基。 接种过程中应避免任何外界和操作不当引起的污染。接种过程中应避免任何外界和操作不当引起的污染。 单瓶内接多个材料时，应使之单瓶内接多个材料时，应使之均匀分散开均匀分散开。1.调整好培养室的温度、关照、湿度等培养条件。调整好培养室的温度、关照、湿度等培养条件。2.定期进行观察，根据变化做适宜调整。定期进行观察，根据变化做适宜调整。3.剔除遭污染的材料。剔除遭污染的材料。三、外植体的培养三、外植体的培养外植体外植体外植体外植体愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织芽或胚状体芽或胚状体芽或胚状体芽或胚状体生根或壮苗生根或壮苗生根或

40、壮苗生根或壮苗芽或胚状体芽或胚状体芽或胚状体芽或胚状体完整试管苗完整试管苗完整试管苗完整试管苗四、组培苗的驯化与移栽四、组培苗的驯化与移栽（一）组培苗的特点（一）组培苗的特点1根发育不良，无吸收功能或极低。根发育不良，无吸收功能或极低。2茎叶表面缺乏保护组织，气孔难以关闭并且开茎叶表面缺乏保护组织，气孔难以关闭并且开口过大，极易散失水分。口过大，极易散失水分。3叶绿体发育不良，叶绿素含量低，叶片的光合叶绿体发育不良，叶绿素含量低，叶片的光合作用很弱。作用很弱。（二）组培苗的驯化与移栽（二）组培苗的驯化与移栽1.原则原则2.过程过程v驯化过程应遵循逐步过渡的原则。驯化过程应遵循逐步过渡的原则。

41、一一般般来来说说，在在开开始始数数天天内内，驯驯化化条条件件应应与与离离体体培培养养时时的的环环境境条条件件相相近近，而而在在驯驯化化后后期期，应应逐逐步步过过渡渡到到与与自自然然栽栽培条件相仿。培条件相仿。以实现：以实现：异养异养异养异养无菌无菌自养自养高湿高湿低湿低湿恒温恒温变温变温有菌有菌弱光弱光强光强光过渡过渡过渡过渡离离离离体体体体培培培培养养养养条条条条件件件件自自自自然然然然生生生生长长长长条条条条件件件件组培苗的驯化移栽过程组培苗的驯化移栽过程1.获得根系良好的壮苗（获得根系良好的壮苗（生根或壮苗阶段生根或壮苗阶段）。）。2.开瓶进行湿度和光照锻炼；开瓶进行湿度和光照锻炼；让小

42、苗直接接触外界环境，加强光照强度，降低湿度，让小苗直接接触外界环境，加强光照强度，降低湿度，使小苗由异养逐步过度到自养。一般锻炼一周左右。使小苗由异养逐步过度到自养。一般锻炼一周左右。3.将经初步锻炼的小苗转移到苗床上。将经初步锻炼的小苗转移到苗床上。（1）移栽前应将小苗基部的培养基洗净，以免招致微生物侵）移栽前应将小苗基部的培养基洗净，以免招致微生物侵染。染。（2）移栽后一定加强管理，注意保湿和遮荫。）移栽后一定加强管理，注意保湿和遮荫。（3）培养初期可以适当浇灌营养液。）培养初期可以适当浇灌营养液。4.将成活的小苗移栽到大田。将成活的小苗移栽到大田。第五节第五节 外植体的褐变与玻璃化苗外植

43、体的褐变与玻璃化苗一、外植体的一、外植体的褐变褐变（一）褐变的（一）褐变的原因原因 （二）影响褐变的（二）影响褐变的因素因素 （三）控制褐变的（三）控制褐变的措施措施 二、玻璃化苗二、玻璃化苗 （一）玻璃化（一）玻璃化现象现象及其产生及其产生原因原因 （二）克服玻璃化苗的（二）克服玻璃化苗的防范措施防范措施 （一）褐变的原因（一）褐变的原因v褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少以及多褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少以及多酚氧化酶的活性有直接关系。酚氧化酶的活性有直接关系。v当当外外植植体体经经受受切切割割处处理理时时，酚酚类类化化合合物物外外溢溢并并与与多多酚酚氧氧化化酶酶

44、接接触触，在在多多酚酚氧氧化化酶酶的的催催化化下下酚酚类类化化合合物物迅迅速速被被氧氧化化成成褐褐色色的的醌醌类类物物质质，醌醌类类又又会会在在酪酪氨氨酸酸酶酶等等酶酶的的作作用用下下，与与外外植植体体组组织织中中的的蛋蛋白白质质发发生生聚聚合合，进进一一步步引引起起其其他他酶酶系系统统失失活活，从而导致整个组织代谢紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。从而导致整个组织代谢紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。（二）影响褐变的因素（二）影响褐变的因素1植物材料植物材料（1）基因型）基因型（2）试材的生理状态）试材的生理状态（3）外植体的大小及其受伤害程度）外植体的大小及其受伤害程度2培养基培养基（1）培养基的

45、物理状态）培养基的物理状态（2）培养基成分）培养基成分（3）培养基）培养基pH3环境条件环境条件（1）光照）光照（2）温度）温度4培养方式培养方式（1）转瓶周期）转瓶周期（2）植板密度）植板密度（三）控制褐变的措施（三）控制褐变的措施1选择适宜的外植体和培养条件选择适宜的外植体和培养条件 选取具较强分生能力的外植体；选取具较强分生能力的外植体； 筛选和调整培养基组成（无机盐、植物激素等）筛选和调整培养基组成（无机盐、植物激素等） 确定适宜的光照、温度等环境条件。确定适宜的光照、温度等环境条件。2使用抗氧化剂使用抗氧化剂 如抗坏血酸（如抗坏血酸（VC）、聚乙烯吡咯烷酮（）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP

46、）、血清白）、血清白蛋白、柠檬酸、硫代硫酸钠、间苯三酚、炭粉等。蛋白、柠檬酸、硫代硫酸钠、间苯三酚、炭粉等。3改变培养方式改变培养方式 采用液体培养或连续转移培养的方式采用液体培养或连续转移培养的方式。（一）玻璃化（一）玻璃化现象现象及其产生原因及其产生原因1.玻璃化现象玻璃化现象v形态上：叶、嫩稍呈水晶透明或半透明，水浸状；植株矮形态上：叶、嫩稍呈水晶透明或半透明，水浸状；植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲；茎叶脆弱易碎。小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲；茎叶脆弱易碎。v解剖结构上：茎尖分生组织相对较小，保持时期也短；细解剖结构上：茎尖分生组织相对较小，保持时期也短；细胞膨大，胞质稀，核

47、变小，液泡化；细胞壁结构不完整；胞膨大，胞质稀，核变小，液泡化；细胞壁结构不完整；叶表缺少角质层蜡质或蜡质发育不完全；没有功能性气孔；叶表缺少角质层蜡质或蜡质发育不完全；没有功能性气孔；叶片不具有栅栏组织，仅有海绵组织；输导组织虽存在，叶片不具有栅栏组织，仅有海绵组织；输导组织虽存在，但导管和管胞木质化不完全。但导管和管胞木质化不完全。v生理生化特点：苗含水量很高，干物质、叶绿素、蛋白质、生理生化特点：苗含水量很高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素等成分的含量低；吸收和光合作用的能力纤维素和木质素等成分的含量低；吸收和光合作用的能力降低，分化能力也下降，生根困难，很难实现移栽成活。降低，

48、分化能力也下降，生根困难，很难实现移栽成活。2. 2. 产生玻璃化苗的原因产生玻璃化苗的原因(1)(1)植物材料植物材料(2)(2)培养基培养基 激素种类与浓度激素种类与浓度 一般激素浓度的增加尤其是细胞分裂素用量的提高一般激素浓度的增加尤其是细胞分裂素用量的提高（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产生。生。 琼脂用量与糖浓度琼脂用量与糖浓度 适当增加琼脂用量或提高糖浓度有助于减少玻璃化苗适当增加琼脂用量或提高糖浓度有助于减少玻璃化苗的发生。的发生。 （二）克服玻璃化苗的防范措施（二）克服玻璃化苗的防范措施1适当提高培养基中的蔗糖浓

49、度和琼脂用量。适当提高培养基中的蔗糖浓度和琼脂用量。2改善培养容器的气体交换状况改善培养容器的气体交换状况。3控制培养温度，增强光照控制培养温度，增强光照4改进培养基的组成改进培养基的组成 适当降低培养基中的细胞分裂素浓度，提高生长素比适当降低培养基中的细胞分裂素浓度，提高生长素比例；或适当增加培养基中钙、镁、锰、钾、磷、铁、铜、例；或适当增加培养基中钙、镁、锰、钾、磷、铁、铜、锌的含量，降低氮和氯元素的比例，特别是降低铵态氮浓锌的含量，降低氮和氯元素的比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量，可减少玻璃化苗的发生。度，提高硝态氮含量，可减少玻璃化苗的发生。5在培养基中添加其他物质在培养基中添加其他物质如如间苯三酚、聚乙烯醇、多效唑、矮壮素、活性炭等间苯三酚、聚乙烯醇、多效唑、矮壮素、活性炭等附加物。附加物。香石竹香石竹香石竹香石竹玻璃化苗玻璃化苗玻璃化苗玻璃化苗