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1、第第八八章章 工业微生物杂交育种工业微生物杂交育种第一节、微生物杂交第一节、微生物杂交第二节第二节、放线菌杂交育、放线菌杂交育种种 第三节第三节、酵母菌杂交育、酵母菌杂交育种种第四节第四节、霉菌杂交育、霉菌杂交育种种第一节第一节 微生物杂交微生物杂交 杂交育种包括杂交育种包括常规杂交常规杂交、控制杂交控制杂交和和原原生质体融合生质体融合等方法。等方法。 杂交的目的在于使双亲或多亲的遗杂交的目的在于使双亲或多亲的遗传物质重新组合，传物质重新组合，以获得综合双亲或多亲以获得综合双亲或多亲优良性状的新品种。优良性状的新品种。 一、一、 杂交的意义杂交的意义（优点）（优点） 第一、改变亲株的遗传物质基
2、础，扩大变异范围，第一、改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。 第二、可以提高其对诱变剂的敏感性，降低对诱变第二、可以提高其对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的剂的“疲劳疲劳”效应。效应。 第三，通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，第三，通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促迸遗传学理论的发展丰富并促迸遗传学理论的发展。二、微生物杂交育种基本程序二、微生物杂交育种基本程序 选择原始亲本选择原始亲本诱变筛选直接亲本诱变筛选直接亲本直接亲本之间亲和直接亲本之间亲和力鉴定力鉴定杂交杂交分离到基本
3、培养基或选择性培养基培养分离到基本培养基或选择性培养基培养筛选重组体筛选重组体重组体分析鉴定。重组体分析鉴定。 三、杂交过程中亲本和培养基的选择三、杂交过程中亲本和培养基的选择 （一）亲本菌株的选择（一）亲本菌株的选择 1 1、原始亲本、原始亲本 原始亲本是微生物杂交育种中具有不同遗传背原始亲本是微生物杂交育种中具有不同遗传背景的优质出发菌株，主要根据杂交的目的来选择。景的优质出发菌株，主要根据杂交的目的来选择。从从育种角度出发通常选择具有优良性状如产量高、代育种角度出发通常选择具有优良性状如产量高、代谢快、产孢子能力强、无色素、泡沫少、粘性小等发谢快、产孢子能力强、无色素、泡沫少、粘性小等发
4、酵性能好的菌株为原始亲本。它们可以来自生产用菌酵性能好的菌株为原始亲本。它们可以来自生产用菌或突变过程中的某些符合要求的菌株，也可以是自然或突变过程中的某些符合要求的菌株，也可以是自然分离的野生型菌株。原始亲本还应该具有野生型遗传分离的野生型菌株。原始亲本还应该具有野生型遗传标记，如具有一定的孢子颜色、可溶性色素抗性标记标记，如具有一定的孢子颜色、可溶性色素抗性标记等明显不同的性状。等明显不同的性状。 2直接亲本直接亲本 在杂交育种中具有遗传标记和亲和能力而直接用于杂在杂交育种中具有遗传标记和亲和能力而直接用于杂交配对的菌株，称为直接亲本。它们由原始亲本菌株经诱交配对的菌株，称为直接亲本。它们
5、由原始亲本菌株经诱变剂处理后选出的具营养缺陷型标记或其他遗传标记，又变剂处理后选出的具营养缺陷型标记或其他遗传标记，又通过亲和力测定的直接用于杂交的菌株通过亲和力测定的直接用于杂交的菌株。（二）培养基（二）培养基 杂交过程中常用的培养基有完全培养基（杂交过程中常用的培养基有完全培养基（C CM M）、基本）、基本培养基（培养基（MMMM）、有限培养基（）、有限培养基（LMLM）和补充培养基（）和补充培养基（SMSM）。）。四、杂交育种的遗传标记四、杂交育种的遗传标记 1 1营养缺陷型标记营养缺陷型标记 2 2抗性标记抗性标记 3 3温度敏感性标记温度敏感性标记 4 4其他性状标记其他性状标记
6、如孢子颜色、菌落形态结构、可溶性色素舍量、代如孢子颜色、菌落形态结构、可溶性色素舍量、代谢产物产量高低和代谢返速度快慢等，以及利用的碳、谢产物产量高低和代谢返速度快慢等，以及利用的碳、氮原种类、杀伤力等其他性状都可以作为重组体检出氮原种类、杀伤力等其他性状都可以作为重组体检出的辅助性标记。的辅助性标记。 五、杂交育种方法五、杂交育种方法1 1常规杂交育种常规杂交育种 丝状真核微生物通过接合、染色体交换，然丝状真核微生物通过接合、染色体交换，然后分离形成重组体。常规杂交主要包括接合、转化、后分离形成重组体。常规杂交主要包括接合、转化、转导、溶原转换和转染等技术。转导、溶原转换和转染等技术。 2
7、2原生质体杂交育种原生质体杂交育种 第第二二节节 放线菌杂交育种放线菌杂交育种一、放线菌细胞结构与繁殖一、放线菌细胞结构与繁殖二、放线菌杂交概况和原理二、放线菌杂交概况和原理（一）放线菌杂交原理（一）放线菌杂交原理 放放线菌杂交在原理上基本上线菌杂交在原理上基本上类似于大肠杆菌类似于大肠杆菌，通，通过供体向受体转移部分染色体，经过遗传物质交换，过供体向受体转移部分染色体，经过遗传物质交换，最终达到基因重最终达到基因重组。组。 有有一部分放线菌在杂交过程中会形成一部分放线菌在杂交过程中会形成异核体异核体，但这，但这种异核体与霉菌异核体不同，在复制过程中染色体不种异核体与霉菌异核体不同，在复制过程
8、中染色体不发生交发生交换换。因。因此，在放线菌此，在放线菌杂交重杂交重组过程中，异核体组过程中，异核体的作用不大。只有经部分染色体转移途径形成的部分的作用不大。只有经部分染色体转移途径形成的部分结合子，才是亲本间遗传信息传递和基因重组的关键。结合子，才是亲本间遗传信息传递和基因重组的关键。（二）放线菌杂交的过程（二）放线菌杂交的过程1 1、接合、接合2 2、杂合系和重组体杂合系、杂合系和重组体杂合系3 3、重组体、重组体三、放线菌的杂交技三、放线菌的杂交技术术 放线菌杂交方法有混合培养法、玻璃纸法和平板杂交法等几种放线菌杂交方法有混合培养法、玻璃纸法和平板杂交法等几种 （一）混合培养法（一）混
9、合培养法1 1直接亲本是杂交配对菌株直接亲本是杂交配对菌株2 2斜面混合培养斜面混合培养3 3单孢悬液的制备单孢悬液的制备4 4重组体的检出重组体的检出（1 1）原养型重组体的检出：（）原养型重组体的检出：（2 2）异养型重组体的）异养型重组体的检出：检出：5 5杂合系分析杂合系分析 杂合系菌落的分离：杂合系菌落的分离： 重组体的鉴别：重组体的鉴别： 重组体获得后，其中把原养型重组体进一步按重组体获得后，其中把原养型重组体进一步按育种程序迸行研究。育种程序迸行研究。 混合孢子液混合孢子液基本培养基基本培养基10-15d 10-15d 互互养杂合体和养杂合体和回复突变回复突变原养性重组原养性重组
10、体体 混合孢子液混合孢子液 选择培养基选择培养基影印到基本培养基和影印到基本培养基和选择培养基选择培养基（二）玻璃纸法（二）玻璃纸法 1 1玻璃纸法的原理玻璃纸法的原理 2 2玻璃纸法平板杂交的具体办法玻璃纸法平板杂交的具体办法 3 3分离子的检出和鉴别分离子的检出和鉴别（三）平板杂交法（三）平板杂交法第第三三节节 酵母菌的杂交育种酵母菌的杂交育种一、酵母菌的细胞结构和菌落形态一、酵母菌的细胞结构和菌落形态二、酵母菌的主活史和繁殖方式二、酵母菌的主活史和繁殖方式三、酵母菌的杂交三、酵母菌的杂交（一）标记菌（一）标记菌株的选择株的选择 常用的标记是营养缺陷型或抗性突变基因。常用的标记是营养缺陷型
11、或抗性突变基因。（二）酵母杂交方法（二）酵母杂交方法 1 1子囊孢子的制备子囊孢子的制备 2 2杂交杂交 第第四四节节 霉菌杂交育种霉菌杂交育种 一、霉菌细胞结构和繁殖一、霉菌细胞结构和繁殖 二、霉菌杂交的原理和杂交要求二、霉菌杂交的原理和杂交要求 霉菌杂交育种是利用准性生殖过程中的基因重组霉菌杂交育种是利用准性生殖过程中的基因重组和分离现象，将不同菌株的优良特性集合到一个新菌和分离现象，将不同菌株的优良特性集合到一个新菌株申，然后通过筛选出具有新遗传结构和优良遗传特株申，然后通过筛选出具有新遗传结构和优良遗传特性的新菌种。性的新菌种。 （一）异核体的形成与获得方法（一）异核体的形成与获得方法
12、1 1选择直接亲本选择直接亲本2 2异核体合成方法异核体合成方法1 1）完全培养基的混合培养法）完全培养基的混合培养法2 2）基本培养基衔接方法）基本培养基衔接方法3 3）有限培养基培养法）有限培养基培养法（二）杂合二倍体的形成和检出（二）杂合二倍体的形成和检出1 1杂合二倍体的形成和诱发杂合二倍体的形成和诱发2 2杂合二倍体的表型杂合二倍体的表型3 3杂合二倍体的检出杂合二倍体的检出（三）体细胞交换、分离和单倍化（三）体细胞交换、分离和单倍化1 1体细胞交换体细胞交换2 2体细胞分离体细胞分离3 3单倍化单倍化4 4分离子分离子5 5分离子的检出和测定方法分离子的检出和测定方法 三、高产重组
13、体的筛选三、高产重组体的筛选 通过杂交枝术得到的杂交二倍体在遗传特性方面是通过杂交枝术得到的杂交二倍体在遗传特性方面是不隐定的，在繁殖过程中要发生染色体交换，基因重不隐定的，在繁殖过程中要发生染色体交换，基因重组和分离。根据这种特性，可以结合诱变育种和代谢组和分离。根据这种特性，可以结合诱变育种和代谢调节来达到杂交育种的目的。对此选育路线上要往意调节来达到杂交育种的目的。对此选育路线上要往意几个方面：杂交亲本选择，不仅要具有优良的性状，几个方面：杂交亲本选择，不仅要具有优良的性状，而且最好是近亲配对组合，这样易获得产量高的重组而且最好是近亲配对组合，这样易获得产量高的重组体，远亲杂交虽然也能得
14、到杂合二倍体，但经诱变处体，远亲杂交虽然也能得到杂合二倍体，但经诱变处理后，会发生严重遗传分离现象，产量将大幅度下降，理后，会发生严重遗传分离现象，产量将大幅度下降，难以达到育种目的；采用适合的诱变剂处理杂合二倍难以达到育种目的；采用适合的诱变剂处理杂合二倍体，使其适应酶系统代谢调控；重组体在摇瓶筛选阶体，使其适应酶系统代谢调控；重组体在摇瓶筛选阶段，应做到摇瓶培养条件和大生产条件尽量接近，以段，应做到摇瓶培养条件和大生产条件尽量接近，以便新菌种能推广到大生产中去，特别对少数有价值的便新菌种能推广到大生产中去，特别对少数有价值的菌株在小型罐上试验有关发酵参数，以指导大生产。菌株在小型罐上试验有
15、关发酵参数，以指导大生产。 与常规杂交相比，原生质体融合具有多方面的优势：与常规杂交相比，原生质体融合具有多方面的优势：第一大幅度提高亲本之间重组频率。第一大幅度提高亲本之间重组频率。第二扩大重组的亲本范围。第二扩大重组的亲本范围。第三原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物第三原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状机会更质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状机会更大。大。 不足之处是原生质体融合后不足之处是原生质体融合后DNADNA交换和重组随交换和重组随机发生，增加重组体分离筛选的难度机发生，增加重组体分离筛选的难度。 一、直接亲本及遗传
16、标记的选择一、直接亲本及遗传标记的选择1 1、“正突变株正突变株”作为直接亲本作为直接亲本 2 2、遗传标记除常用的带隐性性状的营养缺陷和抗性标记、遗传标记除常用的带隐性性状的营养缺陷和抗性标记之外，也可采用热致死（灭话）、孢子颜色和菌落形之外，也可采用热致死（灭话）、孢子颜色和菌落形态等作为标记。态等作为标记。 3 3、最好采用灭活，把双亲中任何一方的原主质体用热灭、最好采用灭活，把双亲中任何一方的原主质体用热灭活（如活（如5050，2h2h或或6060，5 min5 min）或用紫外线、药物灭）或用紫外线、药物灭活，使细胞内的某些酶或代谢途径钝化，然后和另一活，使细胞内的某些酶或代谢途径钝化，然后和另一方具有正常活性的原生质体融合而获得重组体。前者方具有正常活性的原生质体融合而获得重组体。前者为供体后者为受体，这样可以省去营养缺陷型的遗传为供体后者为受体，这样可以省去营养缺陷型的遗传标记。采用灭活标记融合频率较低，但重组佯体产量标记。采用灭活标记融合频率较低，但重组佯体产量较高。较高。4 4、加荧光染色标记、加荧光染色标记
