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1、第三章第三章 微生物的营养与生长微生物的营养与生长江南大学生物工程学院江南大学生物工程学院微生物的营养与生长 从生物学的观点来看，微生物活细从生物学的观点来看，微生物活细胞是个新陈代谢的动力系统，它从环境胞是个新陈代谢的动力系统，它从环境不断地吸收营养物质，通过新陈代谢，不断地吸收营养物质，通过新陈代谢，实现生长和繁殖，同时排出实现生长和繁殖，同时排出“废物废物”。 笫一节微生物的营养 营营养养物物质质nutriment：微生物在生命活动中从环境中吸取的用以提供能量、调节新陈代谢以及合成细胞物质的物质。在发酵工业上也包括用于合成产物。营养营养(过程)nutrition：微生物吸收和利用营养物质
2、的过程。 一、微生物细胞的化学组成一、微生物细胞的化学组成1、元素组成：C、H、O、N、P、S、K、Na、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo。其中C、H、O、N、P占细胞干重的97%。2、物质组成(1)水：约占细胞湿重的90%。(2)有机物：主要有蛋白质、碳水化合物、脂类、核酸、维生素以及它们的合成中间体和降解物。(3)无机盐：灰分元素是指参与有机物组成及单独存在于细胞原生质内的无机盐等灰分物质中的元素。3影响微生物细胞化学组成的因素(1)微生物的种类：硫细菌、铁细菌、海洋细菌含有较多的S、Fe、Cl和Na。(2)菌龄：幼龄菌中含氮量较高。(3)培养条件：在氮源丰富的环境中生长的微
3、生物含氮量较高。 微生物细胞元素组成部部分分发发酵酵产产品品的的元元素素组组成成二二. .微生物的营养物质微生物的营养物质1、水水v水的生理功能细胞的重要组分微生物进行代谢活动的介质 参与部分生化反应调节和控制细胞温度几种生物的游离水含量 人：60%海蛰：96%微生物：孢子：霉菌孢子：39% 细菌芽孢：皮层：70% 核心：极低 营养体：细菌：80% 酵母：75% 霉菌：85%v环境中水的存在状态结合水：与溶质或其它分子结合而不能被微生物所利用状态的水；游离水：可以被微生物所利用的水v水活度water activity aw= p/p0v微生物生长要求：aw=0.630.992.碳源 carbo
4、n sourcev凡是能被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。v生理功能 提供C元素 提供能量v碳源物质 有机碳化物 无机碳化物微生物的碳源谱类型 元素水平化合物水平培养基原料水平有 机 碳CHONX复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、蛋白胨、豆饼粉等CHON多数氨基酸、简单蛋白质等一般氨基酸、明胶等CHO糖、有机酸、醇、脂类等葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、糖蜜等CH烃类天然气、石油及其不同馏分、石蜡油等无 机 碳C(?)-COC02CO2CONNaCO3、CaCO3等NaCO3、CaCO3、白垩等3.氮源 nitrogen source凡是能被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中氮素来源的营
5、养物质称为氮源是构成细胞中核酸和蛋白质的重要元素，只为少数细菌提供能量氮源的种类 无机氮、有机氮、气体氮微生物的氮源谱类型元素水平化合物水平培养基原料水平有 机 氮NCHOX复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、酵母膏、豆饼粉、蚕蛹等NCHO尿素、多数氨基酸、简单蛋白质等尿素、蛋白胨、明胶等无 机 氮NHNH3、铵盐等（NH4）2SO4等NO硝酸盐等KNO3等NN2空气速效性氮源 能够被微生物细胞直接吸收和利用的有机氮源。迟效性氮源 不能被微生物直接吸收，必须先经相应的水解酶降解以后，才能被细胞吸收利用的有机氮源“生理酸性盐”与“生理碱性盐”生理酸性盐 由于其阳离子中的氮被微生物选择性吸收利用而造成培养基
6、的pH下降的盐。如(NH4)2SO4 生理碱性盐 由于其阴离子中的氮被微生物选择性吸收利用而造成培养基的pH上升的盐。如NaNO3部分发酵产物的氮源4.无机盐类mineral salts生理功能 参与细胞结构物质的组成； 参与酶的组成及调节酶的活性； 参与能量转移； 调节并维持细胞渗透压的平衡； 作为某些微生物的能源物质无机盐的功能大量（主要/宏量）元素 macroelements P、S、K、Na、Ca、Mg等 需要量：10-310-4M微量元素 microelements Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo等 需要量： 10-610-8M无机盐一般采用的浓度范围对一些产物有影响的微量元素5
7、.生长因子 growth factor生长因子是指微生物生长不可缺少的微量有机物质微量有机物质。 种类 维生素、氨基酸、碱基需要量 维生素：150ug/L 氨基酸：2050ug/L 碱 基：1020ug/L 核苷或核苷酸：2002000ug/L几种微生物的生长因子 菌种 生长因子 丙酮丁醇梭菌 对氨基苯甲酸 德氏乳杆菌 酪氨酸、胸腺核苷 干酪乳杆菌 生物素、麻黄素 粪链球菌 叶酸、精氨酸 肠膜明串珠菌 吡哆醛 金黄色葡萄球菌 硫胺素向培养基中添加生长因子的措施 直接添加 添加富含生长因子的物质 酵母膏，玉米浆，肝浸汁，麦芽汁玉米浆含的氨基酸6、能源 energy source 能为微生物生命活
8、动提供最初能量来源的营养物质或辐射能能源谱 化学物质：有机物 无机物 辐射能7、气体 （1）氧O2 ：微生物的对氧的需求 专性好氧菌：只能在有氧的环境中生长 专性厌氧菌：只能在无氧的环境中生长 兼性厌氧菌：在有氧及无氧的环境中都能生长 微嗜氧菌： 只能在氧分压很低的环境中生长向微生物提供氧的措施 实验室： 液体培养（三角瓶、试管）：浅液层、振荡 固体培养（平板、斜面）：表面生长 大生产： 液体培养（发酵罐）：通风、搅拌 固体培养：浅层、通风（2）二氧化碳CO2对于自养微生物：唯一或主要碳源对于异养微生物：三、微生物的营养类型三、微生物的营养类型1、微生物营养类型的分类分类标准营养类型A、能源光
9、能营养型 phototroph化能营养型 chemotrophB、氢供体无机营养型 lithotroph有机营养型 organotroph分类标准营养类型C、碳源自养型autotroph异养型heterotrophD、生长因子原养型(prototroph)/野生型(wild type)营养缺陷型auxotrophE、合成氨基酸能力氨基酸自养型amino acid autotroph氨基酸异养型amino acid heterotrophF、取食方式渗透营养型osmotroph吞噬营养型phagotrophG、取得死或活有机物腐生saproghytism寄生parasitism2、微生物的营养类
10、型营养类型能源氢供体基本碳源实例光能无机营养型（光能自养型）光无机物CO2紫硫细菌、绿硫细菌、藻类光能有机营养型（光能异养型）光有机物CO2及简单有机物红螺细菌化能无机营养型（化能自养型）无机物无机物CO2硝化细菌、硫化细菌化能有机营养型（化能异养型）有机物有机物有机物绝大多数细菌和全部真核微生物光能无机营养型 photolithotroph 能源：光 主要碳源：CO2 供氢体：H2S、Na2S2O3例：绿硫细菌，紫硫细菌CO2+H2S CH2O+2S+H2O 细菌叶绿素光能有机营养型 photoorganotroph 能源：光； 主要碳源：有机物，但可以将CO2还原成细胞物质。 供氢体：有机
11、物例：红螺细菌2CH3CHOHCH3+CO2 2CH3COCH3+CH2O+H2O 光合色素化能无机营养型 chemolithotroph能源：无机物，NH3 ， NO2， H2，H2S，S等 主要碳源：CO2 电子供体：无机物 例： 氧化亚铁硫杆菌 Fe Fe + e + 11.3千卡+2+3化能有机营养型 chemoorganotroph 能源：有机物 主要碳源：有机物 例：大部分种类的微生物，工业用菌种多为此类。营养类型的划分不是绝对的，在自然界中存在中间类型。营养类型的划分以最简单的营养条件为依据，并以“严格”,“兼性”加以区分。四四. .营养物质的跨膜输送营养物质的跨膜输送微生物是通
12、过细胞膜的渗透和选择吸收作用而从外界吸取营养物质的。被动吸收简单扩散和促进扩散主动吸收主动运输和基团移位原生动物膜泡运输本部分要求掌握：输送动力，输送方向，是否需要载体及其特异性，被输送物质在输送过程中是否发生化学变化输送物质举例。 1.简单扩散简单扩散 simple diffusion无载体蛋白参与下，单纯依靠物理扩散方式输送营养物质。特点特点： 输送动力：浓度梯度 输送方向：顺浓度梯度 输送物质：水、气体、脂溶性物质、极性小的分子输送机制：通过亲水小孔或脂双分子层。 J=D dc/dx J：扩散速度 D：扩散系数 dc/dx：该物质的浓度梯度影响因素：分子的大小、溶解性、极性和环境的温度等
13、 2、促进扩散、促进扩散 facilitated diffusion在特异性载体蛋白的协助下，不消耗能量的一类扩散性运输方式。 特点： 输送动力：浓度梯度 输送方向：顺浓度梯度 载体蛋白：需要，具有特异性 输送物质：极性大的分子， 真核微生物对糖的吸收。 输送机制： 被输送的物质与相应的载体之间存在一种亲和力。3、主动运输、主动运输 active transport 在消耗能量的同时，实现溶质在细胞内的浓缩，而没有任何化学变化发生的输送机制。特点： 输送动力：代谢能量 输送方向：逆浓度梯度 载体蛋白：需要，具有特异性 输送物质：氨基酸、某些糖、Na、K 等。 输送机制：代谢能量改变底物与载体之
14、间的 结合力。主动输送主动输送NaK泵泵4、基团移位、基团移位 group translocation被输送的基质分子在膜内经受了共价的改变， 以被修饰的形式进入细胞质的输送机制特点： 输送动力：代谢能量, PEP上的高能磷酸键 输送方向：逆浓度梯度 载体蛋白：磷酸转移酶系统 被输送物质在输送前后的存在状态：在细胞膜内被磷酸化输送机制：例：磷酸转移酶系统（PTS） 酶：非特异性，存在于细胞质中 酶：特异性(诱导型)，存在于膜上 因子：特异性，存在于细胞质中 HPr(组氨酸蛋白质/热稳定蛋白质)：非特异性，存在于细胞质中5.膜泡运输膜泡运输 Membrane vesicle transport通
15、过趋化性运动靠近营养物质，将它吸附到膜表面，形成膜泡，并进入细胞质。胞吞作用胞饮作用四种物质运输方式的比较四种物质运输方式的比较基团移位主动运输五、培养基五、培养基 medium 人工配制的含有营养物质的供微生物生长繁殖或积累代谢产物的基质（一）培养基应具有的共性n单位数量的培养基应能以最高产率地生产出所需产物，n 能最高速率地稳定合成出所需产物，n 培养基成分应价格便宜易于就近取材，n培养基有利于通风、搅拌、提取、纯化和废物处理等 （二）制备培养基的要素（1）营营养养物物质质：包括研究或实验微生物所需要的碳、氮、磷、硫等宏量元素及微量元素、生长因素及水等。在营养缺陷型（生长因素异养型）微生物
16、的培养基中，必须配入所缺的生长因素。（2）水水活活度度：实际上是控制好培养基中可溶物质的浓度。（3）pHpH值值：指灭菌后pH值，这与pH缓冲液和缓冲物（如CaCO3）的使用有关。（4）培养基的物理状态培养基的物理状态（5）灭菌方法灭菌方法（三）培养基的种类培养基的种类1、按对培养基成分的了解分类、按对培养基成分的了解分类天然培养基天然培养基complex medium；undefined medium 利用化学成分还不清楚 或不恒定的天然有机物质制成的培养基。如：实验室用的麦汁培养基 马铃薯浸汁培养基 大生产用山芋干粉糖化醪 一些营养物质的来源与成分一些营养物质的来源与成分玉米浆的平均化学组
17、成玉米浆的平均化学组成( (以干物质计以干物质计) )合成培养基合成培养基synthetic medium，defined medium 利用化学成分完全了解的高纯化学试剂制成的培养基。如：培养霉菌用的察氏培养基（g/L) NaNo3 2, K2HPO4 1, KCl 0.5, MgSO47H2O 0.5 FeSO47H2O 0.01, 蔗糖 30, 琼脂 20, pH 自然半合成培养基半合成培养基semi- synthetic medium 由部分天然有机物和部分化学试剂制成的培养基。如：LB培养基(g/L)： Tryptone 1, Yeast Extract 5, NaCl 1, pH7
18、.2 2、据培养基的物理状态分类、据培养基的物理状态分类（1）液体培养基 liquid medium 呈液体状态的培养基 （2）固体培养基solid medium 外观呈固体状态的培养基 固体培养基凝固培养基（solidified medium）：遇热可融化、冷却后则凝固的培养基。 非可逆性凝固培养基：当凝固后就不能再融化的固体培养基。 天然固体培养基：由天然固体物质直接制成的固体培养基。 滤膜（membrane filter）：是一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维素薄膜。琼脂和明胶的区别（3）半固体培养基semi-solid medium 呈当容器倒放时不致流下、但在剧烈振荡后则能破散状态的凝
19、固性固体培养基。琼脂的加量为0.5%左右。 3、按照培养基的特殊用途分类（1）加富培养基）加富培养基enriched medium 为分离某种微生物而专门设计， 加入了助长该类微生物的营养物质的培养基。 （2）选择培养基选择培养基selected medium 加入了某种化学物质以抑制不需要的菌的生长, 从而促进目的菌生长的培养基。 （3）鉴别培养基鉴别培养基differential medium 添加了某种试剂或化学药品而对特定的微生物起鉴别作用的培养基。一些鉴别培养基（4）种子培养基）种子培养基 seed medium 培养发酵用的健壮的种子的培养基。（5）发酵培养基）发酵培养基 ferm
20、entation medium 用于合成某种预定的发酵的培养基。（6）繁殖和保藏培养基）繁殖和保藏培养基 细 菌：营养琼脂、LB培养基 放线菌：马铃薯培养基，高氏一号培养基 酵 母：麦汁培养基，YEPD培养基 霉 菌：麦汁培养基、察氏培养基 （7）基础培养基）基础培养基：几种相似培养基的共同部分 培养基种类（四）配制培养基应注意的问题配制培养基应注意的问题 1、营养成分的溶解 缓冲性组分；易沉淀组分；微量组分；合成培养基的组分2、pH值及水活度3、琼脂4、灭菌（五）商品化培养基第二节 微生物的生长生长：个体体积的增大及细胞原生质总量的增加。繁殖：个体数量的增多。群体生长：包含了个体生长和繁殖一
21、、微生物个体细胞的生长1、细菌的生长与繁殖2、丝状菌的生长与繁殖 曲霉菌分生孢子形成的过程二. 微生物生长的测定(一) 直接计数法1、显微计数法 酵母菌、霉菌孢子：血球计数器 细菌：Petroff-Hausser或Helber计数器 2、电子自动计数法Coulter电子计数器电子计数器可测定细胞数、细胞大小分布。 （二）间接计数法（二）间接计数法1、平板菌落计数法、平板菌落计数法适用：单细胞或单孢子菌悬液方法：倾注平板、涂布平板CFU：colony-forming unit2、薄膜过滤计数法、薄膜过滤计数法 微孔滤膜如硝化纤维素薄膜适用：量大、含菌浓度低的样品3、液体稀释法（或然率法）、液体稀
22、释法（或然率法） MPN( Most probable number) 将样品作10倍系列稀释，接种液体试管，培养后记录出现生长的试管数，查表并计算。 例：某一细菌在稀释法中的 生长情况如下 稀释度 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 重复数 5 5 5 5 5 生长管数 5 5 4 1 0 数量指标“541”，查统计分配表17 原菌液中的活菌数=1.7106 个/dL（三）其他方法1.测定细胞物质的量测定细胞物质的量测定细胞干重法比浊法测定细胞总含氮量法 2.霉菌菌丝长度的测定霉菌菌丝长度的测定 菌落直径测定法： U型管测定法：三三. 微生物群体生长规律微生物群体生长规律（一）
23、细菌生长曲线growth curve 将少量细菌接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定细胞密度（CFU），以活细胞数的对数对培养时间所作出的曲线称为生长曲线。细菌群体生长曲线细菌群体生长曲线 1.延迟期（lag phase 调整期）活细胞数：基本不变细胞生理特点：分裂迟缓、代谢活跃出现的原因：调整代谢，适应新环境影响因素：菌种的遗传性；种龄；接种量； 培养基组分及培养条件缩短措施：2.对数期 log phase/exponential phase活细胞数：呈几何级数增加细胞的生理特点： 细胞生长速率最大； 细胞进行平衡生长； 酶系活跃，代谢旺盛繁殖代数和世代时间 x
24、2=x12n繁殖代数n=(lg x2- lg x1)/lg 2世代时间generation timeG=lg 2 (t2-t1)/ (lg x2- lg x1)在最适条件下几种微生物的世代时间3、平衡期、平衡期 stationary phase活细胞数：动态平衡出现原因：营养物质的消耗 ；有生理毒性代谢产物的积累 ；环境条件（pH, 氧化还原电位）的改变对细胞生长不利 细胞生理特点：分裂速度降低；活细胞数达到最大值；开始积累储藏物质；积累发酵产物；芽孢细菌产生芽孢4、衰亡期、衰亡期 decline phase/death phase活细胞数：逐渐下降细胞生理特点： 细胞内颗粒更加明显，出现液泡
25、 细胞出现异常形态 细胞死亡伴随自溶（二）真菌的生长曲线（二）真菌的生长曲线1、酵母菌的生长曲线：与细菌相似2、丝状真菌的生长曲线 三个时期 各期特征 生长停滞期 孢子萌发前的时期 迅速生长期 菌丝伸长及分枝 衰退期 菌丝体干重下降 伴随自溶 （三）多种碳源及复合培养基存在下（三）多种碳源及复合培养基存在下的微生物的生长的微生物的生长葡萄糖和乳糖共存时大肠杆菌的二次生长曲线麦芽糖和蔗糖共存时酿酒酵母的二次生长曲线四四.微生物的培养微生物的培养1.分批培养分批培养 batch culture 将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方法。摇瓶培养发酵罐培养2.补料分批培养
26、补料分批培养 适用对象： 底物对菌体生长或产物形成具有抑制作用方法： 阶段式补料 连续补料-流加发酵 3.连续培养连续培养 continuous culture 当微生物以分批培养的方式培养到对数期后，向培养器中不断补充新鲜营养物质，并以同样速度排出培养物，使微生物的增殖速度及培养基中的总菌量保持不变的培养方法。分批培养与连续培养的关系连续培养装置连续培养装置恒浊连续培养恒浊连续培养反应器：恒浊器（turbidostat）目的： 不断提供具有一定生理状态的细胞， 得到以最高生长速率进行生长的培养物。应用： 获得大量的菌体 获得与菌体生长相平衡的代谢产物。 不断调节流速而使培养液的浊度(菌体密度
27、)保持恒定的连续培养方法 恒化化连续培养恒化化连续培养控制恒定的流速，使由于菌体生长而耗去的营养物及时得到补充；培养液中营养物浓度基本恒定，从而保持菌体的恒定生长速率的连续培养方法。反应器：恒化器 chemostat培养基：含一种限制性因子，其它营养成分均过量限制性因子条件 菌体生长提供所必需的营养物质； 在一定的浓度范围内，生长速率与其浓度呈正比关系。限制因子的种类 氨基酸，葡萄糖，生长因子，无机盐等Monod 公式连续培养处于稳定状态的条件连续培养处于稳定状态的条件D=F/V =mF：培养基流入(流出)培养器的速度（ l/h）V：培养基中培养液的体积 (l)D：稀释率，单位时间内单位体积的
28、培养基中流入流出的量（h-1)m ：比生长速率，单位时间内单位重量的微生物所形成的新的菌体的重量(h-1)连续培养的稳定状态连续培养的稳定状态：D=F/V =mn当D = m 时，处于稳定状态n当D m时， m减小，但培养物中细胞密度加大。 n当D m时， m增大，但培养物中细胞密度减小。n当D m max时，细胞被“洗出”，连续培养系统遭破坏 酒精发酵(D=0.05-0.1)连续发酵的应用 连续发酵的优点 提高设备利用率 便于自动化控制 产品质量较稳定 节省人力、物力，水、电、气负荷均衡连续发酵的缺点 菌种易退化 易污染杂菌 营养物质利用率低于分批发酵5.同步培养物同步培养物 synchro
29、nous culture Synchronous culture is a form of culture on which all the cells path through the same stage of the cell cycle at the same time。 在同一时刻，所有的细胞都处于细胞周在同一时刻，所有的细胞都处于细胞周期中的同一阶段的培养物叫同步培养物期中的同一阶段的培养物叫同步培养物。1、机械法依据：处于不同生长阶段的细胞的大小不同 密度梯度离心分离法 过滤分离法 获得同步培养物的方法获得同步培养物的方法2、调整生理条件的同步法、调整生理条件的同步法-诱导法诱导
30、法 温度调整法 ：亚适温度 /最适温度 营养条件调整法：营养丰富培养基/无N培养基用最高稳定期细胞接种 诱导芽孢或孢子萌发 抑制DNA合成 抑制蛋白质合成 第三节第三节 菌体生长与发酵产物生成菌体生长与发酵产物生成一一. .细胞的生长和产物的得率细胞的生长和产物的得率得率系数：表示消耗单位重量的营养物质所形成的细胞量或产物的数量。碳源消耗： 细胞合成、产物合成、细胞维持乙醇发酵： 葡萄糖理论转化率：2mol乙醇/mol葡萄糖 实际转化率：9095%二.营养消耗及产物形成营养消耗及产物形成发酵产物的类型及其发酵特点 偶联型、 部分偶联型、非偶联型划分的依据： 发酵产物形成的速度和菌体生长速度之间
31、的关系。 . 与生长偶联的产物的生物合成与生长偶联的产物的生物合成代谢产物的积累与菌体生长平行产物生成的速率为： dp/dt = mX/Yp/c产物生成的比速率： qp= dp/Xdt = m/Yp/c式中Yp/c：每克细胞的产物克数（g产物/g细胞） 产物： 菌体类：酵母、蘑菇菌丝、苏云金杆菌 糖类厌氧发酵：酒精发酵 偶联型发酵.与生长部分偶联的产物的生物合成与生长部分偶联的产物的生物合成发酵特点 菌体生长一段时间后产物才开始合成，合成速率与生长速率有一段平行期，生长速率减低或停止后产物继续较快合成。产物生成速率为: dp/dt = adX/dt + bX产物生成的比速率： qp = am
32、+ b 部分偶联型发酵.不与生长偶联的产物的生物合成不与生长偶联的产物的生物合成发酵特点： 菌体生长速度减低或停止后产物较快合成产物生成的速率 dp/dt = bX产物生成的比速率： qp= b 次级代谢产物的合成 大多数抗生素、微生物毒素非偶联型发酵Xp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNe
33、QiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*
34、w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaL
35、dOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s
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