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1、基因与基因工程基因与基因工程一、基因的基本概念一、基因的基本概念1822年7月22日生于奥地利莫拉维亚省的海因岑多夫村一个贫苦农民家庭；1828年，6岁的孟德尔开始接受系统的小学和中学教育；1840年，以优异的成绩高中毕业，进入厄尔姆兹哲学学院进行了两年的大学预科学习；1843年秋，进入布隆市的奥古斯汀基督教修道院当一名修道士，取教名格里高，时年21岁； 1. 1.孟德尔遗传因子与基因孟德尔遗传因子与基因孟德尔遗传因子与基因孟德尔遗传因子与基因 （1 1）孟德尔生平简介）孟德尔生平简介）孟德尔生平简介）孟德尔生平简介 n n1847184718471847年，被任命为神父；年，被任命为神父；年
2、，被任命为神父；年，被任命为神父； n n1849184918491849年，被委派到中学任希腊文和数学代课教师；年，被委派到中学任希腊文和数学代课教师；年，被委派到中学任希腊文和数学代课教师；年，被委派到中学任希腊文和数学代课教师；n n1851185118511851年，在修道院的资助下，进入维也纳大学深造；年，在修道院的资助下，进入维也纳大学深造；年，在修道院的资助下，进入维也纳大学深造；年，在修道院的资助下，进入维也纳大学深造；n n1854185418541854年夏天，大学毕业，回到奥古斯汀修道院，开始了人生的新年夏天，大学毕业，回到奥古斯汀修道院，开始了人生的新年夏天，大学毕业，
3、回到奥古斯汀修道院，开始了人生的新年夏天，大学毕业，回到奥古斯汀修道院，开始了人生的新篇章；篇章；篇章；篇章；n n1856185618561856年，开始长达年，开始长达年，开始长达年，开始长达8 8 8 8年之久的豌豆杂交实验；（修道院后花园）年之久的豌豆杂交实验；（修道院后花园）年之久的豌豆杂交实验；（修道院后花园）年之久的豌豆杂交实验；（修道院后花园）n n1865186518651865年，在布隆市自然科学研究协会的年会上，公布了他的研究年，在布隆市自然科学研究协会的年会上，公布了他的研究年，在布隆市自然科学研究协会的年会上，公布了他的研究年，在布隆市自然科学研究协会的年会上，公布了
4、他的研究结果和理论解释；结果和理论解释；结果和理论解释；结果和理论解释；n n1866186618661866年，发表著名论文植物杂交实验，首次提出了遗传因子、年，发表著名论文植物杂交实验，首次提出了遗传因子、年，发表著名论文植物杂交实验，首次提出了遗传因子、年，发表著名论文植物杂交实验，首次提出了遗传因子、显性性状和隐性性状等遗传学概念；显性性状和隐性性状等遗传学概念；显性性状和隐性性状等遗传学概念；显性性状和隐性性状等遗传学概念；n n1868186818681868年，当选奥古斯汀修道院院长，此后再也无力从事研究；年，当选奥古斯汀修道院院长，此后再也无力从事研究；年，当选奥古斯汀修道院院
5、长，此后再也无力从事研究；年，当选奥古斯汀修道院院长，此后再也无力从事研究；n n1884188418841884年年年年1 1 1 1月月月月6 6 6 6日去世！日去世！日去世！日去世！n n后人在分析孟德尔成功发现遗传第一定律和第二定律的原因时，一致认为选择豌豆为实验材料具有决定性的意义。n n那么豌豆具有什么样的生物学特性呢？（2） 豌豆的生物学特性 a.不同的豌豆品系之间，通常存在着差异明显、易于区别而又稳定遗传的相对性状特征；（开紫花的豌豆植株）b.豌豆花的结构比较特殊，具有雄配子的花药和具有雌配子的胚珠是由花瓣包裹着。因此它是一种严格的自花授粉植物；（豌豆花的结构）c.豌豆具有较
6、大型的花器官（即生殖器官），便于去雄，进行人工授粉实验。（豌豆人工授粉）（3）孟德尔的单因子豌豆杂交实验遗传因子分离定律 1856185618561856年年年年至至至至1863186318631863年年年年，孟孟孟孟德德德德尔尔尔尔在在在在奥奥奥奥古古古古斯斯斯斯汀汀汀汀修修修修道道道道院院院院的的的的后后后后花花花花园园园园进进进进行行行行了了了了长长长长达达达达8 8 8 8年年年年的的的的豌豌豌豌豆豆豆豆杂杂杂杂交交交交实实实实验验验验。他他他他首首首首先先先先选选选选择择择择了了了了七七七七对对对对区区区区别别别别分分分分明明明明而而而而又又又又能能能能稳稳稳稳定定定定遗遗遗遗传传
7、传传的的的的性性性性状状状状作作作作仔仔仔仔细细细细的的的的观观观观察察察察。这这这这七对性状是：七对性状是：七对性状是：七对性状是：花着生的部位腋生和顶生种子的形状圆形和皱形种子内部颜色黄色和绿色花朵的颜色紫色和白色植株茎杆长度长茎和短茎成熟豆荚外形饱满和节缩未成熟豆荚颜色绿色和黄色Table 1. A summary of the seven pairs of contrasting traits and results of Table 1. A summary of the seven pairs of contrasting traits and results of Mendels
8、 seven monohybrid crosses of the garden pea (Mendels seven monohybrid crosses of the garden pea (Pisum sativumPisum sativum) ) （4 4）孟德尔双因子豌豆杂交实验数据统计）孟德尔双因子豌豆杂交实验数据统计 世代世代 种子表型种子表型 种子数量种子数量 比例比例 亲代亲代 绿圆绿圆 黄皱黄皱 F1F1代代 黄圆黄圆 F2F2代代 黄圆黄圆 3153159.849.84黄皱黄皱 1011013.163.16绿圆绿圆 10810830383038绿皱绿皱 32321.01.0
9、总数总数556556（5）遗传因子的自由组合定律：n n根据上述实验结果，孟德尔推想：由两对等位根据上述实验结果，孟德尔推想：由两对等位因子杂交产生的杂种因子杂交产生的杂种F1F1代植株，在形成配子过程代植株，在形成配子过程中，两对等位因子的分离是彼此独立互不相关的，中，两对等位因子的分离是彼此独立互不相关的，而在形成合子的过程中，不同因子之间又是自由而在形成合子的过程中，不同因子之间又是自由组合的。这就是组合的。这就是所谓的遗传因子独立分配律，或所谓的遗传因子独立分配律，或叫自由组合律，亦即是孟德尔第二定律。叫自由组合律，亦即是孟德尔第二定律。n n孟德尔还进行了多因子豌豆杂交实验，其结果孟
10、德尔还进行了多因子豌豆杂交实验，其结果虽然比较复杂，但它同样遵循遗传因子的独立分虽然比较复杂，但它同样遵循遗传因子的独立分离和自由组合的原则。离和自由组合的原则。 （6 6）孟德尔遗传因子被正式定名为基因孟德尔遗传因子被正式定名为基因孟德尔遗传因子被正式定名为基因孟德尔遗传因子被正式定名为基因 1909年，丹麦的一位生物学家约翰逊，根据希腊文“给予生命之义”创造了“基因”这个名词，用来代替孟德尔的“遗传因子”。但是需要指出，约翰逊当时所说的基因，并不代表遗传物质实体，只是一种与细胞的任何可见的形态结果均无关系的抽象单位，也就是遗传性状符号！2、摩尔根的基因论 （1）摩尔根生平简介 1866年
11、9月 25日 ， Thomas HantMorgan出生于美国肯塔基州的列克星敦市的一个富裕家庭。1880年，14岁的少年摩尔根考入肯塔基州立学院预科班学习，两年后转入本科。1886年，以全班第一名成绩从肯塔基州立学院毕业，进入约翰.霍普金斯大学从事实验胚胎学研究；n n18901890年，在约翰年，在约翰. .霍普金斯大学获理学博士学位；霍普金斯大学获理学博士学位；n n1891189119031903年，在布林莫尔女子学院任教，同时在其年，在布林莫尔女子学院任教，同时在其它一些研究机构从事胚胎学方面的研究；它一些研究机构从事胚胎学方面的研究； 1904 190419281928年，担任哥伦
12、比亚大学动物学教授，进行遗传学与进年，担任哥伦比亚大学动物学教授，进行遗传学与进化论领域的科学研究；化论领域的科学研究；n n1927192719311931年，担任美国科学院院长；年，担任美国科学院院长；n n19281928年退休，同年发表名著年退休，同年发表名著“基因论基因论”；n n1928192819451945年，任加州大学生物学主任；年，任加州大学生物学主任；n n19301930年，担任美国科学促进联合会主席；年，担任美国科学促进联合会主席；n n19331933年，获诺贝尔生理学及医学奖；年，获诺贝尔生理学及医学奖；n n19451945年年1212月月4 4日，因动脉血管破
13、裂在美国加州的帕萨迪日，因动脉血管破裂在美国加州的帕萨迪纳市逝世。纳市逝世。（2）果蝇的生物学特性 a. a. a. a. 繁殖能力强，产卵数量多；繁殖能力强，产卵数量多；繁殖能力强，产卵数量多；繁殖能力强，产卵数量多；b. b. b. b. 繁殖速度快，世代时间短（繁殖速度快，世代时间短（繁殖速度快，世代时间短（繁殖速度快，世代时间短（9 9 9 9天左右）；天左右）；天左右）；天左右）；c. c. c. c. 染色体数目少，仅染色体数目少，仅染色体数目少，仅染色体数目少，仅4 4 4 4对，且形态各异，易于辨认；对，且形态各异，易于辨认；对，且形态各异，易于辨认；对，且形态各异，易于辨认；
14、d. d. d. d. 拥有大量的各种突变体；拥有大量的各种突变体；拥有大量的各种突变体；拥有大量的各种突变体；e. e. e. e. 个体小，管理简单，对饲料无特殊要求。个体小，管理简单，对饲料无特殊要求。个体小，管理简单，对饲料无特殊要求。个体小，管理简单，对饲料无特殊要求。 （3）果蝇的染色体组 性染色体性染色体性染色体性染色体指与生物个体的性别决定有直接关联的染色指与生物个体的性别决定有直接关联的染色指与生物个体的性别决定有直接关联的染色指与生物个体的性别决定有直接关联的染色 体。例如果蝇的体。例如果蝇的体。例如果蝇的体。例如果蝇的X X X X染色体和染色体和染色体和染色体和Y Y
15、Y Y染色体。染色体。染色体。染色体。 常染色体常染色体常染色体常染色体除了性染色体之外的，不直接参与生物个体除了性染色体之外的，不直接参与生物个体除了性染色体之外的，不直接参与生物个体除了性染色体之外的，不直接参与生物个体性别决定的染色体叫常染色体。例如果蝇的第性别决定的染色体叫常染色体。例如果蝇的第性别决定的染色体叫常染色体。例如果蝇的第性别决定的染色体叫常染色体。例如果蝇的第IIIIIIII对，第对，第对，第对，第IIIIIIIIIIII对染色体，均为常染色体。对染色体，均为常染色体。对染色体，均为常染色体。对染色体，均为常染色体。果蝇有4对染色体，其中1对为性染色体，其余3对为常染色体
16、。（4）果蝇眼色基因的性连锁遗传1910年，摩尔根及其助手从红严果蝇群体中发现了一只白眼的雄果蝇，他们将白眼雄果蝇同来自同一父母的姊妹红眼雌果蝇交配，结果产生的F1代果蝇，无论是雄的还是雌的，无一例外都是红眼的。这个结果说明：a.果蝇红眼是显性性状，白眼是隐性性状；b.亲代白眼雄果蝇是隐性纯合子；c.亲代红眼雌果蝇是显性纯合子；摩尔根等人将上述所产生的F1代的红眼雄果蝇同红眼雌果蝇相互交配，产生的子二代（F2）果蝇中，红眼同白眼的比例恰好为3:1。但有趣的是，所有的白眼果蝇都是雄性的，没有一只是雌性。这说明：白眼性状与性别有联系，摩尔根等人推测控制果蝇的白眼隐性基因是位于X染色体上。摩尔根等人
17、的工作，第一次将代表某一特定性状的基因，同某一特定的染色体联系起来了，从而建立了基因的遗传物质基础，建立了基因的染色体理论，使基因学说得到了普遍的承认。（5 5） 连锁与交换定律连锁与交换定律 基因的连锁与交换定律，是由美国著名的遗传学及胚胎学家摩尔根与他的学生所建立的。由于该定律极大地完善并丰富了孟德尔遗传学理论，因此后人将它与孟德尔第一遗传定律、第二遗传定律并列，称之为遗传学第三定律。（6） 摩尔根的学术贡献 摩尔根及其学术的工作，第一次将代表某一特定性状的基因，同某一特定的染色体连系了起来，从而确证了基因的遗传物质基因，建立了基因的染色体理论，为基因工程的建立作了卓越的贡献。摩尔根生活低
18、调，衣着朴素，热心科研，勤奋工作，知道38岁才与其女友结婚。为了不影响科研工作，摩尔根借故没有出席诺贝尔奖的颁奖典礼。他总结自己为什么会在科学研究中作出诸多发现的原因时说“一靠勤奋，二靠实验材料得当，三靠愿意放弃没有任何证据的假说，最后还得少开些遗传学大会”。3 . 基因的载体是 DNA 在孟德尔和摩尔根的基因论被科学工作者广泛接受之后，在孟德尔和摩尔根的基因论被科学工作者广泛接受之后，关于基因的载体（或说是化学本质）是关于基因的载体（或说是化学本质）是DNADNA还是蛋白质，还是蛋白质，一直存在着两种不同的意见。一直存在着两种不同的意见。 （1）1944年，O.Avery等人的肺炎链球菌毒性
19、转化实验证明，基因的载体是DNA，而不是蛋白质。S型肺炎链球菌具荚膜，光滑，有毒。R型肺炎链球菌无荚膜，粗糙，无毒。结论结论：使肺炎链球菌毒力性状发生转化的因子是DNA，而不是蛋白质。这有力地证明基因的遗传载体是DNA而不是蛋白质。（2 2） 19521952年年，A.D A.D Hershey Hershey and and M. M. ChaseChase应应用用放放射射性性同同位位素素双双标标记记技技术术，证证明明菌菌体体的的遗遗传传物物质质（基基因因的的载载体体）也也是是DNADNA而不是蛋白质。而不是蛋白质。实验现象实验现象：用放射性同位素32P和35S分别标记噬菌体的内部DNA和外
20、部蛋白质，然后感染寄主细胞。结果发现只有32P标记的DNA注入大肠杆菌细胞。结论结论：在噬菌体中，基因的载体也是DNA而不是蛋白质。n n DNA分子的半保留复制模型（3）1953年，J.Watson和F.Crick建立了DNA的双螺旋模型；1958年，M.Meselson和F.W.Stahl在此基础上发现了DNA分子半保留复制机理。从而解决了基因的自我复制和代代相传的问题。至此，基因的分子本质是DNA而不是蛋白质已是不争的事实！4. 基因的编码产物 基因是细胞中所有基因是细胞中所有RNARNA及蛋白质分子的及蛋白质分子的“蓝图蓝图”，有，有些基因编码的最终产物是些基因编码的最终产物是RNAR
21、NA分子，例如分子，例如rRNArRNA基因、基因、 tRNAtRNA基因及其它小分子量的基因及其它小分子量的RNARNA基因等；而其它一些基因等；而其它一些基因编码的最终产物是蛋白质，这些蛋白质是通过基因编码的最终产物是蛋白质，这些蛋白质是通过mRNAmRNA中介合成的。中介合成的。 5. 遗传密码的破译DNA的核苷酸顺序与蛋白质氨基酸顺序关系 BeadleBeadle、TatumTatum和和IngramIngram等等人人的的工工作作，虽虽然然确确立立了了基基因因（DNADNA）与与蛋蛋白白质质多多肽肽链链之之间间的的关关系系，也也就就是是说说蛋蛋白白质质是是由由基基因因编编码码的的，但
22、但是是，基基因因的的DNADNA分分子子是是由由4 4种种不不同同的的核核苷苷酸酸（A A、T T、G G和和C C）排排列列组组合合而而成成的的，而而蛋蛋白白质质分分子子中中的的多多肽肽链链则则是是由由2020种种氨氨基基酸酸排排列列组组合合而而成成。那那么么基基因因DNADNA分分子子中中的的核核苷苷酸酸碱碱基基顺顺序序，同同蛋蛋白白质质多多肽肽链链中中的的氨氨基基酸酸顺顺序序之之间间存存在在着着什什么么样样的的关关系系呢呢？遗遗传传密密码码的的破破译译正正确确地地回回答答了这个问题。了这个问题。（1） 中心法则19581958年，年，F. CrickF. Crick提出了解释提出了解释D
23、NADNA，RNARNA及蛋白质三者关及蛋白质三者关系的所谓中心法则：系的所谓中心法则： DNARNA蛋白质根据中心法则DNA会自我复制，而RNA及蛋白质二者都不能够自我复制，因此生物体中能够永久保存代代相传下去的是DNA分子，或说是基因。DNA在复制过程中双链解开，以单链形式作为合成自己互补链（cDNA）的模板，其碱基配对原则是：腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）在DNA到RNA的转录过程中，单链的cDNA则是作为指导RNA合成的模板。RNA可分成tRNA、rRNA、其它小分子RNA和mRNA，其中只有mRNA可转译成蛋白质。转录过程中的碱基配对原则：腺嘌呤（A）尿嘧啶（U）
24、鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）（2）遗传密码遗传信息从遗传信息从DNADNA到到RNARNA再到蛋白质的过程，叫作基因的表再到蛋白质的过程，叫作基因的表达。它涉及遗传信息的达。它涉及遗传信息的转录和转译转录和转译两个步骤。两个步骤。 转录根据碱基互补原则，遗传信息从DNA的核苷酸序列形式转换成RNA核苷酸序列形式的过程叫作转录，也叫RNA合成。转译遗传信息从mRNA的核苷酸序列形式，转变成蛋白质多肽链氨基酸序列形式的过程叫作转译，也叫蛋白质合成。 当我们思考转录和转译这两个过程时会发现，当我们思考转录和转译这两个过程时会发现，转译与转录不同，它不是简单的核苷酸序列的转换过转译与转录不同，它不是简单的
25、核苷酸序列的转换过 程，而是将程，而是将mRNAmRNA分子上的核苷酸语言翻译成蛋白质多肽链分子上的核苷酸语言翻译成蛋白质多肽链上氨基酸语言的负责过程，是涉及到两种不同语言信号之上氨基酸语言的负责过程，是涉及到两种不同语言信号之间的更换问题。间的更换问题。 因此，在从因此，在从mRNAmRNA到蛋白质多肽链的转译过程中，到蛋白质多肽链的转译过程中，必定存在着一种特殊的遗传密码系统，才能够将必定存在着一种特殊的遗传密码系统，才能够将RNARNA分子上的核苷酸顺序，同蛋白质多肽链分子上分子上的核苷酸顺序，同蛋白质多肽链分子上的氨基酸顺序联系。这种遗传密码在的氨基酸顺序联系。这种遗传密码在19661
26、966年已经完年已经完全破译。全破译。（3 3）通用遗传密码表）通用遗传密码表 第一位字母（第一位字母（5-5- 末端）末端）第二位字母第二位字母第三位字母（第三位字母（3-3-末端）末端）U UU UC CA AGGU UC CA AGGPhePhePhePheLeuLeuLeuLeuSerSerSerSerSerSerSerSerTyrTyrTyrTyrStopStopStopStopCysCysCysCysStopStopTrpTrpC CLeuLeuLeuLeuLeuLeuLeuLeuProProProProProProProProHisHisHisHisGlnGlnGlnGlnArg
27、ArgArgArgArgArgArgArgU UC CA AGGA AIleIleIleIleIleIleMetMetThrThrThrThrThrThrThrThrAsnAsnAsnAsnLysLysLysLysSerSerSerSerArgArgArgArgU UC CA AGGGGValValValValValValValValAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaAspAspAspAspGluGluGluGluGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyU UC CA AGG注1.Met和Val的密码子AUG和GUG，也叫起始密码子，表中加方框表示。注2.UAA、UAG及
28、UGA三个密码子为终止密码子，表中以“Stop”表示。6. 基因的结构 按照细胞中是否存在真正有形的细胞核结构，可把生物按照细胞中是否存在真正有形的细胞核结构，可把生物分成真核生物和原核生物两大类。例如大肠杆菌细胞中的分成真核生物和原核生物两大类。例如大肠杆菌细胞中的染色体并没有被核膜包围，因此没有真正的有形的细胞核染色体并没有被核膜包围，因此没有真正的有形的细胞核结构，属于原核生物。而诸如高等植物和动物，细胞中的结构，属于原核生物。而诸如高等植物和动物，细胞中的染色体被核膜包围成一种有形的细胞核结构，属于真核生染色体被核膜包围成一种有形的细胞核结构，属于真核生物。与此相应，也可把基因分成真核
29、基因和原核基因两大物。与此相应，也可把基因分成真核基因和原核基因两大类，两者在结构上是有差别的。类，两者在结构上是有差别的。 （1 1） 基因的基本组成部分基因的基本组成部分 不管是真核基因还是原核基因，都具有如下不管是真核基因还是原核基因，都具有如下4 4个基本的个基本的组成部分：组成部分：a.编码区包括起始密码子，终止密码子和氨基酸密码子；b.非编码区5-末端非转译区，3-末端非转译区，真核基因的间隔区；c.启动区RNA聚合酶结合部位，由此启动基因的转录作用；d.终止区具有终止转录作用的功能。（2 2） 原核蛋白质编码基因的结构原核蛋白质编码基因的结构 基因基因转录区启动子终止子转录转录A
30、TGTAA5-UTR3-UTR转录终止位点RNA起点核糖体结合位点（3 3）真核蛋白质编码基因的结构）真核蛋白质编码基因的结构 基因转录区启动子终止子转录转录ATGTAA5-UTR3-UTR多聚核苷酸化位点RNA起点初级RNA转录本剪辑剪辑ATGTAA5-UTR3-UTR多聚核苷酸化位点RNA起点核糖体结合位点mRNA基因转录区启动子终止子转录转录ATGTAA5-UTR3-UTR多聚核苷酸化位点RNA起点初级RNA转录本剪辑剪辑ATGTAA5-UTR3-UTRRNA起点mRNA外显子内含子 二二 . 基因工程原理基因工程原理1. 基因工程诞生的基础基因工程诞生的基础 （1）基因工程诞生的理论基
31、础）基因工程诞生的理论基础 a. 在上世纪在上世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题。从而明确了遗传的物质基础问题。 b. 在上一世纪在上一世纪50年代揭示了年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，从而解决了基因的自我复制和遗传传递的问题。从而解决了基因的自我复制和遗传传递的问题。 c. 在上世纪在上世纪50年代末期和年代末期和60年代初期，年代初期，科学工作者相继提出了科学工作者相继提出了“中心法则中心法则”、 “操纵
32、子学说操纵子学说”，并成功地破译了遗传密码，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信从而阐明了遗传信息流向和表达的问题。息流向和表达的问题。 小结：基因工程诞生的理论基础是小结：基因工程诞生的理论基础是 （a a） 基因的分子载体是基因的分子载体是DNADNA而不是蛋白质，而不是蛋白质， 从而解决了遗传物质的基础问题。从而解决了遗传物质的基础问题。 （b b） DNA DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机理，的双螺旋结构模型和半保留复制机理， 从而解决了基因的自我复制和遗传传递问题。从而解决了基因的自我复制和遗传传递问题。 （c c）“中心法则中心法则”、“操纵子学说操纵子学说”和遗传密码的和
33、遗传密码的破译，破译， 从而解决了遗传信息的流向和表达问题。从而解决了遗传信息的流向和表达问题。（2 2） 基因工程诞生的技术基础：基因工程诞生的技术基础：基因工程诞生的技术基础：基因工程诞生的技术基础：（a a a a） DNA DNA DNA DNA分子体外切割与连接技术的建立；分子体外切割与连接技术的建立；分子体外切割与连接技术的建立；分子体外切割与连接技术的建立； （b b） DNA DNA分子核苷酸序列测定方法的发明；分子核苷酸序列测定方法的发明； （c） 大肠杆菌遗传转化技术的建立；大肠杆菌遗传转化技术的建立； （d） 琼脂糖凝胶电泳技术的建立与应用；琼脂糖凝胶电泳技术的建立与应用
34、； （e）核酸杂交技术的建立，）核酸杂交技术的建立， (DNA片段的分离和酶切图谱的构建等片段的分离和酶切图谱的构建等)(Southern和和Northern杂交术杂交术)。2. 基因工程（基因工程（Gene engineering或或genetic engineering） 定义：在体外试管中应用定义：在体外试管中应用DNADNA重组技术将外源核酸分重组技术将外源核酸分子（基因）插入病毒、质粒或其他载体分子，构子（基因）插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质重组体，并使之转移到原本没有这类成遗传物质重组体，并使之转移到原本没有这类分子（基因）的受体细胞内，而能持续稳定地繁分子（基因）的受
35、体细胞内，而能持续稳定地繁殖与表达。这样的过程叫做基因工程，有时也叫殖与表达。这样的过程叫做基因工程，有时也叫做遗传工程。做遗传工程。 （1 1）基因克隆与）基因克隆与）基因克隆与）基因克隆与DNADNA克隆克隆克隆克隆n na. a. a. a. 在在在在DNADNADNADNA克隆中插入载体的克隆中插入载体的克隆中插入载体的克隆中插入载体的DNADNADNADNA片段，绝大多数是不含有片段，绝大多数是不含有片段，绝大多数是不含有片段，绝大多数是不含有 基因编码序列的，或者说是不含有完整的基因编码序列的。基因编码序列的，或者说是不含有完整的基因编码序列的。基因编码序列的，或者说是不含有完整的
36、基因编码序列的。基因编码序列的，或者说是不含有完整的基因编码序列的。n nb.b.b.b.拿人的基因组拿人的基因组拿人的基因组拿人的基因组DNADNADNADNA为例，全长达为例，全长达为例，全长达为例，全长达3103103103109 9 9 9bPbPbPbP ，但其中基因，但其中基因，但其中基因，但其中基因的编码序列不到的编码序列不到的编码序列不到的编码序列不到2%2%2%2%。因此绝大多数因此绝大多数因此绝大多数因此绝大多数DNADNADNADNA片段是不含有基因片段是不含有基因片段是不含有基因片段是不含有基因编码序列的。编码序列的。编码序列的。编码序列的。n nb. b. b. b.
37、 基因克隆实质上是指应用类似于基因克隆实质上是指应用类似于基因克隆实质上是指应用类似于基因克隆实质上是指应用类似于DNADNADNADNA克隆的技术，分离克隆的技术，分离克隆的技术，分离克隆的技术，分离 纯化含目的基因的纯化含目的基因的纯化含目的基因的纯化含目的基因的DNADNADNADNA片段的实验操作过程。片段的实验操作过程。片段的实验操作过程。片段的实验操作过程。 （2） “克隆克隆”一词的概念一词的概念 在中文中在中文中“克隆克隆”一词兼具名词、动词和形容词三种不一词兼具名词、动词和形容词三种不同词义。同词义。n n“克隆克隆”作名词使用时，是指从一个共同的祖先无性繁殖作名词使用时，是
38、指从一个共同的祖先无性繁殖而而 来的一群遗传同一的来的一群遗传同一的DNADNA分子、细胞或个体组成的分子、细胞或个体组成的特殊的生命群体；特殊的生命群体；n n“克隆克隆”作为动词使用时，则是指从同一祖先经过无性繁作为动词使用时，则是指从同一祖先经过无性繁殖产生这类遗传上同一的殖产生这类遗传上同一的DNADNA分子、细胞或个体的过程；分子、细胞或个体的过程；n n 在中文中在中文中“克隆克隆”还可作为形容词使用。例如克隆羊还可作为形容词使用。例如克隆羊（Cloned sheepCloned sheep）。）。（3）名词）名词“克隆克隆”的三种层次：的三种层次：n n个体水平个体水平个体水平个
39、体水平具有相同基因型的同一物种的两个或具有相同基因型的同一物种的两个或 多个个体。例如从同一个受精卵分裂而来的同卵多个个体。例如从同一个受精卵分裂而来的同卵双生子（双生子（monozygotic twinsmonozygotic twins），便是属于同一克），便是属于同一克隆；隆；n n细胞水平细胞水平细胞水平细胞水平从同一个祖细胞分裂而来的一群遗传从同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的细胞群体。（在细胞学、胚胎学中使用）；上同一的细胞群体。（在细胞学、胚胎学中使用）；n n分子水平分子水平分子水平分子水平在分子生物学中特指带有一段插入在分子生物学中特指带有一段插入DNADNA的载体分子的
40、载体分子/ /寄主细胞单位。例如大肠杆菌寄主细寄主细胞单位。例如大肠杆菌寄主细胞中的重组质粒载体，叫做克隆。胞中的重组质粒载体，叫做克隆。（4 4）基因克隆步骤：）基因克隆步骤：）基因克隆步骤：）基因克隆步骤： 从从从从 所选用的实验材料中分离、纯化基因组所选用的实验材料中分离、纯化基因组所选用的实验材料中分离、纯化基因组所选用的实验材料中分离、纯化基因组DNADNADNADNA，经适，经适，经适，经适 当限制酶消化切割，产生出当限制酶消化切割，产生出当限制酶消化切割，产生出当限制酶消化切割，产生出DNADNADNADNA限制片段群体限制片段群体限制片段群体限制片段群体 （限制片断切割）（限制
41、片断切割）（限制片断切割）（限制片断切割） 在体外试管中将片段群体连接到载体分子上，形成重在体外试管中将片段群体连接到载体分子上，形成重在体外试管中将片段群体连接到载体分子上，形成重在体外试管中将片段群体连接到载体分子上，形成重 组组组组DNADNADNADNA分子（重组体）混合物分子（重组体）混合物分子（重组体）混合物分子（重组体）混合物 （体外重组）体外重组）体外重组）体外重组）将此重组将此重组DNADNA分子混合物转化到适当的受体细胞，分子混合物转化到适当的受体细胞，进行复制与繁殖进行复制与繁殖 （遗传转化）（遗传转化）从大量的转化细胞群体（即从大量的转化细胞群体（即DNADNA文库），
42、筛选出获文库），筛选出获得重组得重组DNADNA分子（含目的基因）的转化子克隆分子（含目的基因）的转化子克隆 （转化子克隆的筛选）（转化子克隆的筛选）从这些转化子克隆中，提取己经得到扩增的目从这些转化子克隆中，提取己经得到扩增的目的基因，供进一步研究用的基因，供进一步研究用 （目的基因分离）（目的基因分离）将目的基因亚克隆在表达载体上，导入受体细胞，使之将目的基因亚克隆在表达载体上，导入受体细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类需要的产品在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类需要的产品（目的基因的表达）。（目的基因的表达）。3. 3. 核酸内切限制酶核酸内切限制酶核酸内切限制酶核
43、酸内切限制酶-DNA-DNA分子的分子的分子的分子的“ “剪刀剪刀剪刀剪刀” ”（1） 定义：核酸内切限制酶（定义：核酸内切限制酶（Restriction Restriction endonucleaseendonuclease），又叫做限制酶（），又叫做限制酶（Restriction enzymeRestriction enzyme），），是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNADNA分子中的某种特定核苷酸序列，分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割双链并由此切割双链DNADNA分子的核酸内切酶。分子的核酸内切酶。因此有人形像地因此有人形像地因此有人形像地因此有人形像地将核酸内切限制酶形象
44、地比作将核酸内切限制酶形象地比作将核酸内切限制酶形象地比作将核酸内切限制酶形象地比作DNADNADNADNA分子的剪刀。分子的剪刀。分子的剪刀。分子的剪刀。 自然界中存在着大量的核酸内切限制酶，迄今已经从各种自然界中存在着大量的核酸内切限制酶，迄今已经从各种不同的微生物中分离纯化出三千多种的核酸内切限制酶。不同的微生物中分离纯化出三千多种的核酸内切限制酶。它们总共能够识别它们总共能够识别200200种左右的不同的特异性识别序列。种左右的不同的特异性识别序列。（2 2 2 2） 几种常用限制酶的识别序列几种常用限制酶的识别序列几种常用限制酶的识别序列几种常用限制酶的识别序列 BamHI5-GGA
45、TCC-33-CCTAGG-5EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-5Hind III5-AAGCTT-33-TTCGAA-5PstI5-CTGCAG-33-GACGTC-5（3 3 3 3） DNA DNA DNA DNA分子的体外切割分子的体外切割分子的体外切割分子的体外切割 a. a. a. a.体外切割体外切割体外切割体外切割在体外的反应体系中，在一定温度下保温在体外的反应体系中，在一定温度下保温在体外的反应体系中，在一定温度下保温在体外的反应体系中，在一定温度下保温（一般是（一般是（一般是（一般是37373737），核酸内切限制酶便可以对双链），核酸内切限制酶便可以对双链）
46、，核酸内切限制酶便可以对双链），核酸内切限制酶便可以对双链DNADNADNADNA分子进行切割作用。这种反应也叫作消化作用，或酶分子进行切割作用。这种反应也叫作消化作用，或酶分子进行切割作用。这种反应也叫作消化作用，或酶分子进行切割作用。这种反应也叫作消化作用，或酶切消化作用。切消化作用。切消化作用。切消化作用。 b. b. b. b.粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端DNADNADNADNA分子在限制酶作用下形成的，具有互补分子在限制酶作用下形成的，具有互补分子在限制酶作用下形成的，具有互补分子在限制酶作用下形成的，具有互补碱基的单链末端结构，它们之间可以通过互补碱基间碱基的单链末端结构，它们
47、之间可以通过互补碱基间碱基的单链末端结构，它们之间可以通过互补碱基间碱基的单链末端结构，它们之间可以通过互补碱基间的配对作用而重新连接起来。的配对作用而重新连接起来。的配对作用而重新连接起来。的配对作用而重新连接起来。 c. EcRIc. EcRI酶切（识别位点为酶切（识别位点为GAATTCGAATTC）后，）后，形成形成 5 5，- P- P的单链粘性末端的单链粘性末端5-GAGATCTTGAATTCATAAGTC-33-CTCTAGAACTTAAGTATTCAG-55-GAGATCTTG-3，3-CTCTAGAACTTAA-P-5， 5，- P -AATTCATAAGTC-3 3，- GT
48、ATTCAG-5，d. Pstd. Pstd. Pstd. Pst的识别位点及切割形成的的识别位点及切割形成的的识别位点及切割形成的的识别位点及切割形成的3 3 3 3，-OH-OH-OH-OH单链粘性末端单链粘性末端单链粘性末端单链粘性末端 5- GGCCTT 5- GGCCTTC T G C A GC T G C A G AATCGG -3 AATCGG -3 3- CCGGAA 3- CCGGAAG A C G T CG A C G T C TTAGCC -5 TTAGCC -5 5- GGCCTT 5- GGCCTTC C T G C-A-0H-3T G C-A-0H-3 3- CCG
49、GAA 3- CCGGAAG G G GAATCGG - 3AATCGG - 3 3-0H-A C G T3-0H-A C G T C CTTAGCC- 5 TTAGCC- 5 （4 4） 同裂酶、同尾酶和异裂酶同裂酶、同尾酶和异裂酶同裂酶、同尾酶和异裂酶同裂酶、同尾酶和异裂酶a. 同裂酶（同裂酶（Isoschizomers)具有同样的识别位点，产生同样的粘性末端，但是从不同具有同样的识别位点，产生同样的粘性末端，但是从不同的细分的细分离出来的，因而具有不同名称的一类核酸内切限制酶。离出来的，因而具有不同名称的一类核酸内切限制酶。例如例如Hpa和和Msp就是一对具有同样识别序列：的同裂就是一对
50、具有同样识别序列：的同裂同裂酶形成同样的粘性末端，重组后识别序列不变！同裂酶形成同样的粘性末端，重组后识别序列不变！ b. 同尾酶同尾酶 （Isocaudamers）一组来源不同、识别序列各异，但能够切割形成相同粘性末端的核一组来源不同、识别序列各异，但能够切割形成相同粘性末端的核酸内切限制酶。例如酸内切限制酶。例如BanHBanH、BaglBagl和和Sau3ASau3A，即是组同尾酶，即是组同尾酶， （5） DNA连接酶（1）连接酶能够利用ATP分子中-磷酸集团的能量，通过催化两条并排的DNA链的5-P-集团和3-OH集团之间形成一个磷酸二酯键，而使两个DNA片段共价连接起来的核酸酶。（2
51、）连接条件：a.被连接的两条DNA片段，一条链的3-末端具有一个游离的-OH集团；另一条的5-末端存在一个磷酸集团（P）。b.在-OH和-P集团之间形成磷酸二酯键是一种需要能量的过程（ATP）。c.最佳连接温度：416。4. 基因克隆的载体基因克隆的载体（1 1） 基因克隆载体的类型：基因克隆载体的类型：基因克隆载体的类型：基因克隆载体的类型： （a a） 质粒载体；质粒载体；质粒载体；质粒载体； （b b） 柯斯质粒载体；柯斯质粒载体；柯斯质粒载体；柯斯质粒载体； （c c） 噬菌体载体；噬菌体载体；噬菌体载体；噬菌体载体； （d d） 单链噬菌体载体；单链噬菌体载体；单链噬菌体载体；单链噬
52、菌体载体； （e e） 噬菌粒载体；噬菌粒载体；噬菌粒载体；噬菌粒载体； （f f） 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体 （g g） YAC YAC后载体后载体后载体后载体（2 2） 质粒载体质粒载体质粒载体质粒载体 （a a） 质粒（质粒（质粒（质粒（PlasmidPlasmid）的定义）的定义）的定义）的定义 一般指一类独立于细菌染色体一般指一类独立于细菌染色体一般指一类独立于细菌染色体一般指一类独立于细菌染色体DNADNA（染色体外）的自主（染色体外）的自主（染色体外）的自主（染色体外）的自主 复制的共价、闭合、环形双链的复制的共价、闭合、环形双链的
53、复制的共价、闭合、环形双链的复制的共价、闭合、环形双链的DNADNA分子。分子。分子。分子。（b）质粒的一般特性）质粒的一般特性 共价、闭合、环形双链的共价、闭合、环形双链的DNA分子（分子（covalently closed circuler DNA,cccDNA）除了酵母杀伤质粒除了酵母杀伤质粒RNA外，所有的质粒都是外，所有的质粒都是DNA。 质粒质粒DNA的复制必须依赖于寄主细胞提供核酸酶的复制必须依赖于寄主细胞提供核酸酶及其他蛋白质分子。及其他蛋白质分子。 （3 3） 质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA的分子构型的分子构型的分子构型的分子构型a. sc构型构型即即cccDNAc
54、ccDNA所呈现的超螺旋构型，所呈现的超螺旋构型， 走在凝胶的最前面；走在凝胶的最前面；b. OCb. OC构型构型即开环即开环DNADNA（OC DNAOC DNA）的构型，其中）的构型，其中一条一条DNADNA链保持完整的环形结构，另一条链则出现链保持完整的环形结构，另一条链则出现一至数个缺口，走在凝胶的最后面；一至数个缺口，走在凝胶的最后面；c. Lc. L构型构型发生双链断裂形成的线性发生双链断裂形成的线性DNADNA的构型。的构型。通称通称L L型，走在凝胶的中间部位。型，走在凝胶的中间部位。（4）质粒载体必须具备的条件）质粒载体必须具备的条件a. 一般具有一般具有一般具有一般具有l
55、 l l l个复制区或复制因子；个复制区或复制因子；个复制区或复制因子；个复制区或复制因子；b.b.b.b.具有具有具有具有l l l l到到到到2 2 2 2个抗生素抗性基因（供选择重组子）；个抗生素抗性基因（供选择重组子）；个抗生素抗性基因（供选择重组子）；个抗生素抗性基因（供选择重组子）；c.c.c.c.具有若干种核酸内切限制酶的单个切点具有若干种核酸内切限制酶的单个切点具有若干种核酸内切限制酶的单个切点具有若干种核酸内切限制酶的单个切点 （供外源（供外源（供外源（供外源DNADNADNADNA片段的插入）；片段的插入）；片段的插入）；片段的插入）；d.d.d.d.较小的分子量和较高的拷
56、贝数较小的分子量和较高的拷贝数较小的分子量和较高的拷贝数较小的分子量和较高的拷贝数 （质粒载体的克隆能力约（质粒载体的克隆能力约（质粒载体的克隆能力约（质粒载体的克隆能力约5-6kb5-6kb5-6kb5-6kb）。）。）。）。5. DNA5. DNA分子的体外重组分子的体外重组（1）粘性末端连接法：用同样的核酸内切限制酶，例如EcoRI，分别切割外源 克 隆 的 DNA和 载 体DNA，两者就会形成具有相同的互补的粘性末端，因此可荣誉地用DNA连接酶将它们连接起来。6.检测重组体克隆的菌落杂交技术(a)将硝酸纤维素滤膜铺放在生长着转化菌落的平板表面，使其中的质粒DNA转移到滤膜上；(b)取出
57、滤膜，作溶菌、碱变性、酸中和等处理后，置80下烤干；(c)带有DNA印迹的滤膜同32P标记的适当探针杂交，以检测带有重组质粒（含有被研究的DNA插入片段)的阳性菌落；(d)将放射自显影的X光底片同保留下来的原菌落平板对照，从中挑出阳性菌落，供进一步的分析研究。 7. 表达载体的结构表达载体的结构 ( ( ( ( 大肠杆菌表达载体的结构成分大肠杆菌表达载体的结构成分大肠杆菌表达载体的结构成分大肠杆菌表达载体的结构成分) ) ) )a.a.a.a.原核启动子原核启动子原核启动子原核启动子参与控制真核基因转录与转译参与控制真核基因转录与转译 的遗传元件。的遗传元件。b. b. b. b. 标记基因标
58、记基因标记基因标记基因抗菌素抗性基因。供选择转化子抗菌素抗性基因。供选择转化子 用。用。 c.c.c.c.多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点供外源基因的插入构建重组体供外源基因的插入构建重组体 分子。分子。d.d.d.d.终止序列终止序列终止序列终止序列包括转录终止子和转译终止子。包括转录终止子和转译终止子。8. 克隆的真核基因在大肠杆菌中表达克隆的真核基因在大肠杆菌中表达a.将外源基因的cDNA序列；b.插入的片段保持正确的读码结构和正确的序列取向的条件下，克隆在大肠杆菌表达载体的适当的位点上；c.置于原核启动子的控制下，从而能够在大肠杆菌细胞中正确地转录和转译，并表达出所克隆的真核目
59、的基因的蛋白质。9. 基因工程的应用基因工程的应用（1 1 1 1）植物基因工程在农业生产上的应用：）植物基因工程在农业生产上的应用：）植物基因工程在农业生产上的应用：）植物基因工程在农业生产上的应用： a. a. a. a.提高农业生产提高农业生产提高农业生产提高农业生产的产量；的产量；的产量；的产量；b.b.b.b.改良改良改良改良 农作的品质；农作的品质；农作的品质；农作的品质； c. c. c. c.培育新的品种。培育新的品种。培育新的品种。培育新的品种。（2 2 2 2）基因工程在工业生产上的应用：）基因工程在工业生产上的应用：）基因工程在工业生产上的应用：）基因工程在工业生产上的应
60、用：a.a.a.a.纤维素的开发利用；纤维素的开发利用；纤维素的开发利用；纤维素的开发利用；b.b.b.b.乳制品的发酵；乳制品的发酵；乳制品的发酵；乳制品的发酵；c.c.c.c.单细胞蛋白质的生产；单细胞蛋白质的生产；单细胞蛋白质的生产；单细胞蛋白质的生产；d.d.d.d.酿酒工业上酿酒工业上酿酒工业上酿酒工业上的开发。的开发。的开发。的开发。（3 3 3 3）在医学卫生上的应用：）在医学卫生上的应用：）在医学卫生上的应用：）在医学卫生上的应用：a.a.a.a.新药的开发和利用；新药的开发和利用；新药的开发和利用；新药的开发和利用；b.b.b.b.遗传遗传遗传遗传病的基因治疗；病的基因治疗；
61、病的基因治疗；病的基因治疗；c.c.c.c.癌症的基因治疗；癌症的基因治疗；癌症的基因治疗；癌症的基因治疗； d. d. d. d.疾病个体化的症疾病个体化的症疾病个体化的症疾病个体化的症断与治疗；断与治疗；断与治疗；断与治疗； d. d. d. d. 新疫苗的开发利用；新疫苗的开发利用；新疫苗的开发利用；新疫苗的开发利用；e.e.e.e.新医药材料的开发新医药材料的开发新医药材料的开发新医药材料的开发利用。利用。利用。利用。 （4 4 4 4）基因工程在环境卫生上的应用：）基因工程在环境卫生上的应用：）基因工程在环境卫生上的应用：）基因工程在环境卫生上的应用：a.a.a.a.降解塑料等污染物降解塑料等污染物降解塑料等污染物降解塑料等污染物质；质；质；质；b.b.b.b.农药污染的生物防治。农药污染的生物防治。农药污染的生物防治。农药污染的生物防治。（5 5 5 5）基因工程在防空军事上的应用：）基因工程在防空军事上的应用：）基因工程在防空军事上的应用：）基因工程在防空军事上的应用：基因高级材料研发和基因高级材料研发和基因高级材料研发和基因高级材料研发和利用。利用。利用。利用。 谢谢大家 再见！
