形态学实验技术.ppt

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1、形态学实验技术形态学实验技术河北联合大学实验中心河北联合大学实验中心李琪佳李琪佳组织切片制作技术组织切片制作技术 石蜡切片常规染色技术石蜡切片常规染色技术 石蜡切片特殊染色技术石蜡切片特殊染色技术免疫组织（细胞）化学技术免疫组织（细胞）化学技术 免疫细胞化学的理论基础免疫细胞化学的理论基础 免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术亲和免疫细胞化学技术 重点介绍：重点介绍：电子显微镜技术（电子显微镜技术（electron electron microscope, EMmicroscope, EM）1. 透射电子显微镜透射电子显微镜2.

2、扫描电子显微镜扫描电子显微镜3.电镜技术与生物医学超微结构电镜技术与生物医学超微结构4. 细胞超微结构与超微结构病理细胞超微结构与超微结构病理激光扫描共聚焦显微镜技术（激光扫描共聚焦显微镜技术（Confocal Confocal Laser Scanning MicroscopeLaser Scanning Microscope）集高、精、集高、精、集高、精、集高、精、尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。该仪器尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。该仪器尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。该仪器尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。该仪器突破了普通光学显微镜不能对细胞或组织内部进突破了普通光学显微

3、镜不能对细胞或组织内部进突破了普通光学显微镜不能对细胞或组织内部进突破了普通光学显微镜不能对细胞或组织内部进行定位检测的限制，实现了对细胞内部光学断层行定位检测的限制，实现了对细胞内部光学断层行定位检测的限制，实现了对细胞内部光学断层行定位检测的限制，实现了对细胞内部光学断层扫描成像。可检测细胞内核酸、细胞骨架、细胞扫描成像。可检测细胞内核酸、细胞骨架、细胞扫描成像。可检测细胞内核酸、细胞骨架、细胞扫描成像。可检测细胞内核酸、细胞骨架、细胞内内内内pHpHpHpH、CaCaCaCa离子浓度、膜电位、过氧化物、细胞间离子浓度、膜电位、过氧化物、细胞间离子浓度、膜电位、过氧化物、细胞间离子浓度、膜

4、电位、过氧化物、细胞间通讯、细胞筛选及定量等。为活细胞功能研究开通讯、细胞筛选及定量等。为活细胞功能研究开通讯、细胞筛选及定量等。为活细胞功能研究开通讯、细胞筛选及定量等。为活细胞功能研究开辟了新途径，成为现代细胞生物学研究不可缺少辟了新途径，成为现代细胞生物学研究不可缺少辟了新途径，成为现代细胞生物学研究不可缺少辟了新途径，成为现代细胞生物学研究不可缺少的的工具。的的工具。的的工具。的的工具。流式细胞仪技术（流式细胞仪技术（Flow MicrofluorimetryFlow Microfluorimetry） 是一种单细胞定量分析和分选的新技术。是一种单细胞定量分析和分选的新技术。其范围包括

5、了细胞表面或细胞内的各种抗其范围包括了细胞表面或细胞内的各种抗原、蛋白、酶以及基因表达产物；还有细原、蛋白、酶以及基因表达产物；还有细胞内的核酸定量或胞内的核酸定量或DNADNA倍体、细胞周期分析；倍体、细胞周期分析；尤其是癌基因的检测、血细胞表型分析、尤其是癌基因的检测、血细胞表型分析、细胞分子和粘附分子的检查、细胞凋亡分细胞分子和粘附分子的检查、细胞凋亡分析、肿瘤相关抗原及单种细胞的纯化。析、肿瘤相关抗原及单种细胞的纯化。 第一章第一章 组织切片制作技术组织切片制作技术第一节概述第一节概述 组织切片的制作技术属于组织病理学范组织切片的制作技术属于组织病理学范畴它是指采用包埋剂使组织内渗入某

6、种支畴它是指采用包埋剂使组织内渗入某种支持物质，使组织保持一定的硬度，然后利持物质，使组织保持一定的硬度，然后利用切片机切成薄片，经染色在显微镜下观用切片机切成薄片，经染色在显微镜下观察。根据支持物的不同，有石蜡切片、明察。根据支持物的不同，有石蜡切片、明胶切片、塑料切片、冷冻切片等类别。制胶切片、塑料切片、冷冻切片等类别。制成的切片捞置于载物网上，经烘干后可进成的切片捞置于载物网上，经烘干后可进行染色或备用。行染色或备用。 组织切片技术包括组织的取材、固定、组织切片技术包括组织的取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及染脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及染色等。色等。 组织病理学标本大致可分为

7、：手术标组织病理学标本大致可分为：手术标本、内镜取材标本、穿刺标本、细胞本、内镜取材标本、穿刺标本、细胞学标本学标本第二节第二节 组织的处理组织的处理 取材取材 固定固定 脱水脱水 透明透明 浸蜡与包浸蜡与包埋埋 一、取材（一、取材（ tisssue processing）1 1 材料新鲜：活检组织离体后立即固定，最材料新鲜：活检组织离体后立即固定，最迟不能高于迟不能高于3030分钟。分钟。2 2 取材部位及切面：纵切或横切往往是显示取材部位及切面：纵切或横切往往是显示组织结构明晰的关键。掌握正确的取材部组织结构明晰的关键。掌握正确的取材部位就必须熟悉机体的组织结构和解剖特点，位就必须熟悉机体

8、的组织结构和解剖特点，原则上应在病变与正常组织的交界处取材，原则上应在病变与正常组织的交界处取材，避开坏死出血区。避开坏死出血区。，甚至卷曲变形，特别是神经肌肉组织，可，甚至卷曲变形，特别是神经肌肉组织，可将其两端扎在木片或小木棍上进行固定。将其两端扎在木片或小木棍上进行固定。 3.3.勿使组织受挤压：取材刀剪应锋利，切勿使组织受挤压：取材刀剪应锋利，切开时取材刀严禁来回挫动，以避免组织结开时取材刀严禁来回挫动，以避免组织结构变形、细胞破碎。构变形、细胞破碎。 4.4.防止变形：固定后的组织或多或少会产生防止变形：固定后的组织或多或少会产生收缩现象收缩现象5 5 组织块力求小而薄：切块的大小、

9、厚度及组织块力求小而薄：切块的大小、厚度及质地决定了固定的效果，一般情况下，取质地决定了固定的效果，一般情况下，取材大小为材大小为21cm21cm，厚度为，厚度为2 24mm4mm。二、固定（二、固定（fixationfixation） 固定是将某些化学试剂（固定液）渗透到固定是将某些化学试剂（固定液）渗透到需要保存或制作切片的脏器或组织、细胞需要保存或制作切片的脏器或组织、细胞中，使其所含物质尽量保持在生活状态时中，使其所含物质尽量保持在生活状态时的形态结构和位置。的形态结构和位置。固定的目的：固定的目的：1.1.迅速防止组织细胞的死后变化迅速防止组织细胞的死后变化, ,防止自防止自溶与腐败

10、使之尽量保持生前的形态结溶与腐败使之尽量保持生前的形态结构构。2.2.使细胞内的蛋白质、糖、脂肪、酶等使细胞内的蛋白质、糖、脂肪、酶等成分变为不溶性物质，以保持其原有成分变为不溶性物质，以保持其原有形态及特定位置。形态及特定位置。3 3. .能将细胞的半液体状变成半固体状，能将细胞的半液体状变成半固体状，使组织变硬以利切片。使组织变硬以利切片。4.4.可使组织内的各种成分产生不同的折可使组织内的各种成分产生不同的折光率。光率。5.5.某些固定液可起助染作用而增进染色。某些固定液可起助染作用而增进染色。固定方法固定方法uu 浸泡固定浸泡固定uu注射、灌注固定注射、灌注固定uu微波固定微波固定uu

11、蒸汽固定蒸汽固定常用的固定剂常用的固定剂单纯性固定剂：甲醛（福尔马林单纯性固定剂：甲醛（福尔马林 formalin）乙醇；乙酸。乙醇；乙酸。混合固定剂：中性甲醛混合固定剂：中性甲醛pH 7.0（甲醛、磷酸（甲醛、磷酸缓冲液）；缓冲液）；A-F液液 （甲醛、酒精）（甲醛、酒精）三、脱水（三、脱水（dehydration） 将组织内的水分用某些化学试剂置换出来将组织内的水分用某些化学试剂置换出来的过程的过程脱水的目的脱水的目的 标本经固定和水洗后，组织内有大量水份，标本经固定和水洗后，组织内有大量水份，不能与二甲苯混溶，因此必须脱水。不能与二甲苯混溶，因此必须脱水。常用的脱水剂和脱水方法常用的脱水

12、剂和脱水方法 脱水剂有：乙醇、丙酮等脱水剂有：乙醇、丙酮等 8080 酒精酒精 30 30 分钟分钟 9595 酒精酒精 1 12 2小时小时 9595 酒精酒精 1 12 2小时小时 100100酒精酒精 1 12 2小时小时 100100酒精酒精 1 12 2小时小时四、透明（四、透明（四、透明（四、透明（clearingclearing） 为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后必须经为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后必须经为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后必须经为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后必须经过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，过一种既能与

13、酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，而达到石蜡浸入组织块的目的。此时因组织块的而达到石蜡浸入组织块的目的。此时因组织块的而达到石蜡浸入组织块的目的。此时因组织块的而达到石蜡浸入组织块的目的。此时因组织块的水分被二甲苯取代，其折射指数接近于组织蛋白水分被二甲苯取代，其折射指数接近于组织蛋白水分被二甲苯取代，其折射指数接近于组织蛋白水分被二甲苯取代，其折射指数接近于组织蛋白的折光指数，组织块变得透亮。因此透明是石蜡的折光指数，组织块变得透亮。因此透明是石蜡的折光指数，组织块变得透亮。因此透明是石蜡的折光指数，组织块变得透亮。因此透明是石蜡包埋前的一个特定步骤

14、。包埋前的一个特定步骤。包埋前的一个特定步骤。包埋前的一个特定步骤。透明的目的：透明的目的：透明的目的：透明的目的：便于浸蜡、包埋。透明剂即能与脱水便于浸蜡、包埋。透明剂即能与脱水便于浸蜡、包埋。透明剂即能与脱水便于浸蜡、包埋。透明剂即能与脱水剂相混溶，又能与包埋剂（石蜡剂相混溶，又能与包埋剂（石蜡剂相混溶，又能与包埋剂（石蜡剂相混溶，又能与包埋剂（石蜡）相混溶，起）相混溶，起到桥梁作用。到桥梁作用。 大多数脱水剂不能和包埋剂（石蜡）混溶，大多数脱水剂不能和包埋剂（石蜡）混溶，故必须通过透明剂置换出脱水剂后才能进故必须通过透明剂置换出脱水剂后才能进行后续程序。行后续程序。常用的透明剂常用的透明

15、剂uu二甲苯：为最常用的透明剂，有毒、易燃、二甲苯：为最常用的透明剂，有毒、易燃、易挥发；沸点易挥发；沸点1381380 0C-140C-1400 0C,C,长期接触对粘长期接触对粘膜有刺激作用。膜有刺激作用。uu氯仿氯仿: :易挥发微溶于水，易溶于醇、醚、易挥发微溶于水，易溶于醇、醚、苯等。它比二甲苯透明力差，但不宜使组苯等。它比二甲苯透明力差，但不宜使组织变脆，使大块组织的良好透明剂织变脆，使大块组织的良好透明剂常用的透明方法常用的透明方法uu二甲苯透明法（常用）：彻底脱水的组织二甲苯透明法（常用）：彻底脱水的组织块块 二甲苯二甲苯1 1 二甲苯二甲苯2 2，此二步总的，此二步总的时间不超

16、过时间不超过4040分钟。分钟。uu氯仿透明法：彻底脱水的组织块按氯仿透明法：彻底脱水的组织块按 3 3：1 1氯仿、纯酒精混合液氯仿、纯酒精混合液1 1小时小时 氯仿氯仿1 - 21 - 2小时小时 1 1：1 1氯仿石蜡混合液氯仿石蜡混合液1 1小时。小时。五、浸蜡与包埋五、浸蜡与包埋浸蜡浸蜡(paraffin infiltrating)和包埋和包埋(embedding) 是指标本经过前期处理后，再置于支是指标本经过前期处理后，再置于支持物中，使支持物透入组织内部，并将组持物中，使支持物透入组织内部，并将组织埋入、包裹的过程。常用的支持物有明织埋入、包裹的过程。常用的支持物有明胶、石蜡、火

17、棉胶、树脂、炭蜡等，他们胶、石蜡、火棉胶、树脂、炭蜡等，他们及时浸透剂又是包埋剂。其中最常用的是及时浸透剂又是包埋剂。其中最常用的是石蜡。石蜡。 浸蜡的方法浸蜡的方法n n此法应在此法应在56560 0C C62620 0C C的温箱内进行，液状石的温箱内进行，液状石蜡的量应为标本的蜡的量应为标本的25253030倍。倍。n n方法：透明后的组织方法：透明后的组织 52520 0C C54540 0C C（软蜡）（软蜡）1 1小时小时 54540 0C C56560 0C C石蜡石蜡1 1小时小时 58580 0C C60600 0C C（硬蜡）（硬蜡）1 1小时小时 54540 0C C56

18、560 0C C石蜡进行石蜡进行包埋包埋第三节第三节 组织切片组织切片切片（切片（section）1.1.整修蜡块：组织四周应留有整修蜡块：组织四周应留有2 24 mm 4 mm 蜡边，蜡边，蜡块的上下两边应平行。蜡块的上下两边应平行。2.2.镶装：镶装平面应尽可能与切片刀刃平行。镶装：镶装平面应尽可能与切片刀刃平行。3.3.调整：切片机的进度尺常定在调整：切片机的进度尺常定在4 46m6m，切，切片刀的倾斜角在片刀的倾斜角在2020度左右。度左右。4.4.修切平面：修切的组织片不能过厚，以免修切平面：修切的组织片不能过厚，以免造成组织块的人为损失，标准为造成组织块的人为损失，标准为15m15

19、m次。次。5.切片：要求质量，左手毛笔，右手眼科镊，切片：要求质量，左手毛笔，右手眼科镊，转速均匀。转速均匀。6.6.展片、捞片：常用水温为展片、捞片：常用水温为45450 0C C左右，组织左右，组织膜与玻片附着的位置为，右手持片，玻片膜与玻片附着的位置为，右手持片，玻片的左的左2 23 3正中。正中。7.7.烘片：烘烤箱的温度为烘片：烘烤箱的温度为63630 0C C以下，时间常以下，时间常为为1212小时。小时。第二章第二章 石蜡切片常规染色技术石蜡切片常规染色技术第一节概述第一节概述 染色的意义及目的染色的意义及目的: 染色（染色（stainning）是）是用染液对组织切片进行处理，使

20、组织中的用染液对组织切片进行处理，使组织中的不同成分被染上相应的颜色，产生不同的不同成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以利于光镜观察和分析。组织染折射率，以利于光镜观察和分析。组织染色属于生物染色的范畴。色属于生物染色的范畴。染色种类：染色种类：包括普通染色、特殊染色、单一染色、多色包括普通染色、特殊染色、单一染色、多色染色等。染色等。第二节第二节 苏木素苏木素伊红染色（伊红染色（HEHE染色）染色）苏木素（苏木素（haematoxylinhaematoxylin）又称苏木精，一种又称苏木精，一种天然碱性染料，对细胞核具有优良的染色天然碱性染料，对细胞核具有优良的染色能力。能力。伊红伊红

21、Y Y（eosineosin）又称曙红又称曙红Y,Y,简称伊红，属酸简称伊红，属酸性染料，是良好的细胞质染色剂。性染料，是良好的细胞质染色剂。苏木素苏木素(haematoxylin)(haematoxylin)伊红染色法，简称伊红染色法，简称HEHE染色，是医学领域中最广泛应用于细胞染色，是医学领域中最广泛应用于细胞和组织的染色方法，也被称为常规染色。和组织的染色方法，也被称为常规染色。一、一、HEHE染色的基本原理染色的基本原理细胞核染色的原理：细胞核染色的原理：细胞核主要由细胞核主要由DNADNA构成，构成，带负电荷，呈酸性，易于带正电荷的碱性带负电荷，呈酸性，易于带正电荷的碱性染料结合。

22、染料结合。 细胞质的染色原理细胞质的染色原理: :细胞之内主要成分是蛋细胞之内主要成分是蛋白质白质, ,为两性化合物，细胞浆的染色与为两性化合物，细胞浆的染色与pHpH值值有密切关系，当有密切关系，当pHpH调到蛋白质等电点时，调到蛋白质等电点时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。易染色。 必须将必须将pHpH调至等电点以下时，再染液中加调至等电点以下时，再染液中加入醋酸使胞浆带正电（阳离子），就可被入醋酸使胞浆带正电（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。带负电荷（阴离子）的染料染色。 伊红伊红Y: Y: 是一种化学合成的酸性染料，在水是

23、一种化学合成的酸性染料，在水中解离成带负电的阴离子，与蛋白质的带中解离成带负电的阴离子，与蛋白质的带氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染成红色。成红色。 二、染色方法二、染色方法1.1.自温箱中取出切片后，立即放入二甲苯自温箱中取出切片后，立即放入二甲苯 、中脱蜡各中脱蜡各5 5分钟。分钟。2.2.入纯酒精入纯酒精1 1、2 2中各中各5 5分钟以洗去二甲苯。分钟以洗去二甲苯。3.3.入入95%95%酒精和酒精和80%80%酒精中各酒精中各5 5分钟。分钟。4.4.入自来水洗涤（水化）。入自来水洗涤（水化）。5.5.入苏木素染液入苏木素染液5-105-10分

24、钟。分钟。6.6.自来水洗。自来水洗。7.7. 0.5-1% 0.5-1%盐酸酒精分化数秒钟。盐酸酒精分化数秒钟。8.8. 充分水洗蓝化充分水洗蓝化3030分钟。分钟。9.9. 0.5-1% 0.5-1%伊红伊红1-21-2分钟。分钟。10.10. 80% 80%、95%95%、纯酒精、纯酒精1 1、2(2(脱水脱水) )各各5 5分钟。分钟。11.11. 二甲苯二甲苯1 1、2 2中中( (透明透明) )各各5 51010分钟。分钟。12.12. 中性树胶封固。中性树胶封固。HEHE染色中二甲苯、酒精和水洗作用：染色中二甲苯、酒精和水洗作用：1.1.二甲苯的作用二甲苯的作用: :二甲苯可以洗

25、去石蜡，使染料更二甲苯可以洗去石蜡，使染料更二甲苯可以洗去石蜡，使染料更二甲苯可以洗去石蜡，使染料更易进入到细胞和组织内；染色后的二甲苯起透明易进入到细胞和组织内；染色后的二甲苯起透明易进入到细胞和组织内；染色后的二甲苯起透明易进入到细胞和组织内；染色后的二甲苯起透明切片的作用。以利于光线的透过。切片的作用。以利于光线的透过。切片的作用。以利于光线的透过。切片的作用。以利于光线的透过。2.2.酒精的作用酒精的作用: :酒精用于苏木素染色前由高浓度向酒精用于苏木素染色前由高浓度向酒精用于苏木素染色前由高浓度向酒精用于苏木素染色前由高浓度向低浓度逐渐下降处理切片低浓度逐渐下降处理切片低浓度逐渐下降

26、处理切片低浓度逐渐下降处理切片, , , ,洗脱用于脱蜡的二甲苯。洗脱用于脱蜡的二甲苯。洗脱用于脱蜡的二甲苯。洗脱用于脱蜡的二甲苯。酒精和二甲苯互溶，二甲苯被除去。梯度酒精酒精和二甲苯互溶，二甲苯被除去。梯度酒精酒精和二甲苯互溶，二甲苯被除去。梯度酒精酒精和二甲苯互溶，二甲苯被除去。梯度酒精(95%,80%)(95%,80%)(95%,80%)(95%,80%)使水分逐渐进入切片，以免引起细胞形使水分逐渐进入切片，以免引起细胞形使水分逐渐进入切片，以免引起细胞形使水分逐渐进入切片，以免引起细胞形态结构的人工改变。态结构的人工改变。态结构的人工改变。态结构的人工改变。伊红染色后的梯度酒精伊红染色

27、后的梯度酒精伊红染色后的梯度酒精伊红染色后的梯度酒精(80%,90%,95%,100%)(80%,90%,95%,100%)(80%,90%,95%,100%)(80%,90%,95%,100%)是为了是为了是为了是为了逐渐脱去组织中的水分逐渐脱去组织中的水分逐渐脱去组织中的水分逐渐脱去组织中的水分, , , ,为二甲苯进入细胞为二甲苯进入细胞为二甲苯进入细胞为二甲苯进入细胞( ( ( (透明透明透明透明) ) ) )创造条件。否则切片组织不能显示清晰的细胞和创造条件。否则切片组织不能显示清晰的细胞和创造条件。否则切片组织不能显示清晰的细胞和创造条件。否则切片组织不能显示清晰的细胞和组织结构。

28、组织结构。组织结构。组织结构。3.3.水洗水洗: : 水洗是为了使苏木精进入细胞核内，使细水洗是为了使苏木精进入细胞核内，使细水洗是为了使苏木精进入细胞核内，使细水洗是为了使苏木精进入细胞核内，使细胞核着色；染色后的水洗是为洗去未与切片结合胞核着色；染色后的水洗是为洗去未与切片结合胞核着色；染色后的水洗是为洗去未与切片结合胞核着色；染色后的水洗是为洗去未与切片结合的染液；分化后的水洗是为了除去分化液和脱下的染液；分化后的水洗是为了除去分化液和脱下的染液；分化后的水洗是为了除去分化液和脱下的染液；分化后的水洗是为了除去分化液和脱下的染料。的染料。的染料。的染料。HEHE染色中分化和蓝化的作用：染

29、色中分化和蓝化的作用：1.1.分化作用分化作用: :苏木素染色后苏木素染色后, ,水洗去未结合在水洗去未结合在切片中的染液切片中的染液, ,但细胞核内结合过多的染液但细胞核内结合过多的染液和细胞浆中吸附过多的染料必须用分化液和细胞浆中吸附过多的染料必须用分化液(1%(1%盐酸酒精）脱去，以保证核与浆的染色盐酸酒精）脱去，以保证核与浆的染色分明。将此过程称为染色的分化作用。但分明。将此过程称为染色的分化作用。但不能过度。不能过度。2.蓝化作用蓝化作用: : 当分化以后苏木精在酸性条件下当分化以后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下则处于处于红色离子状态，在碱性条件下则处于兰色离子状态

30、。所以分化后用水洗去酸而兰色离子状态。所以分化后用水洗去酸而中止分化，也可用稀氨水或温水变蓝。此中止分化，也可用稀氨水或温水变蓝。此过程称蓝化作用。过程称蓝化作用。第三节第三节 组织切片特殊染色组织切片特殊染色(Masson(Masson三色染色三色染色) ) 为了显示组织或细胞中的正常结构或为了显示组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变、病原病理过程中出现的异常物质、病变、病原体等，需要选用相应的显示这些成分的染体等，需要选用相应的显示这些成分的染色方法进行染色，这些是常规染色所不能色方法进行染色，这些是常规染色所不能的。故称特殊染色。如细胞中的黑色素或的。故称特殊染色。如细

31、胞中的黑色素或含铁血黄素的区别，用特殊染色即可做到。含铁血黄素的区别，用特殊染色即可做到。 结结结结缔缔缔缔组组组组织织织织含含含含有有有有三三三三种种种种纤纤纤纤维维维维，即即即即胶胶胶胶原原原原纤纤纤纤维维维维、网网网网状状状状纤纤纤纤维维维维和和和和弹弹弹弹力力力力纤纤纤纤维维维维。这这这这三三三三种种种种纤纤纤纤维维维维广广广广泛泛泛泛分分分分布布布布于于于于身身身身体体体体各各各各处处处处，常常常常见见见见于于于于器器器器官官官官与与与与器器器器官官官官之之之之间间间间，组组组组织织织织与与与与组组组组织织织织之之之之间间间间以以以以及及及及细细细细胞胞胞胞和和和和细细细细胞胞胞胞之

32、之之之间间间间，这这这这些些些些纤纤纤纤维维维维具具具具有有有有支支支支持持持持、连连连连接接接接、营营营营养养养养、防防防防御御御御、保保保保护护护护和和和和创创创创伤伤伤伤修修修修复复复复等等等等功功功功能能能能，在在在在H.EH.EH.EH.E染染染染色色色色中中中中有有有有时时时时难难难难以以以以区区区区别别别别，特特特特别别别别是是是是在在在在某某某某些些些些病病病病理理理理改改改改变变变变时时时时，则则则则要借助于特染鉴别。要借助于特染鉴别。要借助于特染鉴别。要借助于特染鉴别。 特殊染色的方法很多，在此仅介绍胶原纤特殊染色的方法很多，在此仅介绍胶原纤维染色。维染色。 显示胶原纤维的

33、方法很多，最常用的是显示胶原纤维的方法很多，最常用的是Masson三色染色和三色染色和V.G染色。染色。应用：应用： 判定多种组织、器官的病变程度及修复情判定多种组织、器官的病变程度及修复情况；区分肿瘤组织中的纤维与平滑肌成分。况；区分肿瘤组织中的纤维与平滑肌成分。Masson三色染色技术操作三色染色技术操作MassonMasson复合染色液：酸性复红、丽春红、橘黄复合染色液：酸性复红、丽春红、橘黄复合染色液：酸性复红、丽春红、橘黄复合染色液：酸性复红、丽春红、橘黄GG、醋酸醋酸醋酸醋酸亮绿染色液（可用苯胺蓝替换）：亮绿、醋酸亮绿染色液（可用苯胺蓝替换）：亮绿、醋酸亮绿染色液（可用苯胺蓝替换）

34、：亮绿、醋酸亮绿染色液（可用苯胺蓝替换）：亮绿、醋酸染色过程：染色过程：染色过程：染色过程： 1.1.切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水切片脱蜡至水 2. 2. 苏木素染苏木素染苏木素染苏木素染5 5分钟分钟分钟分钟 , , 水洗水洗水洗水洗 3. 3. 盐酸酒精分化盐酸酒精分化盐酸酒精分化盐酸酒精分化, , 水洗水洗水洗水洗 4. 4. 染于丽春红复红液染于丽春红复红液染于丽春红复红液染于丽春红复红液5 5分钟分钟分钟分钟, , 水洗水洗水洗水洗5. 5. 5. 5. 磷钼酸水溶液分化磷钼酸水溶液分化磷钼酸水溶液分化磷钼酸水溶液分化5 5 5 5分钟分钟分钟分钟, , , ,水洗水洗水洗水

35、洗6. 6. 6. 6. 染于亮绿染于亮绿染于亮绿染于亮绿2-52-52-52-5分钟分钟分钟分钟7.7.7.7.脱水、透明、封固脱水、透明、封固脱水、透明、封固脱水、透明、封固结果判定结果判定结果判定结果判定: : 胶原纤维呈绿色或蓝色，肌纤维、纤维胶原纤维呈绿色或蓝色，肌纤维、纤维胶原纤维呈绿色或蓝色，肌纤维、纤维胶原纤维呈绿色或蓝色，肌纤维、纤维素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。脑尼氏体脑尼氏体 星形细胞星形细胞肾淀粉样变肾淀粉样变 刚果红染色刚果红染色肝表面抗原维多利亚蓝肝表面抗原维多利亚蓝第

36、三章第三章 免疫组织（细胞）化学免疫组织（细胞）化学(immunohistochemistry,IHC) )第一节第一节 免疫组织化学概论免疫组织化学概论 免疫组织化学是利用免疫学抗体与抗原免疫组织化学是利用免疫学抗体与抗原结合的原理及组织化学技术对组织、细胞结合的原理及组织化学技术对组织、细胞特定抗原或抗体进行定位和定量的技术，特定抗原或抗体进行定位和定量的技术，是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科。若想学好免疫组织化学，必须先了解科。若想学好免疫组织化学，必须先了解与之相关的免疫学基础。与之相关的免疫学基础。 免疫组织化学主要免疫组织化学主要原理原理是

37、用荧光素、是用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。 凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素磷脂、白质、多肽、核酸、酶、激素磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其用免特异性抗体在组织、细胞内将其

38、用免疫细胞化学手段检出和研究。疫细胞化学手段检出和研究。乳腺导管癌乳腺导管癌ERER细支气管肺泡癌细支气管肺泡癌TTF-1TTF-1免疫细胞化学的突出优点是：免疫细胞化学的突出优点是：1.1.高度的特异性高度的特异性 抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，细抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的认别能力，在抗或单价抗体，具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。其它组织化学方法难以相比的。2. .敏感性高敏感性高免疫细胞化

39、学采用各种有效方法最大限免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度保存细胞和组织内待检物的抗原性，采度保存细胞和组织内待检物的抗原性，采用多种增敏方法，使用高度敏感的和高亲用多种增敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证检出细胞内超微量的抗和力的抗体，保证检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子显微镜观察结果，原分子，用显微镜和电子显微镜观察结果，因此它是在细胞、分子水平或基因水平的因此它是在细胞、分子水平或基因水平的检测技术。检测技术。3. 3. 方法步骤统一方法步骤统一 虽然免疫组化技术的方法很多，但基本程序虽然免疫组化技术的方法很多，但基本程序相同只要掌握了原理和一种方法，其它方相同只要

40、掌握了原理和一种方法，其它方法大同小异。法大同小异。4.4.既可定位、定性又可定量既可定位、定性又可定量免疫组化技术用于组织或细胞成分定性、定免疫组化技术用于组织或细胞成分定性、定位及定量的研究位及定量的研究有关的免疫学理论有关的免疫学理论一、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关一、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系系抗原抗原(Antigen)(Antigen)凡能刺激机体产生抗体，并凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。物质所具有的这种特性称为抗原性。抗原物质所具有的这种特性称为抗原性。抗原可以是可溶性物质（如病毒和蛋白质）或可以是可溶性

41、物质（如病毒和蛋白质）或微粒（细菌或组织细胞）。也可有外源性微粒（细菌或组织细胞）。也可有外源性和内源性之分。和内源性之分。 抗体抗体(Antibody)(Antibody)是机体受抗原刺激后，在体液是机体受抗原刺激后，在体液是机体受抗原刺激后，在体液是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白称免疫球蛋白称免疫球蛋白称免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)(Immunoglobulin, Ig)(Immunoglobul

42、in, Ig)(Immunoglobulin, Ig)。含有免疫。含有免疫。含有免疫。含有免疫球蛋白的血清称免疫血清。人类免疫球蛋白有五球蛋白的血清称免疫血清。人类免疫球蛋白有五球蛋白的血清称免疫血清。人类免疫球蛋白有五球蛋白的血清称免疫血清。人类免疫球蛋白有五类即类即类即类即IgG, IgM, IgA, IgE,IgDIgG, IgM, IgA, IgE,IgDIgG, IgM, IgA, IgE,IgDIgG, IgM, IgA, IgE,IgD。抗体的种类：抗体的种类：根据获得抗体的途径或来源不同根据获得抗体的途径或来源不同根据获得抗体的途径或来源不同根据获得抗体的途径或来源不同分类分类

43、分类分类免疫抗体，天然抗体，自身抗体，完全抗体，不完免疫抗体，天然抗体，自身抗体，完全抗体，不完免疫抗体，天然抗体，自身抗体，完全抗体，不完免疫抗体，天然抗体，自身抗体，完全抗体，不完全抗体。全抗体。全抗体。全抗体。抗原与抗体的关系抗原与抗体的关系抗原是引起机体产生免疫反应的主要外抗原是引起机体产生免疫反应的主要外因，决定免疫反应的特异性，机体与抗原因，决定免疫反应的特异性，机体与抗原物质的斗争过程中为加速循环和排除抗原物质的斗争过程中为加速循环和排除抗原而产生的抗体、致敏淋巴细胞等物质，是而产生的抗体、致敏淋巴细胞等物质，是机体排除异体物质的保护性反应。没有抗机体排除异体物质的保护性反应。没

44、有抗原的刺激，机体不能产生抗体；利用抗体原的刺激，机体不能产生抗体；利用抗体可以检测抗原物质。可以检测抗原物质。二、免疫细胞化学的分类二、免疫细胞化学的分类 根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术；免疫酶细胞分为免疫荧光细胞化学技术；免疫酶细胞化学技术；免疫铁蛋白技术；免疫金化学技术；免疫铁蛋白技术；免疫金银银细胞化学技术；亲和免疫细胞化学技细胞化学技术；亲和免疫细胞化学技 术；免疫电子显微镜技术等。术；免疫电子显微镜技术等。 不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的

45、，剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括都包括: 抗体的制备，组织材料的处理，免抗体的制备，组织材料的处理，免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。目前国内外市场各种特异性抗体日益增多，目前国内外市场各种特异性抗体日益增多，可直接应用市售产品。我国自制抗体种类可直接应用市售产品。我国自制抗体种类较少。较少。三、免疫染色三、免疫染色可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染色。一般程序是：色。一般程序是： 标记抗体与标本中抗原反应结合；标记抗体与标本中抗原反应结合； 用用PBSPBS洗去未结合的成分；洗去未结合的成分； 直接观察结果

46、直接观察结果( (免疫荧光直接法免疫荧光直接法) )；或；或显色后再用显微镜观察显色后再用显微镜观察 ( (免疫酶直接法免疫酶直接法) )。在。在此基础上发展出间接法，多层法，双标记法此基础上发展出间接法，多层法，双标记法等各种方法。等各种方法。第二节第二节 免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术(immunofluorescence (immunofluorescence cytochemistry techniquecytochemistry technique）是将已知的抗原或是将已知的抗原或是将已知的抗原

47、或是将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再与组织切片或涂片中相应抗体标记上荧光素，再与组织切片或涂片中相应抗体标记上荧光素，再与组织切片或涂片中相应抗体标记上荧光素，再与组织切片或涂片中相应的抗原或抗体起反应，从而使形成的免疫复合物的抗原或抗体起反应，从而使形成的免疫复合物的抗原或抗体起反应，从而使形成的免疫复合物的抗原或抗体起反应，从而使形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下借助紫上带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下借助紫上带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下借助紫上带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下借助紫外光激发呈现出黄绿色或橘红色荧光，由此检测外光激发呈现出黄绿色或橘红色荧光，由

48、此检测外光激发呈现出黄绿色或橘红色荧光，由此检测外光激发呈现出黄绿色或橘红色荧光，由此检测抗原或抗体并定位。此方法称荧光抗原（抗体）抗原或抗体并定位。此方法称荧光抗原（抗体）抗原或抗体并定位。此方法称荧光抗原（抗体）抗原或抗体并定位。此方法称荧光抗原（抗体）法。以荧光抗体方法较为常见。法。以荧光抗体方法较为常见。法。以荧光抗体方法较为常见。法。以荧光抗体方法较为常见。直接法直接法: : 用已知特异性抗用已知特异性抗用已知特异性抗用已知特异性抗体与荧光素结合，制体与荧光素结合，制体与荧光素结合，制体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体。成特异性荧光抗体。成特异性荧光抗体。成特异性荧光抗体。直接用于组

49、织抗原的直接用于组织抗原的直接用于组织抗原的直接用于组织抗原的检查。常用于肾穿和检查。常用于肾穿和检查。常用于肾穿和检查。常用于肾穿和病原体的检查。病原体的检查。病原体的检查。病原体的检查。间接法：间接法：间接法：间接法：是直接法的重要改进。是直接法的重要改进。先用特异性抗体（一抗）先用特异性抗体（一抗）与组织标本反应，再用间与组织标本反应，再用间接荧光抗体（二抗）与结接荧光抗体（二抗）与结合在抗原的抗体结合，形合在抗原的抗体结合，形成成抗原抗体荧光抗体抗原抗体荧光抗体抗原抗体荧光抗体抗原抗体荧光抗体的复合体。是荧光亮度增的复合体。是荧光亮度增强，灵敏性高，目前应用强，灵敏性高，目前应用广泛。

50、广泛。检测操作流程检测操作流程( (直接法）直接法）在制备或购得高质量的荧光抗体的前提下，在制备或购得高质量的荧光抗体的前提下，可按直接法进行如下的操作：可按直接法进行如下的操作：1.1.细胞爬片、涂片经丙酮固定细胞爬片、涂片经丙酮固定10min10min后进入后进入PBSPBS充分洗涤；石蜡切片脱蜡入水后，充分洗涤；石蜡切片脱蜡入水后，0.1%0.1%胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化40min40min左右入左右入PBSPBS洗涤。洗涤。2.2.适当稀释的荧光抗体于湿盒内适当稀释的荧光抗体于湿盒内37370 0C C环境下环境下孵育孵育50min50min。3.PBS3.PBS洗洗33min33mi

51、n。4.0.1%4.0.1%伊文氏兰衬染伊文氏兰衬染3min3min。5.5.蒸馏水洗，水溶性封固剂封片。蒸馏水洗，水溶性封固剂封片。切片的观察及保存切片的观察及保存 染色好的标本应立即在荧光显微镜下进行染色好的标本应立即在荧光显微镜下进行观察异硫氰酸荧光黄（观察异硫氰酸荧光黄（FITCFITC）为黄绿色荧）为黄绿色荧光；四乙基罗达明（光；四乙基罗达明（BR200)BR200)为明亮橙色荧为明亮橙色荧光；四甲基异硫氰基罗丹明（光；四甲基异硫氰基罗丹明（TRITC)TRITC)为橙为橙红色荧光；红色荧光；CY3CY3为鲜红色荧光。随着时间的为鲜红色荧光。随着时间的推移及观察次数的增加，荧光逐渐减

52、弱。推移及观察次数的增加，荧光逐渐减弱。1212小时后衰减小时后衰减2525，一周后衰减，一周后衰减6060。坏死和凋亡的比较：绿色细胞为凋亡；红色坏死和凋亡的比较：绿色细胞为凋亡；红色细胞为坏死细胞为坏死第三节第三节 免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术（免疫酶细胞化学技术（immunoenzyme cytochemistry technique ）是在抗原抗是在抗原抗体特异性反应的前提下，借助酶细胞化学体特异性反应的前提下，借助酶细胞化学原理探测细胞内抗原或抗体及其存在部位原理探测细胞内抗原或抗体及其存在部位的一门技术。的一门技术。该方法将抗原抗体的免疫反该方法将抗原抗体

53、的免疫反应与酶的高效催化作用原理有机地结合，应与酶的高效催化作用原理有机地结合，通过酶催化底物进而发生一系列的化学反通过酶催化底物进而发生一系列的化学反应，使溶液呈现出颜色反应，从而显示抗应，使溶液呈现出颜色反应，从而显示抗原抗体特异性反应的存在。原抗体特异性反应的存在。 方法：按照酶是否预先与抗体结合在一起可方法：按照酶是否预先与抗体结合在一起可分为分为酶标抗体法酶标抗体法和和非标记抗体酶法非标记抗体酶法 常用的标记酶依次为：辣根过氧化物酶常用的标记酶依次为：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、碱性）、碱性磷酸酶（磷酸酶（alkaline phosphat

54、ase，ALP）、）、葡萄糖氧化酶（葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）。酶的成色反应取决于产生不同色）。酶的成色反应取决于产生不同色素的底物（如素的底物（如DAB）及适当的反应条件。）及适当的反应条件。免疫酶直接法免疫酶直接法免疫酶间接法免疫酶间接法（一）直接法：（一）直接法：用酶（如用酶（如HRP）标记的特异）标记的特异性抗体（一抗）直接与标本中的相应抗原性抗体（一抗）直接与标本中的相应抗原结合，形成抗原结合，形成抗原抗体抗体HRP复合物，最复合物，最后用酶底物后用酶底物DABH2O2（二胺基联苯胺）（二胺基联苯胺）呈现棕色或深棕色产物。呈现棕色或深棕色产物。优点：简单、

55、省优点：简单、省时、特异性高、非特异性染色较轻；缺点：时、特异性高、非特异性染色较轻；缺点：敏感性差。敏感性差。（二）间接法：（二）间接法：先用未标记的特异性抗体先用未标记的特异性抗体（一抗）与标本中相应的抗原反应，再（一抗）与标本中相应的抗原反应，再 用酶标记的用酶标记的“抗抗体抗抗体”（二抗（二抗）与已形成抗与已形成抗原抗体复合物的第一抗体分子反应，然后原抗体复合物的第一抗体分子反应，然后再进行显色反应。再进行显色反应。优点：用途广泛，只要优点：用途广泛，只要标记一种抗体，就可以检测多种抗原。一标记一种抗体，就可以检测多种抗原。一般免疫组化多采用此法。般免疫组化多采用此法。 上述免疫酶直接

56、法和间接法属上述免疫酶直接法和间接法属酶标抗体法。酶标抗体法。酶底物显色剂酶底物显色剂DABBCIP-NBTAECNew Fuchsin卡巴唑（三）过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（三）过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（peroxidaseantiperoxidase，PAP） 此种方法属此种方法属非标记抗体酶法（抗酶抗体非标记抗体酶法（抗酶抗体 法）法）。由于在酶标记过程中，酶与抗体之。由于在酶标记过程中，酶与抗体之间的结合损害部分抗体和酶的活性，降低间的结合损害部分抗体和酶的活性，降低了抗体的效价。另外，血清中非特异性抗了抗体的效价。另外，血清中非特异性抗体也可被酶标记，增加非特异性背景染色。

57、体也可被酶标记，增加非特异性背景染色。因此，在酶标记的基础上，发展了不标记因此，在酶标记的基础上，发展了不标记抗体的免疫酶技术。抗体的免疫酶技术。 此方法先用酶（此方法先用酶（HRP）制成高效价）制成高效价特异性特异性抗体抗体，再将酶与，再将酶与抗酶抗体抗酶抗体形成复合物形成复合物（PAP复合物）复合物）。此复合物稳定性好，灵。此复合物稳定性好，灵敏度高。可以避免酶标过程中酶和抗体的敏度高。可以避免酶标过程中酶和抗体的减弱。减弱。 基本染色流程：抗原抗体结合后，依次滴基本染色流程：抗原抗体结合后，依次滴加第二抗体和加第二抗体和PAP复合物，最终形成复合物，最终形成抗原抗原特异性一抗特异性一抗第

58、二抗体第二抗体PAP复合物复合物PAPPAP法原理法原理第四节亲和免疫细胞化学第四节亲和免疫细胞化学亲和免疫细胞化学技术（亲和免疫细胞化学技术（affinity cytochemisty technique ）是利用两种物是利用两种物质之间的高度亲和能力而互相结合的化学质之间的高度亲和能力而互相结合的化学反应。此种具有高度亲和能力的物质是卵反应。此种具有高度亲和能力的物质是卵白素白素生物素。生物素（生物素。生物素（biotin）即维生素）即维生素H。卵白素（。卵白素（avidin）称抗生物素，具有）称抗生物素，具有4个与维生素个与维生素H亲和力极高的结合点，他们之亲和力极高的结合点，他们之间的

59、亲和力比抗原抗体的亲和力高间的亲和力比抗原抗体的亲和力高100万倍，万倍，既能牢固结合以又不影响彼此生物活性既能牢固结合以又不影响彼此生物活性。称抗生物素称抗生物素生物素系统。其技术方法有：生物素系统。其技术方法有：抗生物素抗生物素生物素生物素过氧化物酶复合法过氧化物酶复合法(avidin-biotin peroxidase complex technique,ABC法法)、标记生物素标记生物素抗生抗生物素法物素法(labelled avidin-biotin technique,LAB)、链霉抗生物素蛋白链霉抗生物素蛋白-过过氧化物酶连接法氧化物酶连接法(streptavidin-perox

60、idase complex,SP)等。等。 ABC ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素素上，再将生物素- -过氧化物酶连接物与过过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备。将抗生物量的抗生物素蛋白反应而制备。将抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶，第一抗体为非标记抗体，生素标记的酶，第一抗体为非标记抗体，生物素标记的二抗与物素标记的二抗与ABCABC复合物相连接，最后复合物相连接，最后进行显色反应定位。进行显色反应定位。ABCABC法法一、抗生物素一、抗生物素生物素生物素过氧化物过氧化物酶复

61、合法（酶复合法（ABC）原理）原理特点：特点：1. 敏感性高敏感性高: 比比PAP法高法高20-40倍倍,这是由于生这是由于生物素与抗生物素间有较强的结合力。物素与抗生物素间有较强的结合力。2. 特异性强特异性强: 背景染色淡。背景染色淡。3. 方法简便方法简便: 节约时间节约时间,PAP法需两天法需两天,而而ABC法仅需几小时。法仅需几小时。ABC-HRPABC-HRP法操作流程法操作流程1.1.石蜡切片脱蜡至石蜡切片脱蜡至PBSPBS。2.2.0.10.10.050.05胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化30min30min。3.3.PBSPBS洗涤。洗涤。4.4.0.30.3H H2 2O O2

62、2甲醇液或甲醇液或3 3H H2 2O O2 2室温孵育室温孵育20min20min。5.5.正常动物血清正常动物血清(5-10%)(5-10%)室温孵育室温孵育10min10min。6.6.不洗，滴加适当稀释的一抗不洗，滴加适当稀释的一抗37370 0C 60minC 60min或或4 40 0C C过夜。过夜。7.7.生物素标记的第二抗体室温生物素标记的第二抗体室温30-60min30-60min8.8. PBS PBS洗涤。洗涤。9.9.ABCABC复合物复合物1:1001:1001:1501:150（A A和和B B液于临用前液于临用前等量混合）等量混合） 37370 0C 60min

63、C 60min或或4 40 0C C过夜。过夜。10.10.PBSPBS洗涤。洗涤。11.11.DAB-HDAB-H2 2O O2 2显色（镜检控制），水洗、复染、显色（镜检控制），水洗、复染、封片。封片。二、标记生物素二、标记生物素抗生物素法抗生物素法（LAB）原理）原理 用生物素标记抗体用生物素标记抗体为一抗体，以酶标为一抗体，以酶标记抗生物素为第二记抗生物素为第二抗体，经成色反应抗体，经成色反应而显示抗原物质。而显示抗原物质。特点特点:方法简便，但灵方法简便，但灵敏度低。敏度低。LAB法操作流程法操作流程1.1.切片在含有切片在含有1:100生物素标记的第一抗体生物素标记的第一抗体孵育孵

64、育1h , 室温。室温。2.2.PBS洗洗 2次，每次次，每次5 min。3.3.用用1：200过氧化物酶标记的抗生物素液孵过氧化物酶标记的抗生物素液孵育育45 min，水洗。，水洗。4.4.酶呈色反应。酶呈色反应。三、三、SPSP免疫组化染色原理免疫组化染色原理 SP SP法采用生物素标记的第二抗体与链法采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来检测细胞和组织中的抗原。质素混合液来检测细胞和组织中的抗原。特点特点:1.:1.高敏感性高敏感性; 2.; 2.低背景低背景; 3.; 3.简便快速简便快速; ;4.4.结果稳定结

65、果稳定 SP法原理法原理SP法操作流程1、脱蜡至水脱蜡至水2 2、修复抗原修复抗原3 3、0.3%0.3%过氧化氢过氧化氢 室温室温 10 min10 min4 4、非免疫血清非免疫血清 室温室温 5 530min30min5 5、特异性免疫抗体特异性免疫抗体( (一抗一抗) 3760 ) 3760 min min 或或44过夜过夜6、BiotinIgG（二抗）（二抗） 37 3040min7、StraptavidinHRP 374050min8、DAB显色显色各步间均以各步间均以PBSPBS液充分洗涤液充分洗涤第二代聚合酶两步法第二代聚合酶两步法( Envision)( Envision)

66、DaKO Envision DaKO Envision DaKO Envision DaKO Envision显色系统是显色系统是显色系统是显色系统是2019201920192019年投入美国市场年投入美国市场年投入美国市场年投入美国市场的，的，的，的，2019201920192019年引入中国，它是将二抗和酶通过一个年引入中国，它是将二抗和酶通过一个年引入中国，它是将二抗和酶通过一个年引入中国，它是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体(Envision)(Envision)(Envision

67、)(Envision)，把传统的二抗、三抗分别孵育合成一次孵育，由把传统的二抗、三抗分别孵育合成一次孵育，由把传统的二抗、三抗分别孵育合成一次孵育，由把传统的二抗、三抗分别孵育合成一次孵育，由于不再有二抗三抗通过生物素的结合，故整个系于不再有二抗三抗通过生物素的结合，故整个系于不再有二抗三抗通过生物素的结合，故整个系于不再有二抗三抗通过生物素的结合，故整个系统不受内源性生物素的干扰，是一个高敏感性显统不受内源性生物素的干扰，是一个高敏感性显统不受内源性生物素的干扰，是一个高敏感性显统不受内源性生物素的干扰，是一个高敏感性显色系统。此方法由于简单、快速、敏感性强且避色系统。此方法由于简单、快速、

68、敏感性强且避色系统。此方法由于简单、快速、敏感性强且避色系统。此方法由于简单、快速、敏感性强且避免了内源性生物素所造成的背景染色，有逐渐取免了内源性生物素所造成的背景染色，有逐渐取免了内源性生物素所造成的背景染色，有逐渐取免了内源性生物素所造成的背景染色，有逐渐取代其他免疫酶组织化学检测方法的趋势代其他免疫酶组织化学检测方法的趋势代其他免疫酶组织化学检测方法的趋势代其他免疫酶组织化学检测方法的趋势。Envision 法法Envision Envision 法操作流程法操作流程1. 1. 石蜡切片脱蜡至石蜡切片脱蜡至石蜡切片脱蜡至石蜡切片脱蜡至PBSPBSPBSPBS。2.2.2.2.0.30.

69、30.30.3H H H H2 2 2 2O O O O2 2 2 2甲醇液或甲醇液或甲醇液或甲醇液或3 3 3 3H H H H2 2 2 2O O O O2 2 2 2室温孵育室温孵育室温孵育室温孵育20min20min20min20min。3.3.3.3.抗原修复。抗原修复。抗原修复。抗原修复。4.4.4.4.滴加适当稀释的一抗滴加适当稀释的一抗滴加适当稀释的一抗滴加适当稀释的一抗373737370 0 0 0C 60minC 60minC 60minC 60min或或或或4 4 4 40 0 0 0C C C C过夜。过夜。过夜。过夜。5.5.5.5.PBSPBSPBSPBS洗涤。洗涤

70、。洗涤。洗涤。6.6.6.6.EnVision 37EnVision 37EnVision 37EnVision 370 0 0 0C C C C 孵育孵育孵育孵育30min30min30min30min或室温或室温或室温或室温60min60min60min60min。7.PBS7.PBS7.PBS7.PBS洗涤。洗涤。洗涤。洗涤。8.8.8.8.DAB(0.04%)DAB(0.04%)DAB(0.04%)DAB(0.04%)显色（镜检控制），水洗、复染、封显色（镜检控制），水洗、复染、封显色（镜检控制），水洗、复染、封显色（镜检控制），水洗、复染、封片。片。何杰金氏淋巴瘤何杰金氏淋巴瘤 R-

71、SR-S细胞细胞CD30CD30甲状腺癌甲状腺癌 CD44v6CD44v6甲状腺乳头状癌甲状腺乳头状癌E-cadherinE-cadherin乳腺浸润性导管癌乳腺浸润性导管癌PRPR乙型肝炎乙型肝炎HBsAgHBsAg脑胶质瘤脑胶质瘤MAP 2a&bMAP 2a&b免疫组化染色应注意免疫组化染色应注意n n免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易掌握操作步骤简单也易掌握, ,但要染好免疫组化但要染好免疫组化, ,其中方法的技巧将是每位操作者在实际工其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作不断摸索和探讨的事作不断摸索和探讨的事, ,但最基本的应从

72、以但最基本的应从以下方面加以注意。下方面加以注意。提高免疫组化敏感性的方法提高免疫组化敏感性的方法概述：概述：提高免疫组化敏感性有两种途径，一是增提高免疫组化敏感性有两种途径，一是增提高免疫组化敏感性有两种途径，一是增提高免疫组化敏感性有两种途径，一是增加加加加IHCIHCIHCIHC方法的敏感性，如二步法较三步法的敏感性方法的敏感性，如二步法较三步法的敏感性方法的敏感性，如二步法较三步法的敏感性方法的敏感性，如二步法较三步法的敏感性较为显著提高；另一途径是通过对石蜡切片酶消较为显著提高；另一途径是通过对石蜡切片酶消较为显著提高；另一途径是通过对石蜡切片酶消较为显著提高；另一途径是通过对石蜡切

73、片酶消化和热处理是化和热处理是化和热处理是化和热处理是IHCIHCIHCIHC检测敏感性大为提高。抗原热修检测敏感性大为提高。抗原热修检测敏感性大为提高。抗原热修检测敏感性大为提高。抗原热修复是甲醛固定组织后会使蛋白质的三级结构发生复是甲醛固定组织后会使蛋白质的三级结构发生复是甲醛固定组织后会使蛋白质的三级结构发生复是甲醛固定组织后会使蛋白质的三级结构发生改变，尤其是蛋白质分子苯环结构上的结构位置改变，尤其是蛋白质分子苯环结构上的结构位置改变，尤其是蛋白质分子苯环结构上的结构位置改变，尤其是蛋白质分子苯环结构上的结构位置发生改变，从而使要检测的抗原决定簇位点改变发生改变，从而使要检测的抗原决定

74、簇位点改变发生改变，从而使要检测的抗原决定簇位点改变发生改变，从而使要检测的抗原决定簇位点改变方向，通过高温使抗原决定簇的位点恢复。另外，方向，通过高温使抗原决定簇的位点恢复。另外，方向，通过高温使抗原决定簇的位点恢复。另外，方向，通过高温使抗原决定簇的位点恢复。另外，2/32/32/32/3的商品化的抗体需酶消化以暴露抗原决定簇。的商品化的抗体需酶消化以暴露抗原决定簇。的商品化的抗体需酶消化以暴露抗原决定簇。的商品化的抗体需酶消化以暴露抗原决定簇。抗原修复抗原修复(antigen retrieval(antigen retrieval，AR)AR) 其作用是暴露抗原，增加细胞和组织其作用是暴

75、露抗原，增加细胞和组织的通透性，以便抗原抗体最大限度的结合，的通透性，以便抗原抗体最大限度的结合，增加特异性染色，避免非特异性染色。目增加特异性染色，避免非特异性染色。目前常用的修复方法有以下几种。前常用的修复方法有以下几种。 蛋白酶消化蛋白酶消化 可以去除覆盖抗原决定簇表面可以去除覆盖抗原决定簇表面的杂蛋白，更为重要的是因甲醛固定而引的杂蛋白，更为重要的是因甲醛固定而引起的交联被打开而起暴露抗原决定簇的作起的交联被打开而起暴露抗原决定簇的作用。目前常用的酶有：胰蛋白酶（主要用用。目前常用的酶有：胰蛋白酶（主要用于细胞内抗原的修复）；胃蛋白酶（主要于细胞内抗原的修复）；胃蛋白酶（主要用于细胞间

76、质或基底膜抗原的修复）。用于细胞间质或基底膜抗原的修复）。 热诱导的抗原修复热诱导的抗原修复 对大多数抗原有效，尤对大多数抗原有效，尤其是对核抗原的修复作用更为明显，最常其是对核抗原的修复作用更为明显，最常用的抗原修复液是用的抗原修复液是pH6.0pH6.0的枸橼酸缓冲液和的枸橼酸缓冲液和pH8.0pH8.0的的EDTAEDTA缓冲液，它们的作用原理是通缓冲液，它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。热诱导的抗原过钠离子的螯合而实现的。热诱导的抗原修复包括水浴加热法、微波加热法、高压修复包括水浴加热法、微波加热法、高压加热法。加热法。 0.01% mol/L枸橼酸缓冲液，枸橼酸缓冲液，pH6

77、.0（800-1500 ml）于压力锅中，大火加至沸腾，将）于压力锅中，大火加至沸腾，将脱蜡水化后的切片置于不锈钢或耐高温塑脱蜡水化后的切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，即达到工作温度和工作压力（扣阀至喷汽即达到工作温度和工作压力（扣阀至喷汽以以6 min为最佳），开始计时，为最佳），开始计时，1-2min后，后，压力锅离开热源，压力锅离开热源，1 min后用自来水冲淋锅后用自来水冲淋锅体使之冷却至室温，去阀开盖，取出玻片，体使之冷却至室温，去阀开盖，取出玻片，

78、蒸馏水冲，后用蒸馏水冲，后用PBS冲三次。冲三次。高压加热法高压加热法抗原未修复抗原未修复酶消化的比较酶消化的比较合适的抗体稀释度合适的抗体稀释度 是免疫染色的关键，现市场销售的一是免疫染色的关键，现市场销售的一抗多为即用型，对抗体的滴度无需摸索，抗多为即用型，对抗体的滴度无需摸索，但对浓缩型一抗，则应筛出最佳的滴度。但对浓缩型一抗，则应筛出最佳的滴度。抗体的过高及过低都可影响结果的准确性。抗体的过高及过低都可影响结果的准确性。应达到最大的抗原染色强度和最低的背景应达到最大的抗原染色强度和最低的背景着色。着色。温育时间温育时间 大部分抗体温育时间为大部分抗体温育时间为 30-60min30-6

79、0min，必要时，必要时可可44过夜过夜( (约约18h)18h)。温育的温度常。温育的温度常3737，也可在室温中进行，对抗原抗体反应强的也可在室温中进行，对抗原抗体反应强的以室温为佳。以室温为佳。3737可增强抗原抗体反应；可增强抗原抗体反应；适用于多数抗体染色，但应注意在温箱中适用于多数抗体染色，但应注意在温箱中进行，防止切片干燥而导致失败。进行，防止切片干燥而导致失败。多层染色法多层染色法 对弱的抗原可用间接法对弱的抗原可用间接法 ( (双层双层) )、PAPPAP和和ABCABC法（三层）、四或五层法（三层）、四或五层PAPPAP法或法或ABCABC法，法，或或PAPPAP的的ABC

80、ABC联合染色法等，可以较大程度联合染色法等，可以较大程度的提高敏感性，获得良好结果。的提高敏感性，获得良好结果。 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方

81、法是在用第一抗体前加第二抗体动物之非免疫血清在用第一抗体前加第二抗体动物之非免疫血清在用第一抗体前加第二抗体动物之非免疫血清在用第一抗体前加第二抗体动物之非免疫血清(1:5-1:20) (1:5-1:20) (1:5-1:20) (1:5-1:20) 封闭组织上带电荷基团而除去与第一封闭组织上带电荷基团而除去与第一封闭组织上带电荷基团而除去与第一封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入抗体非特异性结合。必要时可加入抗体非特异性结合。必要时可加入抗体非特异性结合。必要时可加入 2%-5% 2%-5% 2%-5% 2%-5% 牛血清牛血清牛血清牛血清蛋白，可进一步减少非特异性

82、染色。作用时间为蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为 10-20min10-20min10-20min10-20min。 也可用除制备第一抗体以外的其它动也可用除制备第一抗体以外的其它动也可用除制备第一抗体以外的其它动也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清物血清物血清物血清 ( ( ( (非免疫的非免疫的非免疫的非免疫的) ) ) )。有明显溶血的血清不能用，。有明显溶血的血清不能用，。有明显溶血的血清不能用，。有明显溶血的血清不能用，以免产生非特异性染色。以免产生非特异性染色。以免产生非特异性染色。以免

83、产生非特异性染色。减少或消除非特异性染色的方法减少或消除非特异性染色的方法非特异性着色非特异性着色非特异性着色非特异性着色 根据所用的染色方法，可选用适当的复根据所用的染色方法，可选用适当的复染方法。如阳性结果呈红或棕色，则用苏染方法。如阳性结果呈红或棕色，则用苏木素将细胞核染成兰色，以便定位检测。木素将细胞核染成兰色，以便定位检测。也可用也可用1%-2%1%-2%甲基绿复染。甲基绿复染。 复染复染苏木精苏木精 甲基绿甲基绿 其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照，常用的对照方法包

84、括：对照，常用的对照方法包括： 阳性对照；阳性对照； 阴性对照；阴性对照； 阻断试验；阻断试验； 替代对照；替代对照； 空白对照；空白对照； 自身对照；自身对照； 吸收试验。吸收试验。对照对照免疫组化染色对照的设计免疫组化染色对照的设计自身对照自身对照 空白对照空白对照空白对照空白对照阴性阴性阴性阴性对照对照 替代对照替代对照替代对照替代对照 抑制对照抑制对照抑制对照抑制对照 吸收实验对照吸收实验对照吸收实验对照吸收实验对照 阳性对照阳性对照阳性对照阳性对照自身对照：自身对照： 在同一切片上，与检测的目的物对照在同一切片上，与检测的目的物对照比较。如比较。如ActinActin、CD34CD3

85、4在正常组织中的血管在正常组织中的血管壁肌层应为阳性，壁肌层应为阳性，VimentinVimentin可选间质细胞。可选间质细胞。如果应为阳性的组织是阳性，则技术操作如果应为阳性的组织是阳性，则技术操作正确，如为阴性，则表明技术或免疫试剂正确，如为阴性，则表明技术或免疫试剂质量有问题。质量有问题。阳性对照阳性对照用已知抗原阳性的标本与待检标本同时用已知抗原阳性的标本与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳

86、性对照尤为重要。阳性对照尤为重要。阴性对照阴性对照1. 用确证不含已知抗原的标本作对照，呈阴用确证不含已知抗原的标本作对照，呈阴性结果。性结果。2.2.空白对照：用缓冲液替代一抗。空白对照：用缓冲液替代一抗。3.3.替代对照：用非免疫血清替代一抗。替代对照：用非免疫血清替代一抗。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更重当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更重要，用以排除假阳性。要，用以排除假阳性。假阳性：假阳性： 组织成分与染色试剂及抗血清之间的非特异组织成分与染色试剂及抗血清之间的非特异组织成分与染色试剂及抗血清之间的非特异组织成分与染色试剂及抗血清之间的非特异结合称假阳性。如细胞浆内存在的内源

87、性过氧化结合称假阳性。如细胞浆内存在的内源性过氧化结合称假阳性。如细胞浆内存在的内源性过氧化结合称假阳性。如细胞浆内存在的内源性过氧化物酶能够与物酶能够与物酶能够与物酶能够与DAB-HDAB-H2 2OO2 2反应，导致假阳性。因此，反应，导致假阳性。因此，反应，导致假阳性。因此，反应，导致假阳性。因此，最好做内源性过氧化物酶阻断。最好做内源性过氧化物酶阻断。最好做内源性过氧化物酶阻断。最好做内源性过氧化物酶阻断。对免疫细胞化学结果的判断应持科学的对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，假阳

88、性和假阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性结果，除有对照试验结果对新发现的阳性结果，除有对照试验结果外，应进行多次重复实验，要求用几种方外，应进行多次重复实验，要求用几种方法进行验证，如用法进行验证，如用PAPPAP法阳性，可再用法阳性，可再用ABCABC法验证。必须学会判断特异性染色和非特法验证。必须学会判断特异性染色和非特异性染色，对初学者更为重要，否则会得异性染色，对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。出不科学的结论。免疫细胞化学结果的判断免疫细胞化学结果的判断 阳性细胞的染色特征阳性细胞的染色特征免疫细胞化学的呈色深浅可反映抗原存免疫细胞化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可

89、作为定性、定位和定量的依在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。阳性细胞染色分布有三种类型据。阳性细胞染色分布有三种类型 胞浆；胞浆； 细胞核；细胞核； 细胞膜表面。细胞膜表面。 大部分位于胞浆；灶性或弥漫性；由于细胞大部分位于胞浆；灶性或弥漫性；由于细胞内抗原量不同，染色强度也不一；阳性细内抗原量不同，染色强度也不一；阳性细胞定位于单个细胞，与阴性细胞交织分布；胞定位于单个细胞，与阴性细胞交织分布；切片边缘、刀痕处染色强度加深，不能用切片边缘、刀痕处染色强度加深，不能用于判断阳性。于判断阳性。Rb2/P130 有两种方法：一是对检测结果阳性细胞指数有两种方法：一是对检测结果阳性细胞指数有两种

90、方法：一是对检测结果阳性细胞指数有两种方法：一是对检测结果阳性细胞指数来定性。判断方法是以一个视野中的来定性。判断方法是以一个视野中的来定性。判断方法是以一个视野中的来定性。判断方法是以一个视野中的阳性细胞数阳性细胞数阳性细胞数阳性细胞数与总细胞的百分比与总细胞的百分比与总细胞的百分比与总细胞的百分比，再取，再取，再取，再取1010个相同视野算去平均个相同视野算去平均个相同视野算去平均个相同视野算去平均数。另一种方法是以数。另一种方法是以数。另一种方法是以数。另一种方法是以染色阳性强度和阳性检出率染色阳性强度和阳性检出率染色阳性强度和阳性检出率染色阳性强度和阳性检出率相结合相结合相结合相结合而

91、定，一般阳性细胞数在而定，一般阳性细胞数在而定，一般阳性细胞数在而定，一般阳性细胞数在0 025%25%为阴性，为阴性，为阴性，为阴性，252550%50%为阳性为阳性为阳性为阳性+ +，505075%75%为阳性为阳性为阳性为阳性+，75%75%以以以以上为阳性上为阳性上为阳性上为阳性+。第二种方法易出现人为误差。用。第二种方法易出现人为误差。用。第二种方法易出现人为误差。用。第二种方法易出现人为误差。用图像分析系统进行结果检测的定量分析更为准确。图像分析系统进行结果检测的定量分析更为准确。图像分析系统进行结果检测的定量分析更为准确。图像分析系统进行结果检测的定量分析更为准确。 结果统计：实

92、验设计实验设计 根据课题要求，通过查阅文献选出具根据课题要求，通过查阅文献选出具有代表意义的较新的抗体，通过合适的联有代表意义的较新的抗体，通过合适的联系方式确定抗体的出处，购买方式及到货系方式确定抗体的出处，购买方式及到货日期。在每次染色或每一批染色前，都应日期。在每次染色或每一批染色前，都应列出实验计划，做好免疫组化标记记录单，列出实验计划，做好免疫组化标记记录单，拿到的任何一种抗体都应首先进行预实验，拿到的任何一种抗体都应首先进行预实验，以确定正式实验中抗原的修复方式、抗体以确定正式实验中抗原的修复方式、抗体的最佳稀释度及孵育时间等，然后才能进的最佳稀释度及孵育时间等，然后才能进行大批的实验。行大批的实验。