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1、酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法了解其他免疫标记技术一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光免疫荧光（IF）和60年代的放射免疫放射免疫(RIA)(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术（酶免疫技术）。（酶免疫技术）。是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异
2、、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。免疫标记技术（免疫标记技术（immunolabelling technique）免疫标记技术=抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性灵敏性灵敏性特异性特异性特异性特异性免疫标记技术的主要特点：免疫标记技术的主要特点：高度特异性高度特异性、高度灵敏性高度灵敏性免疫技术免疫技术 + + 标记技术标记技术酶酶酶酶荧光素荧光素荧光素荧光素同位素同位素同位素同位素免疫标记技术放射物标记技术酶标记技术免疫荧光技术其他标记技术酶联免
3、疫吸附技术酶免疫组化技术是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。 Ag + AbAg + AbE E AgAb AgAbE E + + 底物底物 呈色反应呈色反应酶免疫技术酶免疫技术(enzyme immunoassay) 是一类常用的酶免疫技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。ELISA
4、法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验ELISA（enzyme linked immunosorbent assay） ELISAELISA的基本原理有三条：的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物
5、仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。常用酶及其底物常用酶及其底物1.1.辣
6、根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)常用底物：常用底物：(1)(1)邻苯二胺邻苯二胺(OPD)(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。反应显橙黄色，应避光，致癌性。(2)(2)四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性性, , 但水溶性差。但水溶性差。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为 450nm。2.2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AP)(AP)常用底物常用底物 对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯(p-NPP)(p-NPP)：产物为黄色。产物为黄色。APAP灵敏性高与灵敏性高与HRPHRP
7、，但不易获得纯品，稳定性较，但不易获得纯品，稳定性较HRPHRP差，且价差，且价高，故应用不如高，故应用不如HRPHRP普及。普及。peroxidase (POD) Colorimetric ELISA Substrates ELISA常用的几种方法 (一)测定抗原的，主要有四种方法 1.竞争法 2.双抗体夹心法 3.改良的双抗体夹心法 4.抑制性测定法。(二)测定抗体方面：所用的方法称为间接法，也 是目前最常用的方法. HBVHBVHBVHBV感染后的血清学指标感染后的血清学指标感染后的血清学指标感染后的血清学指标: : : :HBsAgHBsAg, HBsAb, HBsAbHBeAg, H
8、BeAbHBeAg, HBeAb HBcAb(IgG,IgM)HBcAb(IgG,IgM)乙肝表面抗原，乙肝表面抗原，乙肝表面抗原，乙肝表面抗原，存在于存在于存在于存在于HBVHBVHBVHBV感感感感染者的血清中染者的血清中染者的血清中染者的血清中, , , ,为为为为感染指标感染指标感染指标感染指标之之之之一。一。一。一。三、实验步骤三、实验步骤 乙肝病毒存在三对抗原抗体系统乙肝病毒存在三对抗原抗体系统1.即表面抗原（即表面抗原（HbsAg）和表面抗体（抗）和表面抗体（抗-HBs）、）、2.e抗原（抗原（HBeAg）和）和e抗体（抗抗体（抗-HBe）、）、3.核心抗原（核心抗原（HBcAg
9、）和核心抗体（抗）和核心抗体（抗-HBc） 因核心抗原主要存在于肝细胞中，血清中不能表达，检测困难，因核心抗原主要存在于肝细胞中，血清中不能表达，检测困难，故只能检测二对半而不能检测三对，所以称为二对半。故只能检测二对半而不能检测三对，所以称为二对半。 实验材料1.HBsAg诊断试剂盒2.HBsAg抗原（阳性对照），阴性血清，待检血清微孔条已经包被微孔条已经包被HBsAb1、编号：微孔条按顺序编号。2、加样：分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul， 空白对照。3、加入酶结合物：每孔中加入酶结合物50ul，空白对照孔不加，轻拍混匀。4、温育：贴上胶纸，37温育30分钟。5、洗涤：用洗涤液
10、充分洗涤5次，洗涤完往后扣干（每次保持30-60秒的浸泡时间）。6、显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，封口，37暗置10-15分钟。7、终止：每孔加终止液50ul，轻拍混匀。8、测定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并记录结果，读数在加终止液10分钟内完成。结果判定：结果判定：1、临界值（CO，cutoff）的计算：临界值=阴性对照孔OD均值N2.1。2、阴性对照孔OD (optical density)均值大于0.1时重新实验，小于0.05时以0.05计算。 结果判定：样品OD值S/ CO1者为阳性， 样品OD值S/ CO1者为阴性。四、注意事项四、注意事项 1、所有样品按
11、传染源处理；2、加试剂前应混匀，力求滴加准确；3、加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成；4、洗涤时各孔均需加满，洗涤必须彻底，防止产生假阳性；5.温育的时间要严格控制。五、五、 ELISA的影响因素的影响因素（一）固相载体（二）抗原 （三）试验样品 （四）结合物 (五）洗涤剂与稀释剂 （六）底物 （七）作用时间 （八）结果判断 (九)试验的重复性（精确度） （十）对使用仪器要求 自习自习（一）固相载体（一）固相载体在在ELISAELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能料管。但每批
12、微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定经过实验室鉴定 。（二）抗原（二）抗原 包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就
13、会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。 对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶性抗原均可用于ELISA。 对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。（三）试验样品（三）试验样品血清、血浆或其他体液，均可作为ELISA的试验样品（标本）。但应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固收缩，不宜置冰箱（4）中凝固，否则会使大部分IgM和少量IgG丧失活
14、性。关于人血清在保存过程中抗体的稳定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清最好要新鲜，若要贮藏，必须少量分装保存于低温冰箱，并防止反复冻融。血浆可用肝素毛细管法采血，而血清可用滤纸片法采血。（四）结合物（四）结合物在ELISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合物，此为进行ELISA检测的关键试剂。常规使用ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物，而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。（五）洗涤剂与稀释剂（五）洗涤剂与稀释剂加入牛血清白蛋白（BSA）和吐温20抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用。它们有良好的封阻作用（六）底物（六）底物（1）底
15、物在未被酶催化以前应该是无色的，而经 酶催化后有明显的颜色变化，这样可使结果分辨清楚；（2）所显色泽易干洗脱；（3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定时所产生的有色物质应该是可溶性的；（4）价廉，易得而且无毒。（七）作用时间（七）作用时间(1) 任意确定一个时间，如20分钟或30分钟终止反应，测定被检标本和阳性参考标本的O.D值。这样所得的数据要进行校正，校正可按下列公式： 校正后O.D绝对值=被检标本的O.D值*（1.0/阳性标本的O.D值）(2) 制备好一批酶结合物后预试时间，在反应温度固定时，当阳性参考血清O.D值达到1.0时终止反应，记录这个时间，如30分钟，以后用本批酶结合物测定待检
16、样品时都采用同一时间终止反应，这个办法不需要校正，比较方便。（八）结果判断（八）结果判断 ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反应的深浅作出判断，也可用分光光度计作精确测定。当然,后者更为正确。而肉眼观察更为简便，而且也有一定正确性。 不论用哪种方法判定结果，每次都要有阳性和阴性参考血清作对照，这样可以消除一些外界的影响因素。( (九九) )试验的重复性（精确度）试验的重复性（精确度）记录结果有下列几种方法：1、“+”或“-”：所有超过规定的O.D值（如O.D，0.4）的标本均属阳性，此规定O.D值是根据事先测定大量阴性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以一组阴性标本O.D平均值加2
17、3个标准差作为阳性阈值。 2、直接以O.D值来表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。 3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该标本的滴度。 4、以“比值”表示：求出被检标本的O.D值与一组阴性标本O.D值的比值，例如为阴性标本的2倍或3倍，即为阳性，比值小于2.1而大于1.5为可疑，1.5为阴性。 测定标本O.D值-空白O.D值 2.1 阴性对照O.D值-空白O.D值 如在此测定时以空白校正“O”点。 5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，
18、再测定一个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。以后可根据被检标本的O.D值，从曲线上找出相应的单位数，再乘于血清的稀释倍数，即可得出被检标本的单位数。 （十）对使用仪器要求（十）对使用仪器要求所用仪器如吸管、烧杯试管都要清洁，用于酶结合和底物的吸管和容器一定要分开。试剂要求标准化ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。酶免疫试验（EIA）结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗原定位与结构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免疫扩散及免疫电泳
19、可提高试验的敏感性。在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关 。六六、ELISA的应用的应用( (一一):):检查抗原和半抗原方面检查抗原和半抗原方面 1.内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等，其敏感性与RIA相当 2.在血液学方面可用于检查凝固因子（如第凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等 3.在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），对前者的敏感性已达到与
20、放射免疫试验相当的水平，但对CEA检查的敏感性较低，目前尚不能用于常规诊断 4.在传染病的诊断方面正在日益扩大，其中最满意的是用于检查乙型肝炎表面抗原 5.在免疫化学方面可用于检测白蛋白，免疫球蛋白的各种组份，也可用于检测补体成份，还能用于检测蛇毒。 6.还可用于植物组织浆液中检查植物病毒。此外尚试用于测钩体抗原及血吸虫病的循环抗原等。 (二):检查抗体方面 用ELISA间接法检查抗体，已获得对多种传染病和寄生虫病的血清学诊断，亦开始广泛用于现场流行病学调查。1.在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断，这对人
21、医和兽医都很重要。2.在病原微生物方面已用于检查链球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、假丝酵母菌等的抗体，还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体，可作诊断 3.试用于病毒抗体检查报告的有：流感病毒、腮腺炎病毒、麻诊、风疹、轮状病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、肠道病毒、脑炎病毒、黄热病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等，其敏感性都超过目前常用的检查方法 此外，还可用于鉴定病毒型别，例如疱疹病毒。如能进一步改进方法用于检查特异性IgM，可以作为早期诊断以及了解体内有关抗原的清除情况。4.在免疫性疾病方面有试用作自身疫病
22、抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测各种过敏原的抗体、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等。5.在卫生学方面，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。 七七、ELISA存在的问题存在的问题 ELISA法由于本身所具备的优越性，是一项很有发展前途的血清学诊断方法，而且应用的领域也越来越广泛。但是我们认为ELISA不是万应良方，用它来代替一切，这是不当的。因为ELISA法还有局限性：1、由于ELISA所用的抗原大部分还是混合的可溶性抗原，所以对同一微生物寄生虫或其他物质不同部位的抗原还没有分开。 2、内源性过氧化酶的普遍存在，如人脑组织中，呼吸道分泌物的炎症细胞中及某些病毒的组织培养中均有内源性过氧化物酶的活力，常不易除去，如果用某些方法除去时，则病毒 的抗原性亦受到破坏，对于用ELISA检测不利。3.对ELISA法的非特异性评价的资料尚不够完善，因此，对出现一些非特异性反应的时候，往往不易解释。4.固相载体的质量常不统一，主要是原料及制备工艺还不一致，致使不同批号的固相载体有时本底值较高，有时吸附性能很差，影响试验结果。5.试剂不统一，现在处于“八仙过海，各显神通”，标准还不能统一。
